Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie herzgewebe unter physiologischen Bedingungen für 6 Tage geschnitten und kultiviert werden kann. Dieses Kultursystem könnte als Plattform für die Prüfung der Wirksamkeit neuartiger Herzinsuffizienz-Therapeutika sowie als zuverlässige Spross enderatonie Tests der akuten Kardiotoxizität in einem 3D-Herzmodell verwendet werden.
Abstract
Viele neuartige Medikamente scheitern in klinischen Studien an kardiotoxischen Nebenwirkungen, da die derzeit verfügbaren In-vitro-Assays und In-vivo-Tiermodelle die menschlichen Herzverbindlichkeiten schlecht vorhersagen, was eine milliardenschwere Belastung für die pharmazeutische Industrie darstellt. Daher besteht weltweit ein weltweit unerfüllter medizinischer Bedarf an besseren Ansätzen zur Identifizierung der Kardiotoxizität von Arzneimitteln, bevor kostspielige und zeitaufwändige "First in Man"-Studien durchgeführt werden. Derzeit werden nur unreife Herzzellen (menschliche induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten [hiPSC-CMs]) verwendet, um die therapeutische Effizienz und Arzneimitteltoxizität zu testen, da sie die einzigen menschlichen Herzzellen sind, die über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können. Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität zu testen. Ein einzelner Zelltyp kann jedoch nicht den Phänotyp des komplexen 3D-Herzgewebes replizieren, das aus mehreren Zelltypen besteht. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten an erwachsenen Kardiomyozyten getestet werden muss, die im Vergleich zu unreifen hiPSC-CMs unterschiedliche Eigenschaften und Toxizitätsreaktionen aufweisen. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten multizellulären System, das das menschliche Herzgewebe imitiert und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards widerspiegelt. Kürzlich haben wir durch die Optimierung der Kulturmedienkomponenten und der Kulturbedingungen, um eine kontinuierliche elektrische Stimulation bei 1,2 Hz und die intermittierende Sauerstoffversorgung des Kulturmediums einzubeziehen, ein neues Kultursystem-Setup entwickelt, das die Lebensfähigkeit bewahrt. und Funktionalität von Menschen- und Schweineherzscheiben für 6 Tage in der Kultur. Im aktuellen Protokoll beschreiben wir als Beispiel die Methode zum Schneiden und Kultivieren von Schweineherzen. Das gleiche Protokoll wird verwendet, um Scheiben von Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen zu kultiieren. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt.
Introduction
Drogeninduzierte Kardiotoxizität ist eine Hauptursache für Marktentzug1. Im letzten Jahrzehnt des20. Jahrhunderts wurden acht nicht-kardiovaskuläre Medikamente vom Markt genommen, da sie zu einem plötzlichen Tod aufgrund ventrikulärer Arrhythmienführten 2. Darüber hinaus können mehrere Anti-Krebs-Therapien (während in vielen Fällen wirksam) zu mehreren kardiotoxischen Wirkungen führen, einschließlich Kardiomyopathie und Arrhythmien. Beispielsweise können sowohl traditionelle (z. B. Anthracycline und Strahlung) als auch gezielte (z. B. Trastuzumab) Brustkrebstherapien bei einer Teilmenge von Patienten zu kardiovaskulären Komplikationen führen3. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Kardiologen und Onkologen (über das entstehende Feld der "Kardio-Onkologie") hat dazu beigetragen, dass diese Komplikationen überschaubar sind, um sicherzustellen, dass Patienten effektiv behandelt werden können2. Weniger klar sind die kardiovaskulären Wirkungen neuerer Wirkstoffe, einschließlich Her2- und PI3K-Inhibitoren, insbesondere wenn Therapien in Kombination eingesetzt werden. Daher besteht ein wachsender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien für kardiovaskuläre Toxizitäten im Zusammenhang mit aufkommenden Krebstherapien vor klinischen Studien am Menschen. Die mangelnde Verfügbarkeit von Kultursystemen für menschliches Herzgewebe, das für mehr als 24 h funktionell und strukturell tragfähig ist, ist ein begrenzender Faktor für zuverlässige Kardiotoxizitätstests. Daher ist es dringend notwendig, ein zuverlässiges System zur Kultivierung menschlichen Herzgewebes unter physiologischen Bedingungen für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität zu entwickeln.
Der jüngste Schritt hin zur Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) in Kardiotoxizitätstests hat eine partielle Lösung zur Lösung dieses Problems geliefert; jedoch sind die Unreife Natur der hiPSC-CMs und der Verlust der Gewebeintegrität im Vergleich zur mehrzelligen Natur des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Technologie4. Eine aktuelle Studie hat diese Einschränkung teilweise überwunden, indem herzgewebe von hiPSC-CMs auf Hydrogelen hergestellt und sie im Laufe der Zeit einer allmählichen Zunahme der elektrischen Stimulation ausgesetzt wurden5. Ihre elektromechanischen Eigenschaften erreichten jedoch nicht die Reife, die im erwachsenen menschlichen Myokard beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Herzgewebe strukturell komplizierter, da es aus verschiedenen Zelltypen besteht, darunter Endothelzellen, Neuronen und verschiedene Arten von stromalen Fibroblasten, die mit einer sehr spezifischen Mischung von extrazellulären Matrixproteinen verbunden sind6. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Zellpopulation7,8,9 im erwachsenen Säugetierherz ist ein großes Hindernis bei der Modellierung von Herzgewebe mit einzelnen Zelltypen. Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden, um kultur des intakten Herzgewebes für optimale Studien mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des Herzens zu ermöglichen5.
Das Kultivieren menschlicher Herzscheiben ist ein vielversprechendes Modell für intaktes menschliches Myokard. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten 3D-Multizellularsystem, das dem menschlichen Herzgewebe ähnelt und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards zuverlässig widerspiegeln könnte. Jedoch, seine Verwendung wurde stark durch die kurze Zeit der Lebensfähigkeit in der Kultur begrenzt, die nicht über 24 h mit den robustesten Protokollen bis 2018berichtet 10,11,12. Diese Einschränkung war auf mehrere Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Verwendung von Luft-Flüssig-Schnittstelle, um die Scheiben zu kulturieren, und die Verwendung eines einfachen Kulturmediums, das die hohen energetischen Anforderungen des Herzgewebes nicht unterstützt. Wir haben vor kurzem ein Unterwasserkultursystem entwickelt, das in der Lage ist, kontinuierliche elektrische Stimulation zu bieten und die Kulturmedienkomponenten optimiert, um Herzgewebescheiben lebensfähig für bis zu 6 Tage13zu halten. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, um die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen zu schließen. Im aktuellen Artikel beschreiben wir das Protokoll zum Schneiden und Kultivieren der Herzscheiben am Beispiel eines Schweineherzens. Das gleiche Verfahren wird auf Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen angewendet. Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Technologie auf andere Laboratorien in der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu verbreiten.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren entsprachen den institutionellen Leitlinien der University of Louisville und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung für das Schneiden (ein Tag vor dem Schneiden)
- Vorbereitung des vibrierenden Mikrotomes
- Legen Sie die Keramikklinge in ihren Halter, indem Sie diese Schritte befolgen: Nachdem Sie die Klinge sorgfältig ausgepackt haben, legen Sie die scharfe Kante zuerst in den Schlitz des Klingenwerkzeugs. Passen Sie dann die Klinge in den Halter, indem Sie die beiden Schrauben an den Armen des Halters lösen und schieben Sie die Klinge unter jede Scheibe und schieben Sie sie fest nach hinten gegen die hinteren Anschläge. Ziehen Sie die Schrauben fest, um die Klinge zu befestigen.
HINWEIS: Die Schrauben sollten nicht überzeinert werden. - Kalibrieren Sie das Blatt mit dem Kalibrierprotokoll und den Werkzeugen gemäß dem Herstellerprotokoll.
HINWEIS: Um die Ausrichtung der Klinge mit der Verfahrachse zu erleichtern und die Verformungen der Z-Achse zu minimieren, verwendet das vibrierende Mikrotom ein demontierbares Kalibriergerät. Wenn das Kalibriergerät an das Gerät angeschlossen wird, wird seine Anwesenheit automatisch erkannt, und das vibrierende Mikrotom übernimmt die Kontrolle über die Anpassung der Amplitude- und Frequenzeinstellungen des Blades auf eine Größe, die am besten die Einstellung des Blade-Ausrichtungsfehlers ermöglicht.- Drücken Slice Sie die Slice-Taste, um den Ausrichtungsprozess zu starten, der die Klinge automatisch bewegt, so dass sich die Schneidkante in optimaler Position relativ zum Kalibriergerät befindet, um eine optimale Ausrichtungsauswertung zu ermöglichen. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Klinge mit dem mitgelieferten Schraubendreher zu justieren, um sicherzustellen, dass die Z-Ausrichtung innerhalb von 1 m liegt.
- Autoclave das innen bad und alle Metallteile des vibrierenden Mikrotome.
- Legen Sie die Keramikklinge in ihren Halter, indem Sie diese Schritte befolgen: Nachdem Sie die Klinge sorgfältig ausgepackt haben, legen Sie die scharfe Kante zuerst in den Schlitz des Klingenwerkzeugs. Passen Sie dann die Klinge in den Halter, indem Sie die beiden Schrauben an den Armen des Halters lösen und schieben Sie die Klinge unter jede Scheibe und schieben Sie sie fest nach hinten gegen die hinteren Anschläge. Ziehen Sie die Schrauben fest, um die Klinge zu befestigen.
- Autoklavieren Sie die großen Metallschalen (zum Sammeln der Scheiben und Einweichen der elektrischen Stimulationsplattenabdeckungen), alle Glasbehälter, normale Rechteckklingen, Zangen, Scheren, Drucker-Zahnriemen (in 6 mm breite Stücke schneiden), Metallscheiben und 5 L doppelt destilliertes Wasser (ddH2O).
- Sterilisieren Sie ein 1 L Glas, ein 500 ml Glas und eine Kunststoffschale für das Herz in situ und in vitro Perfusion mit der kardiopesdiverlösungslösung.
- Bereiten Sie 2 L der Slicing Tyrodes Lösung in einem 2 L Becher vor.
- Für 1 L der Slicing Tyrode Lösung 3 g/L 2,3-Butandionmonoxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M Lösung), bis 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Filtern Sie dann die Lösung mit einem Vakuumfilter-/Speichersystem mit 1.000 ml, 0,22 m und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
- Bereiten Sie 4 L der kardioplegischen Lösung vor.
- Für 1 L der kardioplegischen Lösung 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M Lösung), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL Heparin, bis zu 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Filtern Sie dann die Lösung mit einem Vakuumfilter-/Speichersystem mit 1.000 ml, 0,22 m und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
HINWEIS: Fügen Sie 1.000 U/L Heparin in Kardioplegie-Lösung am Tag des Schneidens hinzu (siehe Schritt 2.1).
- Für 1 L der kardioplegischen Lösung 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M Lösung), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL Heparin, bis zu 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Filtern Sie dann die Lösung mit einem Vakuumfilter-/Speichersystem mit 1.000 ml, 0,22 m und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
- 500 ml Kulturmedium in der Originalflasche in einem Biosicherheitsschrank frisch zubereiten: Medium 199, 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS)-Ergänzung, 10% fetales Rinderserum (FBS), 5 ng/ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic und 2x antimykotisch mischen. Filter sterilisieren durch das 0,22 m, Vakuumfilter/Speichersystem und lagern bei 4 °C über Nacht.
HINWEIS: PH nicht pH-Wert einstellen, VEGF und FGF vor Gebrauch frisch hinzufügen. - Bereiten Sie 4% Agar-Gel-Platten vor.
- Fügen Sie 200 ml sterilisierte ddH2O in einem 500 ml sterilisierten Kolben hinzu. 8 g Agarose wiegen und sanft in den Kolben gießen. 2 min in der Mikrowelle kochen, dann 5 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- 25 ml in je 100 mm Petrischale in einen Biosicherheitsschrank geben (6 Gerichte zubereiten) und 1 h erstarren. Dann die Platten mit Paraffinfolie versiegeln, mit sauberer Verpackung umwickeln und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 4 L 70% Ethanol vor, indem Sie das 200-prozentige absolute Ethanol in autoklavierten ddH2O verdünnen.
- 2x Antimykotik in sterilisiertem ddH2O vorbereiten: 980 ml sterilisiertes ddH2O mit 20 ml Antimykotik um 20 ml unter dem Biosicherheitsschrank mischen.
2. Schweineherz-Perfusion
- Fügen Sie 1 ml 1.000 U/ml Heparin zu jedem 1 L kardioplegischer Lösung hinzu. Halten Sie die Lösung auf Eis.
HINWEIS: Mindestens 3 L werden für die Durchblutung und Erhaltung des Herzens während des Transfers in den Gewebekulturraum benötigt. - Nehmen Sie folgende Gegenstände mit in den Schweine-Opastube: ein großer Eiskübel voller Eis, ein sterilisiertes Metalltablett (auf Eiskübel für Herzperfusion halten), ein sterilisiertes 500 ml Glas, ein 1 L Glas (um das Herz in Kardioplegielösung zurück in den Gewebekulturraum zu übertragen , auf Eis) und eine sterilisierte Plastikschale voller Eis (um kardioplegische Lösung auf Eis zu halten).
- Bereiten Sie ein in-situ-Herzperfusionssystem vor, das einen 3-Wege-Stopphahn, eine 60 ml Spritze, einen 18 G-Schmetterlingsnadelkatheter und Verlängerungsschläuche zum kardioplegischen Lösungsreservoir enthält.
- Anästhetisieren Sie das Yorkshire-Männchenschwein (2 x 3 Monate alt, 20 bis 25 kg) zuerst mit einer intramuskulären Injektion eines Ketamin-Cocktails (20 mg/kg)/Xylazin (2 mg/kg). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch den Verlust der Kieferspannung. Dann das Schwein in den Operationssaal bringen, intubieren und mechanisch belüften die Lunge wie zuvor beschrieben14.
- Anästhesie pflegen mit (1,5 bis 2%) Isofluran.
- Legen Sie das Tier auf die rechte Seitenposition und rasieren Sie das Fell aus dem Brustbereich. Reinigen Sie die Haut mit Alkoholpeeling, dann sterilisieren Sie die chirurgische Stelle mit 10% (w /v) Povidon-Jod-Lösung.
- Öffnen Sie die Brust durch linken Thorakotomie-Inzision mit einem Skalpell am4. interkostalen Raum, und verwenden Sie einen Brust-Retraktor zwischen den Rippen, um die Brust offen zu halten und das Herz auszusetzen.
HINWEIS: Verwenden Sie alle sterilisierten Instrumente für dieses Verfahren. - Setzen Sie den Schmetterlingsnadelkatheter in das linke Atrium ein und fixieren Sie die Nadel mit einem Ringschnurverschluss. Nach intravenöser Injektion einer Bolusdosis von Heparin (100 U/kg) beginnen Sie, das Herz in situ mit 500 ml eiskalter kardioplegischer Lösung (zur Verlangsamung der Herzfrequenz) über den linken Vorhofkatheter zu durchdringen.
- Das Schwein mit 5% Isofluran tief anästhesieren. Schnell das Herz mit einer chirurgischen Schere aus der Brust herausnehmen. Die Aorta mit einer Aortenkanüle anschnallen und das Herz in vitro mit weiteren 1 L eiskalter kardionlegischer Lösung (100 ml/min) durchdringen, um Vaskulaturblut auszuspülen.
- Nach der Herzdurchblutung das Herz in einem 1 L Glas mit eiskalter Kardioplegielösung gefüllt und während des Transfers in den Gewebekulturraum auf Eis halten.
3. Schwein Herz Gewebe Schneiden
- Richten Sie das Gewebebad auf dem Vibratom ein, fügen Sie Eis in die Kühljacke des Gewebebades ein, und fügen Sie dann Tyrodes Lösung in das Gewebebad ein. Richten Sie 1 L Kunststoffglas ein, um die Entsorgung von geschmolzenem Eis aus der Gewebebadekühljacke zu sammeln.
- Übertragen Sie das Schweineherz unter dem Biosicherheitsschrank in ein Tablett mit 1 L frischer, kardionlegischer Lösung.
- Sezieren Sie das Herz, um den linken Ventrikel mit versenkbaren sterilen Skalpellen zu isolieren. Schneiden Sie dann die linke Herzkammer mit Rasierklingen in Blöcke von je 1 x 2 cm3. Verwenden Sie ein Stück zum Schneiden und halten Sie die restlichen Teile in einem 50 ml Rohr in kalt Tyrodes Lösung auf Eis zum Schneiden später, falls erforderlich.
HINWEIS: Massieren Sie das Gewebe vor dem Schneiden mit den Händen, vor allem, wenn dies der zweite Block ist. Massieren hilft, die richtige Muskelfaserkonfiguration wiederherzustellen und verhindert steife Innerhalb des Herzblocks. - Fügen Sie 1-2 Tropfen Gewebekleber(Materialtabelle) in den Metallprobenhalter und kleben Sie ein Stück des 4% Agar-Blocks mit einer Oberfläche von ca. 1 cm2.
- Fügen Sie 1 bis 2 Tropfen Gewebekleber auf den Agar.
- Stecken Sie den Herzblock mit der Herz-Epikardie-Seite nach unten auf den Gewebekleber und stellen Sie sicher, dass er so flach wie möglich ist. Dann übertragen Sie den Gewebehalter mit dem Herzblock in seine Position im Schnittbad des Vibratome.
- Befestigen Sie das Sauerstoffrohr am Schneidbad und das mit Tyrodes Lösung gefüllte Metalltablett zum Sammeln der Scheiben (sauerstoffhaltiges Tyrodes Bad). Fügen Sie dann 40 m Zellsiebe in das Metallfach, um die Scheiben nach dem Schneiden zu sammeln.
- Anpassen der Schneidposition
- Passen Sie mit der Vibratom-Bediensoftware und dem Armaturenbrett die Höhe des Blades/der Probe an. Wählen Sie die Höhentaste aus und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Höhe anzupassen. Im Idealfall haben Sie die Klinge in der Nähe der Oberseite des Gewebes, aber unter den Papillarmuskeln und stellen Sie sicher, dass flüssigkeit das Gewebe und die Klinge vor dem Schneiden bedeckt.
- Passen Sie an, wo mit dem Schneiden des Gewebes begonnen werden soll, indem Sie die Vorschubtaste auswählen. Drücken Sie die Scheibentaste und erhöhen Sie die Geschwindigkeit mit dem Knopf, um die Klinge in Richtung der Kante des Gewebes zu bewegen. Drücken Sie dann erneut die Scheibe, um anzuhalten, und drücken Sie die Vortaste, um den Vorgang zu deaktivieren.
- Passen Sie die Schnittparameter an: Vorgeschwindigkeit = 0,03 mm/s, Vibrationsfrequenz = 80 Hz und horizontale Schwingungsamplitude = 2 mm. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden, indem Sie die Slice-Schaltfläche auswählen.
- Lassen Sie das Vibratome in Scheiben schneiden, bis es das Ende des Gewebes erreicht, aber bevor es das hintere Ende des Probenhalters trifft. Drücken Sie an dieser Stelle erneut die Scheibe, um anzuhalten. Drücken Return Sie die Return-Taste, um zur Startposition zurückzukehren.
- Wählen Sie die automatische Wiederholung (zweimal darauf klicken), sodass das vibrierende Mikrotome den Schneidvorgang bis zu 99 Mal automatisch wiederholen kann.
- Sammeln von Slices
- Warten Sie, bis die Scheiben in voller Länge sind und gut erscheinen (nachdem Sie die Papillenmuskelschichten hinter sich lassen), und beginnen Sie dann, die Scheiben zu sammeln.
- Sammeln Sie die Scheiben mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff, die mit der kalten Tyrodes-Lösung gefüllt ist, um das Gewebe vorsichtig aus dem Bad zu greifen. Verwenden Sie bei Bedarf Zangen und Federscheren, um die Scheibe vom Herzblock zu trennen, wenn das Gewebe noch befestigt ist.
- Übertragen Sie die Scheibe auf ein Zellsieb im sauerstoffhaltigen Tyrodesbad (siehe Schritt 3.7) und verwenden Sie die Flüssigkeit in der Kunststoff-Pasteur-Pipette, um das Gewebe flach auf einem der Zellsiebe liegen zu lassen, und fügen Sie dann eine Metallscheibe auf der Oberseite hinzu, um das Gewebe zu halten.
HINWEIS: Die Scheiben müssen vor der Verarbeitung mindestens für 1 h in der Tyrodeslösung inkubiert werden (dies ist für das BDM, um das Gewebe zu entspannen).
4. Culturing Heart Slices
-
Vorbereiten der Slices für die Kultur
- Schneiden Sie die Scheibe von den Rändern, um unebene Kanten zu vermeiden. Dann kleben Sie es von beiden Enden auf sterilisierte Polyurethan 6 mm breiten Drucker Zahnriemen mit Metalldrähten mit Gewebekleber eingebettet.
- Übertragen Sie die unterstützten Herzscheiben auf 6 Brunnenplatten, die jeweils 6 ml Kulturmedium enthalten.
- Legen Sie die Stimulationsplattenabdeckung (Materialtabelle) auf die Oberseite der 6 Brunnenplatte und verbinden Sie die Abdeckung mit dem elektrischen Stimulator der Zellkultur (Materialtabelle). Stellen Sie den Stimulator ein, um die Herzscheiben bei 10 V, 1,2 Hz kontinuierlich ständig zu stimulieren.
HINWEIS: Nach dem Einstecken der Stimulation beginnen die Herzscheiben zu schlagen, und diese Bewegung wird visuell offensichtlich sein. - Die Platten auf einen Inkubator übertragen und bei 37 °C mit befeuchteter Luft und 5%CO2lagern.
- Ändern Sie kulturmedium 3x pro Tag und fügen Sie 6 ml Kulturmedium pro Brunnen während jeder Medienänderung hinzu.
HINWEIS: Kulturmedium wird vor jedem Medienwechsel 5 min sauerstoffhaltiger Sauerstoff versorgt. Medium muss mindestens 1x pro Tag gewechselt werden; dies ist am Wochenende in Ordnung, wenn nötig. Zwei Tage mit nur 1 Medienwechsel pro Tag ist das Maximum, das getestet wird. -
Ändern Sie die Stimulationsplattenabdeckung jeden Tag, um die Freisetzung toxischer Graphitpartikel im Kulturmedium zu verhindern (in der Regel während des Medienwechsels am Mittag).
- Entfernen Sie die Stimulationsplattenabdeckung aus der Kulturschale und setzen Sie den weißen Schaumstoffstecker ein, an dem die Abdeckung mit dem Kabel für den elektrischen Stimulator der Zellkultur verbunden ist, um Wasserschäden am Stromkreis zu verhindern.
- Legen Sie die Plattenabdeckung in ein Bad aus autoklaviertem Wasser mit 2x Antimykotika. Halten Sie es in diesem Bad (d.h. Spülbad) über Nacht.
- Am nächsten Tag die Plattenabdeckung in ein 70% Ethanolbad für 5-15 min bewegen, um sich zu dekontaminieren. Schütteln Sie vor dem Badwechsel so viel Flüssigkeit vom Gerät ab.
- Dann die Plattenabdeckung in das dritte und letzte Bad (d.h. sauberes Bad) übertragen, das aus autoklaviertem Wasser und 2x antibakteriell-antimykotisch besteht, um alle verbleibenden Ethanolspuren zu spülen.
- Nach dem Spülen der Plattenabdeckung im sauberen Bad, verwenden Sie ein sauberes fusselfreies Tuch (mit Ethanol besprüht), um Restwasser auf den Kunststoffteilen auszutrocknen, dann entfernen Sie das weiße Schaumstück und legen Sie den Plattendeckel vorsichtig wieder auf die Kulturplatte.
HINWEIS: Berühren Sie nicht die schwarzen Graphitelektroden, die in den Brunnen gelangen, da das Gerät nicht mehr steril ist. - Mit sterilen Zangen, stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der Mitte des Brunnens ist, so dass die Plattenabdeckung das Gewebe nicht berührt. Stellen Sie sicher, dass die gekrümmte Seite der Plattenabdeckung mit der abgewinkelten Seite der Platte übereinstimmt und dass sich die quadratischen Ecken anrichten.
HINWEIS: Um die Kontamination der Stimulationsplattenabdeckungen zu minimieren, halten Sie sie nach Abschluss des Experiments in sauberen und leeren 6 Brunnenplatten auf.
- Führen Sie einen MTT-Assay, Kalziummessungen und kontraktile Funktionsbeurteilungen an frischen Schweineherzscheiben (Tag 0) und nach 6 Tagen in Kultur nach Ou et al.13durch.
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Representative Results
Mit einem handelsüblichen elektrischen Zellkultur-Stimulator, der acht 6 Wellplatten gleichzeitig aufnehmen kann, emulierten wir das erwachsene Herzmilieu, indem wir elektrische Stimulation bei der physiologischen Frequenz (1,2 Hz) induzieren, und für die grundlegenden Mediumkomponenten abgeschirmt werden, um die Dauer funktioneller Schweineherzscheiben in Kultur13zu verlängern. Da Schweine- und Menschliche Herzen in Größe und Anatomie15ähnlich sind, haben wir ein biomimetisches Herzscheibenkultursystem mit Schweineherzen entwickelt und anschließend in menschlichen Herzscheiben validiert. Hier haben wir das Protokoll für Schweineherzscheiben detailliert, das das gleiche Verfahren für menschliches Herzschneiden und Kultivieren ist. Die neue biomimetische Kultur-Setup hier beschrieben, hielt die Lebensfähigkeit der Schweineherzscheiben für 6 Tage, wie durch MTT-Assay bewertet (Abbildung 1A). Wir bestätigten die Funktionsfähigkeit dieser Scheiben über 6 Tage, indem wir ihre Kalziumhomöostase und kontraktile Kraft bewerteten. In den ersten 6 Tagen gibt es keine spontanen Kalziumtransienten in Kardiomyozyten, und die Kardiomyozyten reagierten auf externe elektrische Stimulation sowie adrenergetische Stimulation ähnlich wie frische Herzscheiben (Abbildung 1B). Darüber hinaus werden die kontraktile Kraft und die Reaktionen auf Isoproterenol in kultivierten Herzscheiben für bis zu 6 Tage aufrechterhalten, ähnlich wie bei frischen Herzscheiben (Abbildung 1C,D).
Abbildung 1: Validierung der Lebensfähigkeit und Funktionalität der Schweineherzscheibenkultur. (A) Quantifizierung der Lebensfähigkeit von Herzscheiben im Laufe der Zeit mit dem MTT-Assay in einem stimulierten oder unstimulierten Kultursystem in optimiertem Medium (n = 5 Schweineherzen in dreifacher Ausfertigung, SEM wird als Fehlerbalken dargestellt; zweiseitiger ANOVA-Test wurde durchgeführt, um zwischen Gruppen zu vergleichen, *p < 0,05). (B) Repräsentative Kalziumsignalspur aus einer frischen Herzscheibe (Tag 0) und nach 6 Tagen in Kultur (Tag 6) mit und ohne 1 M Isoproterenol (Iso) Stimulation. Transienten wurden nach dem Laden der Herzscheiben mit Fluo-4 Calciumfarbstoff und mit 1 Hz/20 V elektrischer Stimulation zum Zeitpunkt der Aufnahme aufgezeichnet. Die Quantifizierung der Calciumsignalamplitude mit und ohne Stimulation mit Isoproterenol zeigt ein ähnliches Muster von Calciumtransienten an Tag 0 und Tag 6 in der Kultur (n = 4 Schweineherzen, 10 bis 15 Zellen, die jeweils analysiert werden, wird SEM als Fehlerbalken dargestellt; ein zweiseitiger ANOVA-Test wurde durchgeführt, um zwischen Gruppen zu vergleichen, *p < 0,05 vergleicht die Baseline mit der Iso-Stimulation zum gleichen Zeitpunkt, p-WertD0 vs. D6 = 0,95 und p-WertD0 Iso vs D6 Iso = 0,93). (C) Einrichtung der vertraglichen Kraftbewertung (linkes Panel); die Herzscheibe (HS) wird zwischen einem Kraftwandler (FT) und einem stabilen Pfosten (P) zwischen zwei elektrischen Elektroden (EE) zur elektrischen Stimulation aufgehängt. Bei der Stimulation werden die Slice-Kontrakte und die Kontraktionen mit der dafür vorgesehenen Software (rechtes Panel) aufgezeichnet. (D) Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der kontraktilen Kraft in Gegenwart oder Abwesenheit von Isoproterenol (Iso), das durch frische Schweineherzscheiben (Tag 0) und nach 6 Tagen in biomimetischer Kultur erzeugt wird (n = 4 Schweineherzen in Dreifacher Umgebung; SEM wird als Fehlerbalken dargestellt; zweiseitiger ANOVA-Test wurde durchgeführt, um zwischen Gruppen zu vergleichen, *p < 0,05 Vergleich baseline mit Iso Stimulation zur gleichen Zeit, Zuckkraft: p-WertD0 vs D6 = 0,96, p-WertD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; Zeit bis 50% Entspannung: p-Wert D0 vs D6 = 0,47, p-WertD0 Iso vs D6 Iso = 0,43). Diese Zahl wurde von Ou et al.13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zustand | Fischer et al.16 | Ou et al.13 |
| Spezies | Menschlichen | Schwein und Mensch |
| Krankheit | Failing Hearts | Normale gesunde Herzen |
| Erhaltung | Konserviertes Gewebe | Frisches Gewebe |
| Scheibendicke | 300 m | 300 m |
| Mittlere Sauerstoffversorgung | Nein | Intermittant Sauerstoffversorgung |
| Kulturmedium | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitation | Ja | Nein |
| Pacing-Rate | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Dauer der Kultur | 4 Monate mit Kompromiss | 6 Tage ohne Kompromisse |
| Cuture Temperatur | 37 | 37 |
| Mechanische Beladung | auxotonische Belastung | keine Beladung |
| Getestete Zeitpunkte ohne Veränderung der Genexpression im Vergleich zu frischer Herzscheibe | N/A | 2 und 6 Tage |
| Erster getesteter Zeitpunkt zur Darstellung einer Veränderung der Genexpression | Tag 8 | Tag 10 |
Tabelle 1: Vergleich der in Fischer et16 und Ou et al.13verwendeten Schnitt- und Kultivierungsbedingungen .
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Discussion
Hier beschreiben wir das detaillierte Videoprotokoll für unsere kürzlich veröffentlichte Methode für vereinfachten Mittleren Durchsatz (Prozesse bis zu 48 Slices/Gerät), die die Kultur von Schweineherzscheiben für einen Zeitraum ermöglicht, der ausreichend lang ist, um die akute Kardiotoxizität zu testen13. Die vorgeschlagenen Bedingungen imitieren die Umgebung des Herzens, einschließlich der Häufigkeit der elektrischen Stimulation, der Verfügbarkeit von Nährstoffen und der intermittierenden Sauerstoffversorgung. Wir führen die verlängerte Lebensfähigkeit von Herzscheiben in unserer biomimetischen stimulierten Kultur auf unseren Fokus auf die Wiederherstellung der physiologischen Bedingungen des intakten Herzens zurück. Dieses Konzept wird durch unsere Daten gestützt, die zeigen, dass elektrische Stimulation allein, ohne die Bereitstellung von essentiellen Nährstoffen, nicht ausreicht, um die Lebensfähigkeit der Herzscheibe zu erhalten13. Daher sind die neuen Komponenten des Kulturmediums der Haupttreiber für die Verlängerung der Lebensfähigkeit und Funktionalität von Herzscheiben in der Kultur. Wir fanden heraus, dass es wichtig ist, FBS in das Medium aufzunehmen, um die Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten, was wahrscheinlich auf die Notwendigkeit einer Vielzahl von Fettsäuren, Spurenelementen, Enzymen, Proteinen, Makromolekülen, chemischen Komponenten und Hormonen zurückzuführen ist, die normalerweise im Serum vorhanden sind und in vivo17an Herzgewebe geliefert werden. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Zugabe von FGF und VEGF zum Kulturmedium erforderlich ist, um die Gewebelebensfähigkeit zu verbessern. FGF und VEGF sind bekannte angiogene Faktoren, die für die Erhaltung kultivierter Endothelzellen18unerlässlich sind. Daher ist es wahrscheinlich, dass FGF und VEGF benötigt werden, um die Endothelzellen und Bindegewebe in der Kultur zu erhalten, um die Gewebelebensfähigkeit zu unterstützen. Unsere Arbeit ist die erste, die das vereinfachte Kulturmedium, das zuvor für die Kultivierung von Herzschnitten berichtet wurde, modifizieren und eröffnet die Möglichkeit, die Medienkomponenten in nachfolgenden Studien weiter zu optimieren.
Zeitnah mit unserer neuen Methode gab es drei weitere Studien, die die Bedeutung einer kontinuierlichen elektromechanischen Stimulation bei der Pflege von Kulturscheiben in biotechnischen Systemen16,19,20gezeigt haben. In diesen Studien wurde jedoch das basale M199/ITS-Medium verwendet, das nicht ausreicht, um den Stoffwechselbedarf von Herzscheiben aufrechtzuerhalten. Dies führte zu mehreren Kompromissen in der Scheibe Kontraktilität und Kalzium Homöostase früh während der Kultur16,19,20. Qiao et al.19 entwickelten einen hochentwickelten biotechnischen Chip, der die elektrophysiologischen Eigenschaften der Herzscheiben für 4 Tage erhalten kann, aber keine Bewertung der kontraktilen Funktion zur Verfügung gestellt wurde. Watson et al.20 haben ein Kultursystem mit niedrigem Durchsatz (Prozesse bis zu 4 Scheiben/Gerät) bioentwickelt, um die Bedeutung der diastolischen Sarkomelänge für die Aufrechterhaltung der Herzmuskeleigenschaften für 24 h zu demonstrieren. Schließlich haben Fischer et al.16 gezeigt, dass versagende menschliche Herzscheiben in vitro für bis zu 4 Monate gehalten werden können, wenn sie unter 0,2 Hz Stimulation, auxotonische Belastung und Medienunruhe in einem Bioengineering-Gerät kultiviert werden. Diese Bedingungen führten jedoch zu einer Vielzahl von Veränderungen in den Herzscheiben, wie sie in ihren RNAseq-Daten widergespiegelt wurden, die bereits beim ersten Bewertungszeitpunkt (Tag 8)16eine über 10-fache Regulation der Herzgenexpression zeigten. In unserem optimierten Kultursystem wurden jedoch nur 2 bzw. 5 Transkripte nach 2 bzw. 6 Tagen in der Kultur signifikant differenziert im Vergleich zu frischem Herzgewebe ausgedrückt. Nach 10 Tagen in der Kultur gab es jedoch signifikante Veränderungen in der Ausprägeweise von über 500 Transkripten. Die herunterregulierten Gene nach 10 Tagen in der Kultur waren meist mit Herzmuskel verwandt, während die hochregulierten Gene mit Fibroblasten, extrazellulärer Matrix und Entzündung13zusammenhängen. Tabelle 1 enthält einen vollständigen Vergleich der Schnitt- und Kulturprotokolle zwischen Fischer et al.16 und Ou et al.13. Daher emuliert unser biomimetisches stimuliertes Kultursystem die kontrollierbaren Bedingungen, die das Herz vor Ort erfahrbar ist, und sollte daher eine zuverlässige Auslesung der funktionellen und strukturellen Ergebnisse der medikamentösen Behandlung im Hinblick auf akute Kardiotoxizität oder Wirksamkeit im Vergleich zu kompromittierten Kultursystemen bieten.
Eine der größten Einschränkungen dieses Kultursystems ist, dass unser Kultursystem zwar mehrere physiologische Bedingungen nachahmen kann, aber keine Veränderungen der mechanischen Belastung und Scherspannung während des kardialen Kontraktilenzyklus nachahmen kann. Eine weitere Optimierung der physiologischen und metabolischen Faktoren könnte dazu beitragen, die Lebensfähigkeit und Funktion von Herzscheiben zu verlängern. Zusätzlich bemerkten wir eine frühe Anpassung, die zu einer Verringerung der oxidativen Phosphorylierung führt, die zu einer Verschlechterung der Lebensfähigkeit der Herzscheibe führen könnte13. Leider konnten wir bisher keine optimale Methode zur Aufrechterhaltung der oxidativen Phosphorylierung finden. Es ist wahrscheinlich, dass die Verbesserung des Fettsäurestoffwechsels in Herzscheiben nicht so einfach ist wie das Hinzufügen von Fettsäuren zum Wachstumsmedium, und wird weitere Optimierung erfordern, die in zukünftigen Studien behandelt werden könnte. Eine allgemeine Schwäche dieses Ansatzes ist außerdem die fehlende Messung von Aktionspotentialen an einzelnen Kardiomyozyten innerhalb der Herzscheibe, die für den Nachweis einer Störung des Elektrokardiogramms und der ventrikulären Arrhythmie unerlässlich ist. Daher ist es notwendig, Protokolle zu optimieren, um einzelne Kardiomyozyten aus den Herzscheiben nach der Behandlung mit Kardiotoxinen zu isolieren, die störungen im Elektrokardiogramm induzieren und ihre Wirkung auf das Wirkungspotenzial auf die isolierten Kardiomyozyten bewerten.
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Disclosures
TMAM hält Beteiligung an Tenaya Therapeutics. Die anderen Autoren berichten von keinen Konflikten.
Acknowledgments
TMAM wird durch den NIH-Zuschuss P30GM127607 und den Zuschuss der American Heart Association 16SDG29950012 unterstützt. RB wird von P01HL78825 und UM1HL113530 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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