Summary
यह प्रोटोकॉल 6 दिनों के लिए शारीरिक परिस्थितियों के तहत दिल के ऊतकों को कैसे स्लाइस और संस्कृति का वर्णन करता है। इस संस्कृति प्रणाली का उपयोग उपन्यास हृदय विफलता चिकित्सीय की प्रभावकारिता के साथ-साथ 3 डी हृदय मॉडल में तीव्र कार्डियोटॉक्सिसिटी के विश्वसनीय परीक्षण के परीक्षण के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
कई उपन्यास दवाओं नैदानिक अध्ययन में कार्डियोटॉक्सिक साइड इफेक्ट के कारण विफल के रूप में वर्तमान में विट्रो assays में उपलब्ध है और वीवो पशु मॉडल में खराब मानव हृदय देनदारियों की भविष्यवाणी, दवा उद्योग पर एक बहु अरब डॉलर का बोझ प्रस्तुत । इसलिए, महंगा और समय लेने वाले ' आदमी में पहले ' परीक्षणों से पहले दवा कार्डियोटॉक्सिसिटी की पहचान करने के लिए बेहतर दृष्टिकोण के लिए दुनिया भर में अपूरित चिकित्सा की जरूरत है । वर्तमान में, केवल अपरिपक्व हृदय कोशिकाओं (मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स [hiPSC-सीएम]) चिकित्सकीय दक्षता और दवा विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि वे केवल मानव हृदय कोशिकाओं है कि लंबे समय के लिए संस्कारी किया जा सकता है दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, एक भी सेल प्रकार जटिल 3डी हृदय ऊतक के फेनोटाइप को दोहराने नहीं दे सकता है जो कई कोशिका प्रकारों से बनता है। महत्वपूर्ण बात, दवाओं के प्रभाव को वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स पर परीक्षण करने की आवश्यकता है, जिनमें अपरिपक्व hiPSC-सीएमएस की तुलना में विभिन्न विशेषताएं और विषाक्तता प्रतिक्रियाएं हैं । मानव दिल स्लाइस की खेती बरकरार मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल है । यह तकनीक एक पूर्ण बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुंच प्रदान करती है जो मानव हृदय ऊतक की नकल करती है और मानव मायोकार्डियम की शारीरिक या रोग की स्थितियों को दर्शाती है। हाल ही में, संस्कृति मीडिया घटकों के अनुकूलन और संस्कृति की स्थिति के माध्यम से १.२ हर्ट्ज पर निरंतर विद्युत उत्तेजना और संस्कृति माध्यम के आंतरायिक ऑक्सीजन शामिल करने के लिए, हम एक नई संस्कृति प्रणाली सेटअप है कि व्यवहार्यता को बरकरार रखता है विकसित और संस्कृति में 6 दिनों के लिए मानव और सुअर दिल स्लाइस की कार्यक्षमता। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण के रूप में सुअर दिल को टुकड़ा करने और सफ़ाई करने के लिए विधि का ब्यौरा दे रहे हैं। एक ही प्रोटोकॉल मानव, कुत्ते, भेड़, या बिल्ली दिल से स्लाइस संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है। इस संस्कृति प्रणाली में तीव्र कार्डियोटॉक्सिकिसिटी परीक्षण के लिए सीटू मॉडल में एक शक्तिशाली भविष्य कहनेवाला मानव बनने की क्षमता है जो प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच के अंतर को बंद कर देता है।
Introduction
दवा प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी बाजार वापसी का एक प्रमुख कारण है1। 20वीं शताब्दी के अंतिम दशक में, आठ गैर-हृदय दवाओं को बाजार से वापस ले लिया गया क्योंकि वे वेंट्रिकुलर अतालता2के कारण अचानक मृत्यु हो गई। इसके अलावा, कई कैंसर विरोधी उपचार (जबकि कई मामलों में प्रभावी) कार्डियोमायोपैथी और अतालता सहित कई कार्डियोटॉक्सिक प्रभाव का कारण बन सकते हैं। उदाहरण के लिए, पारंपरिक (उदाहरण के लिए, एंथ्रसाइक्लिन और विकिरण) और लक्षित (जैसे, ट्रैस्टुमुमेब) स्तन कैंसर उपचार ों के परिणामस्वरूप रोगियों के सबसेट में हृदय संबंधी जटिलताएं हो सकती हैं3। हृदय रोग विशेषज्ञों और ऑन्कोलॉजिस्ट के बीच एक घनिष्ठ सहयोग (कार्डियो-ऑन्कोलॉजी" के उभरते क्षेत्र के माध्यम से) ने इन जटिलताओं को प्रबंधनीय बनाने में मदद की है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि रोगियों का प्रभावी ढंग से इलाज किया जा सकताहै। कम स्पष्ट Her2 और PI3K अवरोधकों सहित नए एजेंटों के हृदय प्रभाव हैं, खासकर जब उपचार संयोजन में उपयोग किया जाता है । इसलिए, मानव नैदानिक परीक्षणों से पहले उभरते कैंसर विरोधी उपचारों से जुड़े हृदय विषाक्तता के लिए विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग रणनीतियों की आवश्यकता बढ़ रही है। मानव हृदय ऊतक के लिए संस्कृति प्रणालियों की उपलब्धता की कमी जो 24 घंटे से अधिक के लिए कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से व्यवहार्य है, विश्वसनीय कार्डियोटॉक्सिकिटी परीक्षण के लिए एक सीमित कारक है। इसलिए, दवा विषाक्तता के परीक्षण के लिए शारीरिक परिस्थितियों में मानव हृदय ऊतक को सत्कार करने के लिए एक विश्वसनीय प्रणाली विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है।
कार्डियोटॉक्सिकिटी टेस्टिंग में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPSC-सीएम) के उपयोग की दिशा में हाल ही में किए गए कदम ने इस मुद्दे के समाधान के लिए एक आंशिक समाधान प्रदान किया है; हालांकि, hiPSC-सीएम की अपरिपक्व प्रकृति और दिल के ऊतकों की बहुकोशिकीय प्रकृति की तुलना में ऊतक अखंडता के नुकसान इस तकनीक4की प्रमुख सीमाएं हैं । हाल के एक अध्ययन ने हाइड्रोगेल पर एचआईपीएससी-सीएम से हृदय ऊतकों के निर्माण के माध्यम से इस सीमा को आंशिक रूप से दूर किया है और उन्हें समय5के साथ विद्युत उत्तेजना में क्रमिक वृद्धि के अधीन किया है। हालांकि, उनके विद्युत गुणों ने वयस्क मानव मायोकार्डियम में देखी गई परिपक्वता को प्राप्त नहीं किया। इसके अलावा, दिल के ऊतक संरचनात्मक रूप से अधिक जटिल हैं, विभिन्न सेल प्रकारों से बने हैं, जिनमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, न्यूरॉन्स और विभिन्न प्रकार के स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं जो एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन6के एक बहुत ही विशिष्ट मिश्रण के साथ जुड़े हुए हैं। वयस्क स्तनधारी हृदय में गैर-कार्डियोमायोसाइट सेल जनसंख्या7,8,8,9 की यह विषमता व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों का उपयोग करके हृदय ऊतक मॉडलिंग में एक बड़ी बाधा है। ये प्रमुख सीमाएं हृदय5की शारीरिक और रोग की स्थितियों से जुड़े इष्टतम अध्ययनों के लिए अक्षत हृदय ऊतक की संस्कृति को सक्षम बनाने के लिए तरीकों के विकास के महत्व को उजागर करती हैं ।
मानव हृदय स्लाइस की डली बरकरार मानव मायोकार्डियम का एक आशाजनक मॉडल है। यह तकनीक एक पूर्ण 3 डी बहुकोशिकीय प्रणाली तक पहुंच प्रदान करती है जो मानव हृदय ऊतक के समान है जो मानव मायोकार्डियम की शारीरिक या रोग की स्थितियों को मज़बूती से प्रतिबिंबित कर सकती है। हालांकि, इसका उपयोग संस्कृति में व्यवहार्यता की छोटी अवधि से गंभीर रूप से सीमित हो गया है, जो 201810,,11,,12तक सूचित सबसे मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करके 24 घंटे से आगे नहीं बढ़ता है। यह सीमा स्लाइस संस्कृति के लिए हवा तरल इंटरफेस के उपयोग सहित कई कारकों के कारण थी, और एक सरल संस्कृति माध्यम का उपयोग जो हृदय ऊतक की उच्च ऊर्जावान मांगों का समर्थन नहीं करता है। हमने हाल ही में एक जलमग्न संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो निरंतर विद्युत उत्तेजना प्रदान करने में सक्षम है और 6 दिनों तक13तक हृदय ऊतक ों के स्लाइस को व्यवहार्य रखने के लिए संस्कृति मीडिया घटकों को अनुकूलित करती है । इस संस्कृति प्रणाली में प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच के अंतर को बंद करने के लिए तीव्र कार्डियोटॉक्सिकिसिटी परीक्षण के लिए सीटू मॉडल में एक शक्तिशाली भविष्य कहनेवाला मानव बनने की क्षमता है। वर्तमान लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में एक सुअर दिल का उपयोग कर दिल स्लाइस टुकड़ा करने की क्रिया और तत्यापन के लिए प्रोटोकॉल का ब्यौरा दे रहे हैं । यही प्रक्रिया मानव, कुत्ते, भेड़ या बिल्ली के दिलों पर लागू होती है। इस प्रोटोकॉल के साथ हम वैज्ञानिक समुदाय की अन्य प्रयोगशालाओं में तकनीक फैलाने की उम्मीद कर रहे हैं ।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाएं लुइसविले विश्वविद्यालय के संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार थीं और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित थीं ।
1. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए तैयारी (टुकड़ा करने की क्रिया से पहले एक दिन)
- कंपन माइक्रोटोम की तैयारी
- इन चरणों का पालन करके सिरेमिक ब्लेड को अपने धारक में रखें: ब्लेड को ध्यान से अनलपेटने के बाद, तेज किनारे को पहले ब्लेड टूल के स्लॉट में रखें। फिर, धारक की बाहों पर दो शिकंजा ढीला करके धारक में ब्लेड फिट करें और प्रत्येक वॉशर के नीचे ब्लेड को स्लाइड करें और इसे पीछे के स्टॉप के खिलाफ मजबूती से वापस धकेलें। ब्लेड को सुरक्षित करने के लिए शिकंजा कसें।
नोट: शिकंजा नहीं कसा जाना चाहिए। - निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अंशांकन प्रोटोकॉल और उपकरणों का उपयोग करके ब्लेड को कैलिब्रेट करें।
नोट: संक्षेप में, यात्रा की धुरी के साथ ब्लेड के संरेखण की सुविधा और जेड एक्सिस विक्षेप को कम करने के लिए, कंपन माइक्रोटोम एक डिमाउंटेबल कैलिब्रेशन डिवाइस का उपयोग करता है। जब अंशांकन डिवाइस को उपकरण में प्लग किया जाता है तो उसकी उपस्थिति स्वचालित रूप से पता लगा ली जाएगी, और कंपन माइक्रोटोम ब्लेड के आयाम और आवृत्ति सेटिंग्स को परिमाण में समायोजित करने का नियंत्रण लेगा जो ब्लेड संरेखण त्रुटि के समायोजन की अनुमति देता है।- संरेखण प्रक्रिया शुरू करने के लिए स्लाइस बटन दबाएं जो स्वचालित रूप से ब्लेड को स्थानांतरित कर देगा ताकि अत्याधुनिक सर्वोत्तम संरेखण मूल्यांकन के लिए अंशांकन डिवाइस के सापेक्ष इष्टतम स्थिति में हो। यह सुनिश्चित करने के लिए कि जेड-अलाइनमेंट 1 μm के भीतर है, प्रदान किए गए पेचकश का उपयोग करके ब्लेड में समायोजन करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
- भीतरी स्नान और कंपन माइक्रोटोम के सभी धातु भागों को ऑटोक्लेव करें।
- इन चरणों का पालन करके सिरेमिक ब्लेड को अपने धारक में रखें: ब्लेड को ध्यान से अनलपेटने के बाद, तेज किनारे को पहले ब्लेड टूल के स्लॉट में रखें। फिर, धारक की बाहों पर दो शिकंजा ढीला करके धारक में ब्लेड फिट करें और प्रत्येक वॉशर के नीचे ब्लेड को स्लाइड करें और इसे पीछे के स्टॉप के खिलाफ मजबूती से वापस धकेलें। ब्लेड को सुरक्षित करने के लिए शिकंजा कसें।
- बड़े धातु ट्रे (स्लाइस इकट्ठा करने और विद्युत उत्तेजना प्लेट कवर भिगोने के लिए), किसी भी ग्लास कंटेनर, नियमित आयत ब्लेड, संदंश, कैंची, प्रिंटर टाइमिंग बेल्ट (उन्हें 6 मिमी चौड़े टुकड़ों में काटलें), धातु वॉशर और डबल आसुत पानी (ddH2O) के 5 एल को ऑटोक्लेव करें।
- एक 1 एल जार, एक 500 mL जार और सीटू में दिल के लिए एक प्लास्टिक ट्रे और कार्डियोप्लेजिक समाधान के साथ इन विट्रो perfusion।
- एक 2 एल बीकर में टुकड़ा करने की क्रिया Tyrode समाधान के 2 एल तैयार करते हैं।
- टुकड़ा करने की क्रिया Tyrode समाधान के 1 एल के लिए, मिश्रण 3 g/L 2,3-butanedione मोनोक्सिम (बीडीएम), १४० mM NaCl (८.१८ ग्राम), 6 mM KCl (०.४४७ ग्राम), 10 mM डी-ग्लूकोज (1.86 ग्राम), 10 एमएम एचईपी (2.38 ग्राम), 1 एमएम एमजीसीएल2 (1 एम समाधान का 1 एमएल), 1.8 एमएम सीएसीएल2 (1 एम समाधान का 1.8 मिलीग्राम), डीडीएच2ओ के 1 एल तक। NaOH का उपयोग कर पीएच को 7.40 तक समायोजित करें। फिर, 1,000 मीटर, 0.22 माइक्रोन, वैक्यूम फिल्टर/स्टोरेज सिस्टम का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन के 4 एल तैयार करें।
- कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन के 1 एल के लिए मिक्स 110 एमएम एनसीएल (6.43 ग्राम), 1.2 एमएम सीएसीएल2 (1.2 एम सॉल्यूशन का 1.2 एम), 16 एमएम केसीएल (1.19 ग्राम), 16 एमएम एमजीसीएल2 (3.25 ग्राम), 10 एमएम नाहको3 (0.84 ग्राम), 1 यू/एमएल हेपरिन, DdH2O. के 1 एल तक NaOH का उपयोग कर पीएच को 7.40 तक समायोजित करें। फिर, 1,000 मीटर, 0.22 माइक्रोन, वैक्यूम फिल्टर/स्टोरेज सिस्टम का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: कार्डियोप्लेजिया समाधान में १,००० U/L heparin जोड़ें टुकड़ा करने की क्रिया के दिन (कदम २.१ देखें) ।
- कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन के 1 एल के लिए मिक्स 110 एमएम एनसीएल (6.43 ग्राम), 1.2 एमएम सीएसीएल2 (1.2 एम सॉल्यूशन का 1.2 एम), 16 एमएम केसीएल (1.19 ग्राम), 16 एमएम एमजीसीएल2 (3.25 ग्राम), 10 एमएम नाहको3 (0.84 ग्राम), 1 यू/एमएल हेपरिन, DdH2O. के 1 एल तक NaOH का उपयोग कर पीएच को 7.40 तक समायोजित करें। फिर, 1,000 मीटर, 0.22 माइक्रोन, वैक्यूम फिल्टर/स्टोरेज सिस्टम का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- हौसले से एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में मूल बोतल में संस्कृति माध्यम के ५०० एमएल तैयार: मिश्रण मध्यम १९९, 1x इंसुलिन-ट्रांसफर-सेलेनियम (आईटीएस) पूरक, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 एनजी/एमएल संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF), 10 एनजी/mL FGF-बुनियादी, और 2x एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक । फिल्टर 022 माइक्रोन, वैक्यूम फिल्टर/स्टोरेज सिस्टम के माध्यम से बंध्याकरण करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
नोट: पीएच को समायोजित न करें, उपयोग से पहले VEGF और FGF को ताजा जोड़ें। - 4% आगर जेल प्लेटें तैयार करें।
- एक 500 मीटर निष्फल फ्लास्क में बंध्याकरण डीडीएच2ओ के 200 मीटर जोड़ें। 8 ग्राम अगारोज का वजन, और धीरे-धीरे फ्लास्क में डालें। एक माइक्रोवेव में 2 न्यूनतम के लिए उबालें, फिर कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए ठंडा करें।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रत्येक 100 मिमी पेट्री डिश में 25 मिमी डालो (6 व्यंजन तैयार) और 1 घंटे के लिए प्रतीक्षा करने के लिए जमना । इसके बाद प्लेट्स को पैराफिन फिल्म से सील करें, साफ रैप से लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ऑटोक्लेव डीएच2ओ में 200 प्रूफ निरपेक्ष इथेनॉल को कमजोर करके 70% इथेनॉल के 4 एल तैयार करें।
- बंध्याकरण डीडीएच2ओ में 2x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक तैयार करें: बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के 20 मिलील के साथ निष्फल डीडीएच2ओ का मिक्स 980 मिलीएल।
2. सुअर दिल Perfusion
- कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन के प्रत्येक 1 एल में 1,000 यू/एमएल हेपरिन का 1 एल जोड़ें। बर्फ पर घोल रखें।
नोट: ऊतक संस्कृति कक्ष में स्थानांतरण के दौरान हृदय के परफ्यूजन और संरक्षण के लिए कम से कम 3 एल की आवश्यकता होती है। - सुअर सर्जरी कमरे में निम्नलिखित वस्तुओं ले लो: एक बड़ी बर्फ बर्फ से भरा बाल्टी, एक निष्फल धातु ट्रे (दिल perfusion के लिए बर्फ बाल्टी पर रखने के लिए), एक निष्फल ५०० mL जार, एक 1 एल जार (कार्डियोप्लेजिया समाधान में दिल हस्तांतरण के लिए ऊतक संस्कृति कमरे में वापस , बर्फ पर), और एक निष्फल प्लास्टिक बर्फ से भरा ट्रे (बर्फ पर कार्डियोप्लेजिक समाधान रखने के लिए) ।
- एक इन-सीटू हार्ट परफ्यूजन सिस्टम तैयार करें जिसमें 3-वे स्टॉपकॉक, 60 मिलीग्राम सिरिंज, 18 ग्राम तितली सुई कैथेटर और कार्डियोप्लेजिक समाधान जलाशय में एक्सटेंशन ट्यूबिंग शामिल है।
- एनेस्थेटाइज़ यॉर्कशायर नर सुअर (2−3 महीने पुराना, 20−25 किलो) पहले एक केटामाइन (20 मिलीग्राम/किलो)/xylazine (2 मिलीग्राम/किलो) कॉकटेल के इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन के साथ । जबड़े के तनाव के नुकसान से उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। फिर, सुअर को सर्जरी कक्ष में स्थानांतरित करें, फेफड़ों को इंटुलेट करें और यांत्रिक रूप से हवादार करें जैसा कि पहले14वर्णित था।
- (1.5−2%) आइसोफ्लोरीन।
- जानवर को सही पार्श्व स्थिति पर रखें और छाती क्षेत्र से फर दाढ़ी रखें। शराब साफ़ के साथ त्वचा को साफ करें, फिर सर्जिकल साइट को 10% (w/v) पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ स्टरलाइज करें।
- 4 इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में स्केलपेल का उपयोग करके बाएं थोराकोटॉमी चीरा द्वारा छाती खोलें, और छाती को खुला रखने और दिल को बेनकाब करने के लिए पसलियों के बीच छाती रिट्रैक्टर का उपयोग करें।
नोट: इस प्रक्रिया के लिए सभी निष्फल उपकरणों का उपयोग करें। - बाईं एट्रियम में तितली सुई कैथेटर डालें और पर्स स्ट्रिंग बंद होने के साथ सुई को ठीक करें। हेपरिन (100 यू/किलो) की बोलस खुराक के नसों में इंजेक्शन के बाद, बाएं एट्रियल कैथेटर के माध्यम से बर्फ-ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान (हृदय गति को धीमा करने के लिए) के 500 मिलीग्राम के साथ सीटू में दिल को परफ्यूज करना शुरू करें।
- गहराई से 5% आइसोफ्लोरीन के साथ सुअर एनेस्थेटाइज़। सर्जिकल कैंची से सीने से दिल को जल्दी से उत्पादित करें। एक महाधमनी कैनुला के साथ महाधमनी को कैन्यूलेट करें और वास्कुलचर रक्त को बाहर निकालने के लिए बर्फ-ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान (100 मीटर/मिन) के एक और 1 एल के साथ विट्रो में दिल को पर्क्यूब करें।
- दिल perfusion के बाद, एक 1 एल बर्फ ठंड कार्डियोप्लेजिया समाधान से भरा जार में दिल रखो और ऊतक संस्कृति कमरे में हस्तांतरण के दौरान बर्फ पर रहते हैं ।
3. सुअर दिल ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया
- वाइब्रेटोम पर टिश्यू बाथ सेट करें, टिश्यू बाथ कूलिंग जैकेट में बर्फ डालें, फिर टिश्यू बाथ में टाइरोड का घोल डालें। ऊतक स्नान शीतलन जैकेट से पिघलबर्फ के निपटान को इकट्ठा करने के लिए 1 एल प्लास्टिक जार की स्थापना की।
- बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत, सुअर दिल को एक ट्रे में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान के 1 एल होते हैं।
- त्यागने योग्य बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके बाएं वेंट्रिकल को अलग करने के लिए दिल को विच्छेदन करें। फिर, रेजर आयत ब्लेड का उपयोग करके बाएं वेंट्रिकल को 1−2 सेमी3 के ब्लॉक में काट लें। टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक टुकड़ा का प्रयोग करें और बाद में काटने के लिए बर्फ पर ठंड Tyrode के समाधान में एक ५० मीटर ट्यूब में शेष टुकड़े रखने के लिए, अगर जरूरत है ।
नोट: हाथों से टुकड़ा करने की क्रिया से पहले ऊतक मालिश, खासकर अगर यह दूसरा ब्लॉक है। मालिश सही मांसपेशियों फाइबर विन्यास को बहाल करने में मदद करता है और दिल ब्लॉक के भीतर किसी भी कठोरता को रोकता है। - धातु के नमूने धारक के लिए ऊतक गोंद(सामग्री की तालिका)की 1−2 बूंदें जोड़ें और लगभग 1 सेमी2के सतह क्षेत्र के साथ 4% एगर ब्लॉक के एक टुकड़े को चिपकाएं।
- आगर पर टिश्यू गोंद की 1−2 बूंदें डालें।
- ऊतक गोंद पर नीचे का सामना करना पड़ हृदय एपीकार्डियम पक्ष के साथ आगर के लिए दिल ब्लॉक छड़ी और सुनिश्चित करें कि यह संभव के रूप में के रूप में फ्लैट है । फिर, वाइब्रेटोम के स्लाइसिंग बाथ में ऊतक धारक को हार्ट ब्लॉक के साथ अपनी स्थिति में स्थानांतरित करें।
- स्लाइस (ऑक्सीजनयुक्त टाइरोड के स्नान) को इकट्ठा करने के लिए टाइरोड के समाधान से भरे स्लाइस और धातु ट्रे में ऑक्सीजन ट्यूब संलग्न करें। इसके बाद कटिंग के बाद स्लाइस इकट्ठा करने के लिए मेटल ट्रे में 40 माइक्रोन सेल स्ट्रेन ्सर डालें।
- टुकड़ा करने की स्थिति को समायोजित करना
- वाइब्रेटोम ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर और डैशबोर्ड का उपयोग करके, ब्लेड/नमूना की ऊंचाई को समायोजित करें। ऊंचाई बटन का चयन करें और ऊंचाई को समायोजित करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। आदर्श रूप से, ब्लेड ऊतक के शीर्ष के करीब है, लेकिन papillary मांसपेशियों के नीचे और सुनिश्चित करें कि वहां तरल ऊतक और टुकड़ा करने की क्रिया से पहले ब्लेड को कवर किया है ।
- समायोजित करें जहां अग्रिम बटन का चयन करके ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने के लिए। स्लाइस बटन दबाएं और ब्लेड को ऊतक के किनारे की ओर ले जाने के लिए घुंडी का उपयोग करके गति बढ़ाएं। फिर, बंद करने के लिए फिर से स्लाइस दबाएं, और प्रक्रिया को निष्क्रिय करने के लिए अग्रिम बटन दबाएं।
- काटने के मापदंडों को समायोजित करें: अग्रिम गति = 0.03 मिमी/एस, कंपन आवृत्ति = 80 हर्ट्ज, और क्षैतिज कंपन आयाम = 2 मिमी। इसके बाद स्लाइस बटन का चयन कर स्लाइस िंग शुरू करें।
- वाइब्रेटोम स्लाइस को तब तक दें जब तक कि यह ऊतक के अंत तक न पहुंच जाए लेकिन इससे पहले कि यह नमूना धारक के पीछे के छोर से टकराता है। इस बिंदु पर, बंद करने के लिए फिर से टुकड़ा दबाएं। स्टार्ट पोजीशन पर वापस जाने के लिए रिटर्न बटन को मारो।
- ऑटो रिपीट (दो बार क्लिक करना) चुनें जो कंपन माइक्रोटोम को 99 बार तक टुकड़ा करने की प्रक्रिया को दोहराने के लिए ऑटो की अनुमति देगा।
- स्लाइस इकट्ठा करना
- तब तक प्रतीक्षा करें जब तक स्लाइस पूरी लंबाई न हो जाएं और अच्छे दिखाई दें (पैपिलरी मांसपेशियों की परतों को पिछले होने के बाद), फिर स्लाइस इकट्ठा करना शुरू करें।
- स्नान से ऊतक को धीरे-धीरे हड़पने के लिए ठंडे टाइरोड के समाधान से भरे प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करस्लाइस लीजिए। यदि आवश्यक हो, तो ऊतक अभी भी जुड़ा हुआ है, तो दिल के ब्लॉक से स्लाइस को अलग करने के लिए संदंश और वसंत कैंची का उपयोग करें।
- ऑक्सीजनयुक्त टाइरोड के स्नान में एक सेल छलनी में स्लाइस स्थानांतरित करें (चरण 3.7 देखें) और ऊतक को कोशिका छलनी में से एक पर फ्लैट झूठ बोलने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट में तरल का उपयोग करें, फिर ऊतक को नीचे रखने के लिए शीर्ष पर एक धातु वॉशर जोड़ें।
नोट: स्लाइस को प्रसंस्करण से पहले टायरोड के समाधान में कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड करने की आवश्यकता होती है (यह ऊतक को आराम करने के लिए बीडीएम के लिए है)।
4. दिल स्लाइस की चोरी
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संस्कृति के लिए स्लाइस तैयार करना
- किसी भी असमान किनारों से बचने के लिए किनारों से टुकड़ा ट्रिम करें। फिर, ऊतक गोंद का उपयोग करके एम्बेडेड धातु तारों के साथ निष्फल पॉलीयूरेथेन 6 मिमी चौड़े प्रिंटर टाइमिंग बेल्ट के लिए दोनों सिरों से गोंद करें।
- समर्थित दिल स्लाइस को 6 अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करें जिनमें प्रत्येक कुएं में संस्कृति माध्यम का 6 मिलीएल हो।
- उत्तेजना प्लेट कवर(सामग्री की तालिका)6 अच्छी तरह से थाली के शीर्ष पर रखें और सेल संस्कृति विद्युत उत्तेजक(सामग्री की तालिका)से कवर कनेक्ट करें। 10 वी, 1.2 हर्ट्ज लगातार हर समय दिल के स्लाइस को प्रोत्साहित करने के लिए उत्तेजक को समायोजित करें।
नोट: उत्तेजना में खामियों को दूर करने के बाद, दिल स्लाइस को हरा करने के लिए शुरू कर देंगे, और इस आंदोलन नेत्रहीन स्पष्ट हो जाएगा । - प्लेटों को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और आर्द्र हवा और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
- प्रति दिन संस्कृति मध्यम 3x बदलें और प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के दौरान प्रति अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 6 mL जोड़ें ।
नोट: संस्कृति माध्यम प्रत्येक मीडिया परिवर्तन से पहले 5 मिन के लिए ऑक्सीजनयुक्त है । मध्यम प्रति दिन कम से कम 1x बदला जाना चाहिए; यदि आवश्यक हो तो सप्ताहांत पर यह ठीक है। प्रति दिन केवल 1 मीडिया परिवर्तन के दो दिन अधिकतम है कि परीक्षण किया जाता है । -
संस्कृति माध्यम में विषाक्त ग्रेफाइट कणों की रिहाई को रोकने के लिए हर दिन उत्तेजना प्लेट कवर बदलें (आमतौर पर मध्याह्न मीडिया परिवर्तन के दौरान)।
- संस्कृति पकवान से उत्तेजना प्लेट कवर निकालें और सफेद फोम प्लग जहां कवर सेल संस्कृति विद्युत उत्तेजक के लिए केबल से जोड़ता है, बिजली के सर्किट को पानी की क्षति को रोकने के लिए डालें ।
- प्लेट कवर को 2x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ ऑटोक्लेव पानी के स्नान में रखें। इसे रात भर इस स्नान (यानी रिनसिंग बाथ) में रखें।
- अगले दिन, प्लेट कवर को दूषित करने के लिए 5−15 मिन के लिए 70% इथेनॉल स्नान में ले जाएं। स्नान स्विचकरने से पहले डिवाइस से ज्यादा तरल के रूप में हिला।
- फिर, प्लेट कवर को तीसरे और अंतिम स्नान (यानी, क्लीन बाथ) में स्थानांतरित करें, जिसमें किसी भी शेष इथेनॉल निशान को कुल्ला करने के लिए ऑटोक्लेव पानी और 2x एंटीबैक्टीरियल-एंटीमाइकोटिक शामिल हैं।
- साफ स्नान में प्लेट कवर को खंगालने के बाद, प्लास्टिक के हिस्सों पर किसी भी अवशिष्ट पानी को सुखाने के लिए एक साफ लिंट-मुक्त पोंछ (इथेनॉल के साथ छिड़काव) का उपयोग करें, फिर सफेद फोम टुकड़ा हटा दें और ध्यान से प्लेट को संस्कृति प्लेट पर वापस कवर करें।
नोट: कुएं में जाने वाले ब्लैक ग्रेफाइट इलेक्ट्रोड को न छुएं, क्योंकि डिवाइस अब बाँझ नहीं रहेगी। - बाँझ संदंश का उपयोग करना, सुनिश्चित करें कि ऊतक अच्छी तरह से केंद्र में है ताकि प्लेट कवर ऊतक को छून न हो। सुनिश्चित करें कि प्लेट कवर का घुमावदार पक्ष प्लेट के कोण वाले पक्ष के साथ मेल खाता है और वर्ग कोनों को लाइन करें।
नोट: उत्तेजना प्लेट कवर के संदूषण को कम करने के लिए, प्रयोग खत्म करने के बाद उन्हें साफ और खाली 6 अच्छी तरह से प्लेटों में रखें।
- एक एमटीटी परख, कैल्शियम माप और ताजा सुअर दिल स्लाइस (0 दिन) पर संकुचन समारोह आकलन करते हैं, और संस्कृति में 6 दिनों के बाद Ou एट अल13के अनुसार ।
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Representative Results
एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृति विद्युत उत्तेजक का उपयोग करना जो एक बार में आठ 6 अच्छी तरह से प्लेटों को समायोजित कर सकता है, हमने शारीरिक आवृत्ति (1.2 हर्ट्ज) पर विद्युत उत्तेजना को प्रेरित करके वयस्क हृदय परिवेश का अनुकरण किया, और संस्कृति13में कार्यात्मक सुअर दिल स्लाइस की अवधि को लम्बा करने के लिए मौलिक मध्यम घटकों की जांच की। चूंकि सुअर और मानव दिल आकार और शरीर रचनाविज्ञान 15में समान हैं, हम सुअर दिल का उपयोग कर एक बायोमिमेटिक हार्ट स्लाइस संस्कृति प्रणाली विकसित की है और बाद में यह मानव दिल स्लाइस में मांय । यहां, हम सुअर दिल स्लाइस जो मानव दिल टुकड़ा करने की क्रिया और सत्तकार के लिए एक ही प्रक्रिया है के लिए प्रोटोकॉल विस्तृत । नई बायोमिमेटिक संस्कृति सेटअप यहां वर्णित है, 6 दिनों के लिए सुअर दिल स्लाइस की व्यवहार्यता बनाए रखा के रूप में MTT परख(चित्रा 1ए)द्वारा मूल्यांकन किया । हमने 6 दिनों में इन स्लाइस की कार्यात्मक व्यवहार्यता की पुष्टि की है जो उनके कैल्शियम होमोस्टोसिस और संकुचन बल का आकलन करके हैं। पहले 6 दिनों में, कार्डियोमायोसाइट्स में कोई सहज कैल्शियम क्षणिक नहीं होता है, और कार्डियोमायोसाइट्स ने बाहरी विद्युत उत्तेजना के साथ-साथ ताजा दिल के स्लाइस(चित्रा 1बी)के समान एड्रेनेर्गिक उत्तेजना का जवाब दिया। इसके अलावा, सिसोप्रोटेरोनॉल के लिए संकुचन बल और प्रतिक्रियाओं को 6 दिनों तक सुसंस्कृत दिल के स्लाइस में बनाए रखा जाता है, जो ताजा दिल के स्लाइस(चित्रा 1सी, डी)के समान है।
चित्रा 1: सुअर दिल टुकड़ा संस्कृति की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता का सत्यापन। (क)अनुकूलित माध्यम में या तो उत्तेजित या अउत्तेजित संस्कृति प्रणाली में एमटीटी परख का उपयोग करसमय के साथ दिल का टुकड़ा व्यवहार्यता का परिमाणीकरण (n = 5 सुअर दिल प्रत्येक ट्रिपलकेट में, SEM त्रुटि सलाखों के रूप में प्रतिनिधित्व किया है; समूहों के बीच तुलना करने के लिए दो तरह का ANOVA परीक्षण आयोजित किया गया था, * पी & ०.०५) । (ख)प्रतिनिधि कैल्शियम संकेत एक ताजा दिल के टुकड़े (0 दिन) से पता चलता है और संस्कृति में 6 दिनों के बाद (6 दिन) के साथ और 1 μM आइसोप्रोटेरोनॉल (आईएसओ) उत्तेजना के बिना । फ्लो-4 कैल्शियम डाये के साथ दिल के स्लाइस लोड करने और रिकॉर्डिंग के समय 1 हर्ट्ज/20 वी इलेक्ट्रिकल उत्तेजना का उपयोग करने के बाद क्षणिकों को दर्ज किया गया था । कैल्शियम सिग्नल के साथ और आइसोप्रोटेरेनॉल के साथ उत्तेजना के बिना आयाम की मात्रा संस्कृति में 0 दिन 0 और 6 दिन में कैल्शियम यात्रियों का एक समान पैटर्न दिखाता है (n = 4 सुअर दिल, प्रत्येक में विश्लेषण की गई 10−15 कोशिकाओं, एसईएम को त्रुटि सलाखों के रूप में दर्शाया गया है; समूहों के बीच तुलना करने के लिए दो-तरफा ANOVA परीक्षण किया गया था, * पी एंड एलटी; 0.05 बेसलाइन की तुलना एक ही समय बिंदु पर आइसो उत्तेजना से, पी-वैल्यूडी0 बनाम D6 = 0.95, और पी-वैल्यूD0 आईएसओ बनाम D6 आईएसओ = 0.93)। (ग)अनुबंधबल मूल्यांकन सेटअप (बाएं पैनल); दिल का टुकड़ा (एचएस) विद्युत उत्तेजना के लिए दो इलेक्ट्रिक इलेक्ट्रोड (ईई) के बीच एक बल ट्रांसड्यूसर (एफटी) और एक स्थिर पोस्ट (पी) के बीच लटका हुआ है। उत्तेजना पर, स्लाइस अनुबंध और संकुचन नामित सॉफ्टवेयर (दाएं पैनल) का उपयोग करके दर्ज किए जाते हैं। (घ)बार ग्राफ ताजा सुअर दिल स्लाइस (दिन 0) द्वारा उत्पन्न आइसोप्रोटेरोनॉल (आईएसओ) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में संकुचन बल की मात्रा को दर्शाता है और बायोमिमेटिक संस्कृति में 6 दिनों के बाद (एन = 4 सुअर दिल प्रत्येक ट्रिपलेट में, एसईएम को त्रुटि सलाखों के रूप में दर्शाया गया है; समूहों के बीच तुलना करने के लिए दो-तरफा ANOVA परीक्षण किया गया था, * पी एंड एलटी; 0.05 बेसलाइन की तुलना एक ही समय बिंदु पर आइसो उत्तेजना से, चिकोटी बल: पी-वैल्यूडी0 बनाम डी 6 = 0.96, पी-वैल्यूडीएसओ बनाम डी 6 आईएसओ = 0.81; समय से 50% छूट: पी-वैल्यू D0 बनाम D6 = 0.47, पी-वैल्यूD0 आईएसओ बनाम D6 आईएसओ = 0.43)। इस आंकड़े को Ou et al.13से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| हालत | फिशर एट अल16 | आउ एट अल13 |
| प्रजातियां | मानव | सुअर और मानव |
| रोग | असफल दिल | सामान्य स्वस्थ दिल |
| संरक्षण | संरक्षित ऊतक | ताजा ऊतक |
| मोटाई का टुकड़ा | 300 माइक्रोन | 300 माइक्रोन |
| मध्यम ऑक्सीजन | नहीं | इंटरमिटेंट ऑक्सीजन |
| संस्कृति माध्यम | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| आंदोलन | हाँ | नहीं |
| पेसिंग रेट | 0.2 हर्ट्ज | 1.2 हर्ट्ज |
| संस्कृति की अवधि | समझौते के साथ 4 महीने | कोई समझौता नहीं के साथ 6 दिन |
| कटचर तापमान | 37 | 37 |
| मैकेनिकल लोडिंग | ऑक्सोटोनिक लोडिंग | कोई लोडिंग नहीं |
| ताजा दिल के टुकड़े की तुलना में जीन अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन के साथ परीक्षण समय अंक | N/A | 2 और 6 दिन |
| जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन दिखाने के लिए पहली बार परीक्षण समय बिंदु | 8 दिन | दिन 10 |
तालिका 1: फिशर एट अल16 और Ou एट अल13में उपयोग की जाने वाली टुकड़ा करने की क्रिया और सत्कार स्थितियों के बीच तुलना ।
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Discussion
यहां हम सरलीकृत माध्यम थ्रूपुट (४८ स्लाइस/डिवाइस तक की प्रक्रियाओं) विधि के लिए हमारी हाल ही में प्रकाशित विधि के लिए विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो तीव्र कार्डियोटॉक्सिसिटी13का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त अवधि के लिए सुअर दिल स्लाइस की संस्कृति को सक्षम बनाता है । प्रस्तावित स्थितियां हृदय के पर्यावरण की नकल करते हैं, जिसमें विद्युत उत्तेजना की आवृत्ति, पोषक तत्वों की उपलब्धता और आंतरायिक ऑक्सीजन शामिल हैं। हम अपने बायोमिमेटिक उत्तेजित संस्कृति में दिल के स्लाइस की लंबे समय तक व्यवहार्यता को बरकरार दिल से अनुभवी शारीरिक स्थितियों को पुनः बनाने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए जिम्मेदार ठहराते हैं। इस अवधारणा को हमारे डेटा द्वारा समर्थित दिखा रहा है कि केवल विद्युत उत्तेजना, आवश्यक पोषक तत्व प्रदान किए बिना, दिल का टुकड़ा व्यवहार्यता13बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है । इसलिए, संस्कृति माध्यम के नए घटक संस्कृति में दिल का टुकड़ा व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को लंबा करने के लिए प्रमुख चालक हैं। हमने पाया कि व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए एफबीएस को माध्यम में शामिल करना आवश्यक है, जो विभिन्न प्रकार के फैटी एसिड, ट्रेस तत्वों, एंजाइमों, प्रोटीन, मैक्रोमॉलिक्यूल्स, रासायनिक घटकों और हार्मोन के लिए आवश्यकता के कारण होने की संभावना है, जो आमतौर पर सीरम में मौजूद होते हैं और वीवो17में हृदय ऊतक को वितरित होते हैं। इसके अलावा, हमने पाया कि ऊतक व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए संस्कृति माध्यम के लिए FGF और VEGF के अलावा की जरूरत है । एफजीएफ और जीजीएफ एंजियोजेनिक कारक हैं जो सुसंस्कृत एंडोथेलियल कोशिकाओं18के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, यह संभावना है कि ऊतक व्यवहार्यता का समर्थन करने के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं और संस्कृति में संयोजी ऊतकों को बनाए रखने के लिए एफजीएफ और VEGF की आवश्यकता है। हमारा काम पहले दिल स्लाइस की खेती के लिए रिपोर्ट सरलीकृत संस्कृति माध्यम को संशोधित करने के लिए है, और यह बाद के अध्ययनों में मीडिया घटकों के आगे अनुकूलन के लिए संभावना खोलता है ।
हमारी नई विधि के साथ समय बद्ध तरीके से, तीन अन्य अध्ययन ों ने बायोइंजीनियर्ड सिस्टम16,,19,,20में संस्कृति में स्लाइस बनाए रखने में निरंतर विद्युत उत्तेजना के महत्व को दर्शाया है। हालांकि, इन अध्ययनों ने बेसल M199/ITS माध्यम का इस्तेमाल किया, जो दिल के स्लाइस की मेटाबोलिक जरूरतों को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है । इसके कारण संस्कृति16,19,,20के दौरान स्लाइस संकुचन और कैल्शियम होडोस्टोसिस में कई समझौते हुए . Qiao एट अल19 ने एक अत्यधिक परिष्कृत बायोइंजीनियर्ड चिप्स विकसित किया, जो 4 दिनों तक दिल के स्लाइस के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को बनाए रख सकता है, लेकिन संकुचन समारोह का कोई आकलन प्रदान नहीं किया गया था। वाटसन एट अल20 ने 24 घंटे के लिए कार्डियक मांसपेशियों के गुणों के रखरखाव के लिए डायस्टोलिक सरकोरे लंबाई के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए कम थ्रूपुट कल्चर सिस्टम (4 स्लाइस/डिवाइस तक की प्रक्रियाएं) को बायोइंजीनियर किया है । अंत में, फिशर एट अल16 से पता चला है कि असफल मानव दिल स्लाइस 4 महीने तक के लिए विट्रो में बनाए रखा जा सकता है जब ०.२ हर्ट्ज उत्तेजना, ऑक्सोटोनिक लोडिंग और एक बायोइंजीनियरिंग डिवाइस में मीडिया आंदोलन के तहत सुसंस्कृत । हालांकि, इन स्थितियों ने दिल के स्लाइस में विभिन्न प्रकार के परिवर्तनों को प्रेरित किया, जैसा कि उनके RNAseq डेटा में परिलक्षित होता है, जिसने पहली बार मूल्यांकन (दिन 8)16के रूप में कार्डियक जीन अभिव्यक्ति के 10 गुना डाउनरेगुलेशन को दिखाया। हालांकि, हमारी अनुकूलित संस्कृति प्रणाली में, ताजा दिल के ऊतकों की तुलना में संस्कृति में क्रमशः 2 और 6 दिनों के बाद केवल 2 और 5 ट्रांसक्रिप्ट काफी अलग-अलग व्यक्त किए गए थे। हालांकि, संस्कृति में 10 दिनों के बाद, 500 से अधिक प्रतिलिपियों की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन हुए। संस्कृति में 10 दिनों के बाद डाउनरेक्टोरल जीन ज्यादातर हृदय की मांसपेशियों से संबंधित थे, जबकि अपरेच्युइड जीन फाइब्रोब्लास्ट, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स और सूजन13से संबंधित हैं। तालिका 1 में फिशर एट अल16 और Ou एट अल13के बीच टुकड़ा करने की क्रिया और संस्कृति प्रोटोकॉल की पूरी तुलना शामिल है । इसलिए, हमारी बायोमिमेटिक उत्तेजित संस्कृति प्रणाली सीटू में दिल द्वारा अनुभव की गई नियंत्रणीय स्थितियों का अनुकरण करती है और इसलिए, समझौता संस्कृति प्रणालियों की तुलना में तीव्र कार्डियोटॉक्सिकिटी या प्रभावकारिता के संबंध में कार्यात्मक और दवा उपचार के संरचनात्मक परिणामों का एक विश्वसनीय रीडआउट प्रदान करना चाहिए।
इस संस्कृति प्रणाली की प्रमुख सीमाओं में से एक यह है कि हालांकि हमारी संस्कृति प्रणाली कई शारीरिक स्थितियों का अनुकरण कर सकते हैं, यह यांत्रिक लोड में परिवर्तन की नकल नहीं कर सकते है और हृदय संकुचन चक्र के दौरान तनाव कतरनी । शारीरिक और मेटाबोलिक कारकों का और अनुकूलन दिल की स्लाइस व्यवहार्यता और कार्य को लम्बा करने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, हमने एक प्रारंभिक अनुकूलन देखा जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन की कमी की ओर जाता है जो दिल के स्लाइस व्यवहार्यता13की गिरावट को भड़का सकता है। दुर्भाग्य से, अब तक, हम ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन को बनाए रखने के लिए एक इष्टतम विधि की पहचान करने में सक्षम नहीं थे। यह संभावना है कि दिल के स्लाइस में फैटी एसिड चयापचय को बढ़ाना विकास माध्यम में फैटी एसिड जोड़ने जितना सरल नहीं है, और इसके लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी, जिसे भविष्य के अध्ययनों में संबोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण की एक सामान्य कमजोरी दिल के स्लाइस के भीतर एकल कार्डियोमायोसाइट्स पर कार्रवाई क्षमता की लापता माप है, जो इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और वेंट्रिकुलर अतालता में व्यवधान प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, कार्डियोटॉक्सिन के साथ उपचार के बाद दिल के स्लाइस से एकल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की आवश्यकता है जो इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम में व्यवधान पैदा करते हैं और अलग-अलग कार्डियोमायोसाइट्स पर कार्रवाई क्षमता पर उनके प्रभाव का आकलन करते हैं।
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Disclosures
TMAM तेनाया चिकित्सा विज्ञान में इक्विटी रखती है । अन्य लेखक कोई संघर्ष की रिपोर्ट नहीं करते हैं ।
Acknowledgments
टीएमएएम को एनआईएच ग्रांट पी30जीएम 127607 और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रांट 16SDG29950012 का समर्थन है। आरबी P01HL78825 और UM1HL113530 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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