Summary
이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
많은 신규 약물은 현재 시험관내 분석 및 생체 내 동물 모델이 인간의 심장 부채를 제대로 예측하지 못하므로 심장 독성 부작용으로 인한 임상 연구에서 실패하여 제약 산업에 수십억 달러의 부담을 안겨주고 있습니다. 따라서, 비용이 많이 들고 시간 소모 '남자에서 처음' 예심을 착수하기 전에 약 심장 독성을 확인하기 위하여 더 나은 접근을 위한 세계적인 충족되지 않은 의학 필요가 있습니다. 현재, 만 미성숙 심장 세포 (인간 유도 만능 줄기 세포 파생 심근 세포 [hiPSC-CMs])는 장기간 배양 할 수있는 유일한 인간 심장 세포이기 때문에 치료 효율성과 약물 독성을 테스트하는 데 사용됩니다. 약물 효능 및 독성을 테스트하는 데 필요합니다. 그러나, 단일 세포 모형은 다중 세포 모형의 형성되는 복잡한 3D 심혼 조직의 표현형을 복제할 수 없습니다. 중요한 것은, 미성숙 hiPSC-CMs에 비해 다른 특성 과 독성 반응을 가진 성인 심근 세포에 약물의 효력이 시험될 필요가 있습니다. 이 기술은 인간의 심장 조직을 모방하고 인간의 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 반영하는 완전한 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 최근에는 배양 배지 성분의 최적화와 배양 배지의 연속적인 전기 자극을 포함하는 배양 조건의 최적화와 배양배지의 간헐적 산소화를 통해 생존력을 보존하는 새로운 배양 시스템 설정을 개발했습니다. 그리고 문화에서 6 일 동안 인간과 돼지 심장 조각의 기능. 현재 프로토콜에서는 돼지 심장을 잘라내고 배양하는 방법을 예로 들어 자세히 설명하고 있습니다. 동일한 프로토콜은 인간, 개, 양 또는 고양이 하트에서 조각을 배양하는 데 사용됩니다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심독성 검사를 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다.
Introduction
약물 유발 심장 독성은 시장 철수의 주요 원인1. 20세기의 마지막 십년간에서, 8개의 비 심장 혈관 약은 심실 부정맥 때문에 급격한 죽음의 결과로 시장에서 철회되었습니다2. 또한, 여러 항암 치료 (많은 경우에 효과적인 동안) 심근 증과 부정맥을 포함 하 여 여러 심장 독성 효과 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 전통적인(예를 들어, 안트라시클라인 및 방사선) 및 표적(예를 들어, 트라스투주맙) 유방암 요법은 환자의 서브세트에서 심혈관 합병증을 초래할 수있다 3. 심장 전문의와 종양 전문의 사이의 긴밀한 협력 ("심장 종양학"의 신흥 분야를 통해) 이러한 합병증을 효과적으로 치료 할 수 있도록 관리 할 수 있도록도움이되었습니다 2. Her2 및 PI3K 억제제, 특히 치료가 조합되어 사용될 때 새로운 제제의 심혈관 효과는 명확하지 않습니다. 따라서, 인간 임상 시험 이전에 새로운 항암 치료와 관련된 심혈관 독성에 대한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있다. 24시간 이상 기능적으로 그리고 구조적으로 실행 가능한 인간 심장 조직에 대한 배양 시스템의 가용성의 부족은 신뢰할 수 있는 심장 독성 테스트를 위한 제한 요소입니다. 따라서, 약물 독성 시험을 위한 생리적 조건 하에서 인간의 심장 조직을 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 시급하다.
최근 심장 독성 테스트에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)의 사용으로 의한 움직임은 이 문제를 해결하기 위한 부분적인 해결책을 제공하였다; 그러나, hiPSC-CM의 미성숙한 성질과 심장 조직의 다세포 성질에 비해 조직 무결성의 손실은 이 기술의 주요 한계이다4. 최근 연구는 하이드로겔에 hiPSC-CM에서 심장 조직의 제조를 통해 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 시간이 지남에 따라 전기 자극의 점진적 증가를 복종5. 그러나, 그들의 전기 기계적 특성은 성인 인간 심근에서 볼 수있는 성숙도를 달성하지 못했습니다. 더욱이, 심장 조직은 구조적으로 더 복잡하며, 내피 세포, 뉴런 및 세포외 기질 성질 섬유아세포의 다양한 유형을 포함하는 다양한 유형의 세포외 매트릭스 단백질의 매우 특이적인 혼합물과 함께 연결되고6. 이러한 비심근세포 세포 집단의 이질성은 성인 포유류 심장에서7,,8,,9가 개별 세포 유형을 이용하여 심장 조직을 모델링하는 데 큰 장애가 된다. 이러한 주요 제한 사항은 심장의 생리적 및 병리학적 조건을 포함하는 최적의 연구를 위해 손상되지 않은 심장 조직의 문화를 가능하게하는 방법 개발의 중요성을강조5.
인간의 심장 조각을 배양하는 것은 그대로 인간의 심근의 유망한 모델입니다. 이 기술은 인간 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 안정적으로 반영할 수 있는 인간의 심장 조직과 유사한 완전한 3D 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 그 사용은 2018년10,,11,,12까지보고된 가장 강력한 프로토콜을 사용하여 24시간 이상 연장되지 않는 배양물의 생존가능성의 짧은 기간에 의해 심각하게 제한되었다. 이러한 제한은 슬라이스를 배양하기 위한 공기-액체 인터페이스의 사용, 및 심장 조직의 높은 에너지 요구를 지원하지 않는 간단한 배양 배지의 사용 등 여러 요인에 기인하였다. 최근 연속적인 전기자극을 제공할 수 있는 침수배양시스템을 개발하고,13일까지심장조직슬라이스를 지속가능한 상태로 유지하기 위해 배양배지 성분을 최적화하였다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 해소하기 위해 급성 심독성 시험을 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다. 현재 기사에서는 돼지 심장을 예로 사용하여 심장 조각을 자르고 배양하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 인간, 개, 양 또는 고양이 의 마음에도 동일한 과정이 적용됩니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 과학 커뮤니티의 다른 실험실에 기술을 전파하기를 희망합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 절차는 루이빌 대학의 제도적 지침에 따라 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 슬라이스 준비 (슬라이스 하루 전)
- 진동 마이크로토메의 제조
- 다음 단계에 따라 세라믹 블레이드를 홀더에 넣습니다: 블레이드를 조심스럽게 래핑한 후 날카로운 모서리를 먼저 블레이드 도구의 슬롯에 넣습니다. 그런 다음 홀더의 팔에 있는 두 개의 나사를 풀어 홀더에 블레이드를 끼이고 각 와셔 아래에 블레이드를 밀어 넣고 뒤쪽 정지에 단단히 밀어 넣습니다. 나사를 조여 블레이드를 고정합니다.
참고: 나사를 과도하게 조여서는 안됩니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 교정 프로토콜 및 도구를 사용하여 블레이드를 교정합니다.
참고: 간단히, 이동 축과 블레이드의 정렬을 용이하게하고 Z 축 편향을 최소화하기 위해, 진동 마이크로 북은 탈착식 교정 장치를 사용합니다. 교정 장치가 계측기에 연결되면 그 존재가 자동으로 감지되고 진동 마이크로톤은 블레이드의 진폭 및 주파수 설정을 블레이드 정렬 오류를 가장 잘 조정할 수 있는 크기로 조정하는 제어합니다.- 슬라이스 버튼을 눌러 블레이드를 자동으로 이동하여 절삭날이 최상의 정렬 평가를 위해 교정 장치에 비해 최적의 위치에 있도록 정렬 프로세스를 시작합니다. 제공된 드라이버를 사용하여 블레이드를 조정하여 Z 정렬이 1 μm 이내인지 확인하기 위해 화면상의 지침에 따라 블레이드를 조정합니다.
- 내부 욕조와 진동 마이크로토메의 모든 금속 부분을 오토클레이브합니다.
- 다음 단계에 따라 세라믹 블레이드를 홀더에 넣습니다: 블레이드를 조심스럽게 래핑한 후 날카로운 모서리를 먼저 블레이드 도구의 슬롯에 넣습니다. 그런 다음 홀더의 팔에 있는 두 개의 나사를 풀어 홀더에 블레이드를 끼이고 각 와셔 아래에 블레이드를 밀어 넣고 뒤쪽 정지에 단단히 밀어 넣습니다. 나사를 조여 블레이드를 고정합니다.
- 대형 금속 트레이 (슬라이스를 수집하고 전기 자극 플레이트 커버를 담그기 위한), 유리 용기, 일반 직사각형 블레이드, 집게, 가위, 프린터 타이밍 벨트 (6mm 너비로 잘라내기), 금속 와셔 및 이중 증류수 5 L (ddH2O).
- 심전도 용액으로 1 L 항아리, 500 mL 항아리 1 개 및 심장용 플라스틱 트레이 1 개를 소독하고 심전도 용액으로 체외 관류에 담습니다.
- 2 L 비커에 슬라이스 티로드의 용액의 2 L을 준비합니다.
- 슬라이스 티로드 용액 1L의 경우, 3 g/L 2,3-부탄디온 단색(BDM), 140 mM NaCl(8.18 g), 6mM KCl(0.447 g), 10 mM D를 혼합합니다. - 포도당 (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 의 1 M 솔루션), 1.8 mM CaCl2 (1.8 mL 의 1 M 용액), 최대 1 L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000 mL, 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 사용하여 용액을 걸레질하고 밤새 4°C에서 보관합니다.
- 심전도 용액 4 L을 준비하십시오.
- 심전도 용액 1L의 경우, 110 mM NaCl (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL 의 1.19 g), 16 mM KCl (1.19 g), 16 mM MgCl2 (3.25 g), 10 mM NaHCO3 (0.84 g), 1 U/mL heparinin, 최대 1L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000 mL, 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 사용하여 용액을 걸레질하고 밤새 4°C에서 보관합니다.
참고: 슬라이스 당일 심전도 용액에 1,000 U/L 헤파린을 추가하십시오(2.1단계 참조).
- 심전도 용액 1L의 경우, 110 mM NaCl (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL 의 1.19 g), 16 mM KCl (1.19 g), 16 mM MgCl2 (3.25 g), 10 mM NaHCO3 (0.84 g), 1 U/mL heparinin, 최대 1L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000 mL, 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 사용하여 용액을 걸레질하고 밤새 4°C에서 보관합니다.
- 생물 안전 성 캐비닛에 원래 병에 배양 배지의 500 mL을 신선하게 준비 : 혼합 매체 199, 1x 인슐린 트랜스 페린 셀레늄 (ITS) 보충, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 5 ng / mL 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 ng / mL FGF-기본, 및 2x 항생제 항 항. 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 통해 필터를 살균하고 밤새 4°C에서 보관하십시오.
참고: pH를 조절하지 말고, 사용하기 전에 VEGF와 FGF를 신선하게 추가하십시오. - 4% 한천 젤 플레이트를 준비합니다.
- 500 mL 멸균 플라스크에 멸균 된 ddH2O 200 mL를 추가하십시오. 아가로즈 8 g의 무게를 측정하고 플라스크에 부드럽게 붓습니다. 전자레인지에서 2분간 끓인 다음 실온에서 5분간 식힙니다.
- 각 100mm 페트리 접시에 25 mL를 생물 안전 성 캐비닛에 붓고 (6 접시를 준비하십시오) 고형화 될 때까지 1 시간 동안 기다립니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 깨끗한 랩으로 감싸고 4 °C에서 보관하십시오.
- 오토클레이브 ddH2O에서200 증거 절대 에탄올을 희석하여 70% 에탄올 4L를 준비합니다.
- 멸균 된 ddH2O에서 2 x 항생제 항 균제를 준비하십시오 : 생물 안전 성 캐비닛 에서 항생제 항 균제 20 mL와 멸균 된 ddH2O980 mL을 혼합하십시오.
2. 돼지 심장 관류
- 심전소 용액 1L에 1mL의 1mL의 U/mL 헤파린을 추가하십시오. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 조직 배양실로 이송되는 동안 심장의 관류 및 보존을 위해 적어도 3L이 필요하다. - 돼지 수술실에 다음 항목을 가져 가라: 얼음으로 가득 찬 큰 얼음 양동이 1 개, 멸균 된 금속 트레이 1 개 (심장 관류를위한 얼음 양동이에 보관), 살균 된 500 mL 항아리 1 개, 1 L 항아리 (심장 전도액에서 심장을 다시 조직 배양실로 옮기기 위해) , 얼음에), 얼음으로 가득 한 살균 플라스틱 트레이 (얼음에 심전도 용액을 유지하기 위해).
- 3방향 스톱콕, 60mL 주사기, 18G 나비 바늘 카테터 및 심전도 용액 저장소에 연장 튜브를 포함하는 내부 심장 관류 시스템을 준비합니다.
- 요크셔 수컷 돼지(생후 2-3개월, 20-25kg)를 케타민(20 mg/kg)/자일라진(2 mg/kg) 칵테일로 먼저 마취시금으로 마취시다. 턱 긴장의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 이어서, 돼지를 수술실로 옮기고, 앞서 설명한 바와 같이 폐를 삽관하고 기계적으로환기시키는 14.
- (1.5-2%)로 마취 유지 이소플루란.
- 동물을 오른쪽 측면 위치에 놓고 가슴 부위에서 털을 면도합니다. 알코올 스크럽으로 피부를 청소한 다음 10 % (v) 포비도 - 요오드 용액으로 수술 부위를 살균하십시오.
- 왼쪽 흉부 절개에 의해 가슴을 열고 4번째 늑간 공간에서 메스를 사용하여 가슴을 열고 갈비뼈 사이에 흉부 리트랙터를 사용하여 가슴을 열고 심장을 노출시다.
참고: 이 절차에 는 모든 멸균 된 기구를 사용하십시오. - 나비 바늘 카테터를 왼쪽 심방으로 삽입하고 지갑 끈 잠금 장치로 바늘을 고정합니다. 헤파린 (100 U /kg)의 볼루스 용량의 정맥 주사 후, 왼쪽 심방 카테터를 통해 얼음 차가운 심전도 용액 500 mL (심박수 감속)으로 심장을 정력하기 시작합니다.
- 5 % 이소플루란으로 돼지를 깊이 마취시다. 외과 용 가위로 가슴에서 심장을 신속하게 절제하십시오. 대동맥을 대동맥 캐뉼라로 칸막이에 담고 체외에서 심장을 다른 1L의 얼음 차가운 심전도 용액(100 mL/min)으로 침전하여 혈관 내 혈액을 씻어냅니다.
- 심장 관류 후, 얼음으로 차가운 심전도 용액으로 채워진 1 L 항아리에 심장을 유지하고 조직 배양실로 옮기는 동안 얼음을 유지하십시오.
3. 돼지 심장 조직 슬라이스
- 진동에 티슈 목욕을 설정하고, 티슈 목욕 냉각 재킷에 얼음을 추가 한 다음 티로드의 용액을 티슈 욕조에 추가하십시오. 티슈 목욕 냉각 재킷에서 녹은 얼음의 처리를 수집하기 위해 1L 플라스틱 항아리를 설정합니다.
- 생체 안전 성 캐비닛에서 돼지 심장을 신선한 차가운 심전도 용액 1 L이 들어있는 트레이로 옮니다.
- 개폐식 멸균 메스를 사용하여 좌심실을 분리하기 위해 심장을 해부하십시오. 그런 다음 면도기 직사각형 블레이드를 사용하여 좌심실을 각각 1-2cm3 블록으로 자른다. 슬라이스에 한 조각을 사용하고 필요한 경우 나중에 절단 얼음에 차가운 Tyrode의 용액에 50mL 튜브에 남아있는 유지.
참고: 특히 두 번째 블록인 경우 손으로 자르기 전에 조직을 마사지하십시오. 마사지는 올바른 근육 섬유 구성을 복원하는 데 도움이 심장 블록 내의 강성을 방지할 수 있습니다. - 금속 샘플 홀더에 1-2 방울의 티슈 접착제(재료 표)를넣고 표면적이 약 1cm2인4 % 한천 블록 조각을 붙입니다.
- 한천에 티슈 접착제 1-2 방울을 넣습니다.
- 심장 에피카듐 측이 조직 접착제를 아래로 향하게하여 한천에 심장 블록을 붙이고 가능한 한 평평한지 확인하십시오. 그런 다음, 심장 블록을 가진 티슈 홀더를 진동의 슬라이스 욕조에서 그 위치로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로
- 슬라이스 욕조에 산소 튜브를 부착하고 슬라이스 (산소 Tyrode의 목욕)를 수집하기위한 Tyrode의 용액으로 채워진 금속 트레이. 그런 다음 금속 트레이에 40 μm 셀 스트레이너를 추가하여 절단 후 슬라이스를 수집합니다.
- 슬라이싱 위치 조정
- 진동 작동 소프트웨어와 대시보드를 사용하여 블레이드/샘플의 높이를 조정합니다. 높이 버튼을 선택하고 높이를 조정하기 위한 화면 지침을 따릅니다. 이상적으로는 블레이드를 조직의 상단에 가까이 있지만 유두 근육 아래에 있고 자르기 전에 조직과 블레이드를 덮는 액체가 있는지 확인하십시오.
- 사전 버튼을 선택하여 조직을 슬라이스 시작할 위치를 조정합니다. 슬라이스 버튼을 누르고 노브를 사용하여 블레이드를 티슈 가장자리쪽으로 이동하여 속도를 높입니다. 그런 다음 슬라이스를 다시 눌러 중지하고 진행 버튼을 눌러 프로세스를 비활성화합니다.
- 절삭 파라미터 조정: 전진 속도 = 0.03mm/s, 진동 주파수 = 80Hz, 수평 진동 진폭 = 2mm. 그런 다음 슬라이스 단추를 선택하여 슬라이스를 시작합니다.
- 비브라토임슬라이스가 조직의 끝에 도달할 때까지 슬라이스하지만 시편 홀더의 백 엔드에 닿기 전에 슬라이스합니다. 이 때 슬라이스를 다시 눌러 중지합니다. 돌아가기 버튼을 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.
- 자동 반복(두 번 클릭)을 선택하면 진동 마이크로토임이 최대 99회 까지 슬라이스 프로세스를 자동으로 반복할 수 있습니다.
- 슬라이스 수집
- 슬라이스가 전체 길이가 될 때까지 기다렸다가 (유두 근육 층을 지나간 후) 슬라이스수집을 시작합니다.
- 차가운 Tyrode의 용액으로 채워진 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조각을 모아 부드럽게 욕조에서 티슈를 잡습니다. 필요한 경우, 조직이 여전히 부착되어 있는 경우 집게와 스프링 가위를 사용하여 심장 블록에서 슬라이스를 해리합니다.
- 산소를 공급받은 Tyrode의 욕조에서 슬라이스를 하나의 세포 스트레이너로 옮기고(단계 3.7 참조) 플라스틱 파스퇴르 피펫의 액체를 사용하여 조직을 세포 스트레이너 중 하나에 평평하게 눕힌 다음, 위에 금속 와셔를 추가하여 조직을 아래로 유지합니다.
참고: 슬라이스는 처리하기 전에 Tyrode의 용액에서 적어도 1 시간 동안 배양되어야합니다 (이것은 BDM이 조직을 이완시키기위한 것입니다).
4. 심장 조각 을 배양
-
문화용 슬라이스 준비
- 가장자리에서 슬라이스를 잘라서 고르지 않은 가장자리를 방지합니다. 그런 다음, 조직 접착제를 사용하여 내장 된 금속 와이어와 살균 폴리 우레탄 6mm 폭 프린터 타이밍 벨트에 양쪽 끝에서 접착제.
- 지원되는 심장 조각을 각 웰에 6 mL의 배양 배지를 포함하는 6 개의 웰 플레이트로 옮김을 옮김.
- 자극 플레이트 커버(표 의재료)를6웰 플레이트의 상부에 놓고 커버를 세포 배양 전기 자극기(재료표)에 연결한다.Table of Materials 자극기를 조정하여 항상 10V, 1.2Hz에서 심장 슬라이스를 전기적으로 자극합니다.
참고 : 자극을 연결 한 후, 심장 조각이 이길 시작하고,이 운동은 시각적으로 분명 할 것이다. - 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 가습 공기와 5%CO2로37°C에서 유지한다.
- 배양 배지를 하루에 3회 변경하고 각 미디어 변경 시 웰당 6 mL의 배양 배지를 추가합니다.
참고: 배양 배지는 각 배지 변화 전에 5분 동안 산소화된다. 매체는 하루에 적어도 1 배 를 변경해야합니다. 필요한 경우 주말에 괜찮습니다. 하루에 단 1개의 미디어 변경이 테스트되는 최대값입니다. -
배양 배지에서 독성 흑연 입자의 방출을 방지하기 위해 매일 자극 플레이트 커버를 변경합니다 (일반적으로 중일 배지 변화 중).
- 배양 접시에서 자극 플레이트 커버를 제거하고 커버가 전기 회로에 대한 물 손상을 방지하기 위해, 세포 배양 전기 자극기 케이블에 연결되는 흰색 폼 플러그를 삽입합니다.
- 2 x 항생제 항 균제와 오토 클레이브 워터의 목욕에 접시 커버를 놓습니다. 하룻밤 동안 이 욕조(즉, 헹구기 욕조)에 보관하십시오.
- 다음날, 플레이트 커버를 70% 에탄올 욕조에 5-15분 동안 옮겨 오염을 제거합니다. 목욕을 전환하기 전에 장치에서 많은 액체를 떨어 뜨리지 않도록하십시오.
- 그런 다음 플레이트 커버를 오토클레이브 워터와 2 배 항균 항균제로 구성된 세 번째 및 마지막 욕조 (즉, 깨끗한 목욕)로 옮겨 남은 에탄올 흔적을 헹구고 있습니다.
- 깨끗한 욕조에서 플레이트 커버를 헹구고 나서 깨끗한 보풀이없는 닦아 (에탄올로 뿌리내린)를 사용하여 플라스틱 부품의 잔류 물을 말린 다음 흰색 거품 조각을 제거하고 플레이트 커버를 배양 판에 조심스럽게 놓습니다.
참고: 장치가 더 이상 멸균되지 않기 때문에 우물로 들어가는 검은 흑연 전극을 만지지 마십시오. - 멸균 집게를 사용하여 플레이트 커버가 조직에 닿지 않도록 조직이 우물 중앙에 있는지 확인하십시오. 플레이트 커버의 곡선면이 플레이트의 각진 면과 일치하고 사각형 모서리가 정렬되어 있는지 확인합니다.
참고: 자극 플레이트 커버의 오염을 최소화하려면 실험을 마친 후 6개의 웰 플레이트를 깨끗하고 비어 있게 보관하십시오.
- MTT 분석, 칼슘 측정 및 수축 기능 평가를 신선한 돼지 심장 슬라이스(일 0일)에 수행하고,13일후에 배양후.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
시판되는 세포 배양 전기 자극기를 이용하여 8개의 웰 플레이트를 한 번에 수용할 수 있고, 생리적 주파수(1.2 Hz)에서 전기 자극을 유도함으로써 성인 심장 밀리유를 에뮬레이트하고, 배양13에서기능성 돼지 심장 슬라이스의 지속 기간을 연장하기 위해 근본적인 배지 성분에 대해 스크리닝하였다. 돼지와 인간의 마음은 크기와 해부학15가유사하기 때문에 돼지 하트를 사용하여 생체 모방 심장 슬라이스 배양 시스템을 개발하고 이어서 인간의 심장 슬라이스에서 검증했습니다. 여기에서, 우리는 인간적인 심혼 슬라이스 및 배양을 위한 동일 절차인 돼지 심혼 조각을 위한 프로토콜을 상세히 설명했습니다. 여기에 기재된 새로운 생체 모방 배양 설정은 MTT분석(도 1A)에의해 평가된 바와 같이 6일 동안 돼지 심장 슬라이스의 생존가능성을 유지했다. 우리는 그들의 칼슘 항상성과 수축력을 평가하여 6 일 동안 이 조각의 기능적인 생존가능성을 확인했습니다. 처음 6 일 동안 심근 세포에서 자발적인 칼슘 과도 현상이 없으며, 심근 세포는 신선한 심장 슬라이스와 유사한 β-아드레날린 자극뿐만 아니라 외부 전기 자극에 반응했습니다(그림 1B). 또한, 이소프로테레놀에 대한 수축력 및 반응은 신선한 심장 슬라이스와 유사하게 최대 6일 동안 배양된 심장 슬라이스에서 유지된다(도1C,D).
그림 1: 돼지 심장 슬라이스 배양액의 생존 가능성 및 기능 의 유효성 검증. (a)MTT 분석기를 사용하여 시간이 지남에 따라 심장 슬라이스 생존율의 정량화는 최적화된 배지에서 자극되거나 비자극된 배양 시스템에서(n=5 돼지 하트 각각 삼중으로, SEM은 오차 막대로 표현되며, 양방향 ANOVA 시험은 그룹 들, *p&0.05) 사이에서 비교하기 위해 수행되었다. (B)대표적인 칼슘 신호 추적은 신선한 심장 슬라이스(0일째)와 배양(6일째)에서 6일 후 1 μM 이소프로테레놀(Iso) 자극을 가짐유없이 추적한다. 과도는 Fluo-4 칼슘 염료로 심장 조각을 적재하고 기록 시 1 Hz/20 V 전기 자극을 사용한 후에 기록되었습니다. 이소프로테레놀을 통한 자극 유무에 관계없이 칼슘 신호 진폭의 정량화는 배양물에서 0일째와 6일째에 칼슘 과도의 유사한 패턴을 나타낸다(n = 4 돼지 하트, 각각에서 분석된 10-15개의 셀은, SEM은 에러 막대로 표현되고, 양방향 ANOVA 시험은 그룹 들 간 비교를 위해 수행되었으며, *p&0.05 는 동일한 시점에서 Iso 자극에 대한 기준선을 비교하고, p-값D0 대 D6 = 0.95, 및 p-값D0 ISO 대 D6 ISO = 0.93)을 비교하였다. (C)수축력 평가 설정(왼쪽 패널); 심장 슬라이스(HS)는 전기 자극을 위해 두 전기 전극(EE) 사이에 힘 변환기(FT)와 안정적인 포스트(P) 사이에 매달려 있습니다. 자극시, 슬라이스 수축 및 수축은 지정된 소프트웨어(오른쪽 패널)를 사용하여 기록됩니다. (D)바 그래프는 신선한 돼지 심장 슬라이스 (일 0)에 의해 생성 된 이소 프로 테 레놀 (Iso)의 존재 또는 부재에서 수축력의 정량화를 나타내고 6 일 후 생물 모방 배양 (n = 4 돼지 하트 각 삼중계체, SEM은 오류 막대로 표현되며, 양방향 ANOVA 테스트는 그룹 간 비교를 위해 수행되었으며, *p&0.05 와 동일한 시점에서 Iso 자극에 대한 기준을 비교하기 위해, 트위치 힘: p-값D0 대 D6 = 0.96, p-값D0 ISO vs D6 ISO = 0.81; 시간 ~ 50% 이완: p-값 D0 대 D6 = 0.47, p 값D0 ISO 대 D6 ISO = 0.43). 이 수치는 Ou et al.13에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 조건 | 피셔외. 16 | 오 외13 |
| 종 | 인간의 | 돼지와 인간 |
| 질병 | 실패한 마음 | 정상적인 건강한 마음 |
| 보존 | 보존 된 조직 | 신선한 조직 |
| 슬라이스 두께 | 300 μm | 300 μm |
| 중간 산소 화 | 아니요 | 간헐적 산소화 |
| 문화 매체 | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| 동요 | 예 | 아니요 |
| 속도 속도 | 0.2 Hz | 1.2 Hz |
| 문화의 지속 시간 | 타협과 4 개월 | 타협하지 않고 6 일 |
| 큐어 온도 | 37 | 37 |
| 기계적 하중 | 보조 로딩 | 로딩 없음 |
| 신선한 심장 슬라이스에 비해 유전자 발현의 변화 없이 테스트된 시간 포인트 | 해당/A | 2일 및 6일 |
| 유전자 발현의 변화를 보여주는 첫 번째 테스트 시점 | 제 8일 | 제 10일 |
표 1: Fischer 외16및 Ouet.13에사용된 슬라이스 및 배양 조건 간의 비교.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서 우리는 급성 심장 독성을 테스트하기에 충분히 긴 기간 동안 돼지 심장 슬라이스의 배양을 가능하게 하는 단순화된 중간 처리량(최대 48개의 슬라이스/장치) 방법에 대한 우리의 최근 발표된 방법에 대한 상세한 비디오 프로토콜을 설명합니다13. 제안된 조건은 전기 자극의 주파수, 영양 가용성 및 간헐적인 산소화를 포함하여 심혼의 환경을 모방합니다. 우리는 우리의 생체 모방 자극 문화에 심장 슬라이스의 장기간 생존은 그대로 심장에 의해 경험 생리 조건을 재현에 우리의 초점에 속성. 이 개념은 필수 영양소를 제공하지 않고 전기 자극만으로는 심장 슬라이스 생존력을 유지하기에 충분하지 않다는 것을 보여주는 데이터에 의해 지원된다13. 따라서, 배양 매체의 새로운 구성 요소는 배양에서 심장 슬라이스 생존 력 및 기능을 연장시키는 주요 동인이다. 우리는 생존력을 유지하기 위해 배지에 FBS를 포함하는 것이 필수적이라는 것을 발견했으며, 이는 다양한 지방산, 미량 원소, 효소, 단백질, 거대분자, 화학 성분 및 호르몬에 대한 요구사항으로 인해 가능하며, 이는 일반적으로 혈청에 존재하고 생체내심장 조직으로 전달된다. 더욱이, 조직 생존력을 향상시키기 위해 배양배지에 FGF 및 VEGF를 첨가하는 것이 필요하다는 것을 발견하였다. FGF 및 VEGF는 배양된 내피 세포의 유지에 필수적인 혈관신생인자(18)로알려져 있다. 따라서, FGF 및 VEGF는 조직 생존을 지원하기 위해 배양에서 내피 세포 및 결합 조직을 유지하는 데 필요할 가능성이 높다. 우리의 작업은 심장 조각을 배양하기 위해 이전에 보고된 단순화된 배양 매체를 수정하는 첫번째이고, 후속 연구 결과에서 매체 분대의 추가 최적화를 위한 가능성을 열어줍니다.
우리의 새로운 방법과 적시에, 생물 공학 시스템16,,19,,20에서배양슬라이스를 유지하는 데 지속적인 전기 기계적 자극의 중요성을 입증 한 세 가지 다른 연구가 있었다. 그러나, 이러한 연구는 기저 M199/ITS 매체를 사용, 심장 슬라이스의 신진 대사 요구를 유지 하기에 충분 하지 않습니다. 이는 배양,16,,19,20동안 초기에 슬라이스 수축성 및 칼슘 항상성에 여러 가지 타협을 초래했다. Qiao 등19는 4일 동안 심장 슬라이스의 전기 생리학적 특성을 유지할 수 있는 고도로 정교한 생체 공학 칩을 개발했지만 수축 기능에 대한 평가는 제공되지 않았습니다. Watson 등20은 24시간 동안 심장 근육 특성유지를 위한 확장기 sarcomere 길이의 중요성을 입증하기 위해 낮은 처리량 배양 시스템(최대 4개의 슬라이스/장치 처리)을 생체 공학화했습니다. 마지막으로, Fischer등. 16 실패 인간의 심장 슬라이스는 생명 공학 장치에서 0.2 Hz 자극, 보조 로딩 및 미디어 교반 에서 배양 될 때 최대 4 개월 동안 시험관 내에서 유지 될 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이러한 조건은 그들의 RNAseq 데이터에 반영된 바와 같이, 심장 슬라이스의 다양한 변화를 유도하였는데, 이는 심장 유전자 발현의 10배 이상 하향조절을 초기에평가(8일째)16으로나타났다. 그러나, 최적화된 배양 시스템에서는, 2 및 5개의 전사체만이 각각 신선한 심장 조직에 비해 배양에서 2일 및 6일 후에 현저하게 차별화적으로 발현되었다. 그러나, 문화에서 10 일 후에, 500 개 이상의 전사체의 발현에 있는 중요한 변경이 있었습니다. 배양에서 10일 후에 하향 조절된 유전자는 주로 심장 근육과 관련이 있었고, 반면에 업레테니컬 유전자는 섬유아세포, 세포외 기질 및 염증13과관련이 있었다. 표 1은 Fischer 외16및 Ou et.13 사이의 슬라이스 및13배양 프로토콜의 전체 비교를 포함한다. 따라서, 우리의 생체 모방 자극 배양 시스템은 심장이 경험하는 제어 가능한 조건을 에뮬레이트하여, 따라서, 손상된 배양 시스템에 비해 급성 심독성 또는 효능에 관한 약물 치료의 기능적 및 구조적 결과의 신뢰할 수 있는 판독을 제공해야 한다.
이 문화 시스템의 주요 한계 중 하나는 우리의 문화 시스템이 여러 생리적 조건을 에뮬레이트 할 수 있지만, 심장 수축 주기 동안 기계적 하중과 전단 스트레스의 변화를 모방 할 수 없다는 것입니다. 생리적 및 대사 적 요인의 추가 최적화는 심장 슬라이스 생존력과 기능을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 추가적으로, 우리는 심장 슬라이스 생존의 악화를 선동할 지도 모르다 산화 인산화의 감소로 이끌어 내는 초기 적응을주의했습니다 13. 불행히도, 지금까지, 우리는 산화 인산화를 유지하기 위한 최적의 방법을 식별할 수 없었습니다. 그것은 가능성이 심장 슬라이스에 지방산 대사를 강화 하는 것은 성장 매체에 지방산을 추가 하는 것 처럼 간단 하지 않습니다., 그리고 추가 최적화를 필요로 합니다., 향후 연구에서 해결 될 수 있는. 게다가, 이 접근의 일반적인 약점은 심전도 및 심실 부정맥에 있는 중단을 설명하기 위하여 필수적인 심혼 슬라이스 내의 단 하나 심근세포에 활동 잠재력의 누락한 측정입니다. 따라서 심전도의 중단을 유도하고 분리 된 심근 세포에 대한 행동 잠재력에 미치는 영향을 평가하는 심전도 소동으로 치료 후 심장 슬라이스에서 단일 심근 세포를 분리하는 프로토콜을 최적화 할 필요가 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM은 테나야 테라퓨틱스의 지분을 보유하고 있습니다. 다른 작성자는 충돌을 보고하지 않습니다.
Acknowledgments
TMAM은 NIH 교부금 P30GM127607 및 미국 심장 협회 보조금 16SDG29950012에 의해 지원됩니다. RB는 P01HL78825 및 UM1HL113530에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
