Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å skjære og kultur hjertevev under fysiologiske forhold i 6 dager. Dette kultursystemet kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye hjertesvikt terapeutiske samt pålitelig testing av akutt kardiotoksisitet i en 3D hjertemodell.
Abstract
Mange nye legemidler mislykkes i kliniske studier på grunn av kardiotoksiske bivirkninger som for tiden tilgjengelig in vitro analyser og in vivo dyremodeller dårlig forutsi menneskelige hjertegjeld, utgjør en multi-milliard-dollar byrde på den farmasøytiske industrien. Derfor er det et verdensomspennende udekket medisinsk behov for bedre tilnærminger for å identifisere narkotika kardiotoksisitet før du foretar kostbart og tidkrevende "første i mennesket" studier. Foreløpig brukes bare umodne hjerteceller (humanindusertpluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter [hiPSC-CMs]) til å teste terapeutisk effektivitet og legemiddeltoksisitet, da de er de eneste menneskelige hjertecellene som kan dyrkes i lengre perioder nødvendig for å teste legemiddeleffekt og toksisitet. En enkelt celletype kan imidlertid ikke replikere fenotypen til det komplekse 3D-hjertevevet som er dannet av flere celletyper. Viktigere, effekten av narkotika må testes på voksne kardiomyocytter, som har forskjellige egenskaper og toksisitetsresponser sammenlignet med umodne hiPSC-CMs. Culturing menneskelige hjerteskiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett flercellet system som etterligner det menneskelige hjertevevet og gjenspeiler de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Nylig, gjennom optimalisering av kulturmediekomponenter og kulturforholdene for å inkludere kontinuerlig elektrisk stimulering på 1,2 Hz og intermitterende oksygenering av kulturmediet, utviklet vi et nytt kultursystemoppsett som bevarer levedyktighet og funksjonaliteten til menneske- og grisehjerteskiver i 6 dager i kulturen. I den nåværende protokollen beskriver vi metoden for kutting og kuling av grisehjerte som et eksempel. Den samme protokollen brukes til å dyrke skiver fra menneske, hund, sauer eller kattehjerter. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting som lukker gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater.
Introduction
Legemiddelindusert kardiotoksisitet er en viktig årsak til markedsuttak1. I det siste tiåret av20-tallet ble åtte ikke-kardiovaskulære legemidler trukket tilbake fra markedet da de resulterte i plutselig død på grunn av ventrikulære arytmier2. I tillegg kan flere anti-kreft behandlinger (mens i mange tilfeller effektiv) føre til flere kardiotoksiske effekter inkludert kardiomyopati og arytmier. For eksempel kan både tradisjonelle (f.eks. antracykliner og stråling) og målrettet (f.eks trastuzumab) brystkreftbehandling føre til kardiovaskulære komplikasjoner hos en undergruppe av pasienter3. Et nært samarbeid mellom kardiologer og onkologer (via det nye feltet av "kardio-onkologi") har bidratt til å gjøre disse komplikasjonene håndterbare for å sikre at pasientene kan behandles effektivt2. Mindre klare er kardiovaskulære effekter av nyere midler, inkludert Her2 og PI3K hemmere, spesielt når terapi brukes i kombinasjon. Derfor er det et økende behov for pålitelige prekliniske screeningstrategier for kardiovaskulærtoksisitet forbundet med nye anti-kreftbehandlinger før kliniske studier hos mennesker. Mangelen på tilgjengelighet av kultursystemer for menneskelig hjertevev som er funksjonelt og strukturelt levedyktig for mer enn 24 timer er en begrensende faktor for pålitelig kardiotoksisitetstesting. Derfor er det et presserende behov for å utvikle et pålitelig system for å kule menneskelig hjertevev under fysiologiske forhold for testing av legemiddeltoksisitet.
Den siste overgangen mot bruk av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) i kardiotoksisitetstesting har gitt en delvis løsning for å løse dette problemet; Imidlertid er den umodne naturen til hiPSC-CMs og tap av vevsintegritet sammenlignet med flercellet natur hjertevevet store begrensninger i denne teknologien4. En fersk studie har delvis overvunnet denne begrensningen gjennom fabrikasjon av hjertevev fra hiPSC-CMs på hydrogeler og utsette dem for gradvis økning i elektrisk stimulering over tid5. Imidlertid oppnådde deres elektromekaniske egenskaper ikke modenhet sett i det voksne menneskelige myokardiet. Videre er hjertevevet strukturelt mer komplisert, som består av ulike celletyper, inkludert endotelceller, nevroner og ulike typer stromal fibroblaster knyttet sammen med en svært spesifikk blanding av ekstracellulære matriseproteiner6. Denne heterogeniteten til den ikke-kardiomycytcellepopulasjonen7,8,9 i voksen pattedyrhjerte er et stort hinder for modellering av hjertevev ved hjelp av individuelle celletyper. Disse store begrensningene understreker viktigheten av å utvikle metoder for å muliggjøre kultur av intakt hjertevev for optimale studier som involverer fysiologiske og patologiske forhold i hjertet5.
Culturing menneskelige hjerte skiver er en lovende modell av intakt menneskelig myokardiet. Denne teknologien gir tilgang til et komplett 3D flercellet system som ligner på det menneskelige hjertevevet som på en pålitelig måte kan gjenspeile de fysiologiske eller patologiske forholdene i det menneskelige myokardiet. Bruken har imidlertid vært sterkt begrenset av den korte perioden med levedyktighet i kultur, som ikke strekker seg utover 24 timer ved hjelp av de mest robuste protokollene rapportert før 201810,11,12. Denne begrensningen skyldtes flere faktorer, inkludert bruk av luftflytende grensesnitt for å dyrke skivene, og bruk av et enkelt kulturmedium som ikke støtter hjertevevets høye energiske krav. Vi har nylig utviklet et nedsenket kultursystem som er i stand til å gi kontinuerlig elektrisk stimulering og optimalisert kulturmediekomponentene for å holde hjertevevskiver levedyktigi opptil 6 dager13. Dette kultursystemet har potensial til å bli et kraftig prediktivt menneske in situ-modell for akutt kardiotoksisitetstesting for å lukke gapet mellom prekliniske og kliniske testresultater. I den nåværende artikkelen beskriver vi protokollen for kutting og kuling av hjerteskiver ved hjelp av et grisehjerte som et eksempel. Den samme prosessen brukes på menneske,hund, sau eller kattehjerter. Med denne protokollen håper vi å spre teknologien til andre laboratorier i det vitenskapelige samfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer var i samsvar med de institusjonelle retningslinjene til University of Louisville og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse til kutting (en dag før kutting)
- Tilberedning av vibrerende mikrotome
- Plasser det keramiske bladet i holderen ved å følge disse trinnene: Etter nøye å ha pakket bladet, plasser den skarpe kanten først inn i sporet på bladverktøyet. Deretter monterer du bladet i holderen ved å løsne de to skruene på armene på holderen og skyv bladet under hver skive og skyv det godt tilbake mot de bakre stoppene. Stram til skruene for å feste bladet.
MERK: Skruene skal ikke strammes for mye. - Kalibrer bladet ved hjelp av kalibreringsprotokollen og -verktøyene i henhold til produsentens protokoll.
MERK: Kort sagt, for å lette justeringen av bladet med aksen av reise og for å minimere Z-aksens nedbøyninger, bruker vibrerende mikrotome en demonterbar kalibreringsenhet. Når kalibreringsenheten er koblet til instrumentet, oppdages tilstedeværelsen automatisk, og vibrerende mikrotome vil ta kontroll over justeringen av amplituden og frekvensinnstillingene til bladet til en størrelsesorden som best tillater justering av bladjusteringsfeilen.- Trykk på Slice-knappen for å starte justeringsprosessen som automatisk vil flytte bladet slik at skjærekanten er i optimal posisjon i forhold til kalibreringsenheten for best justeringsevaluering. Følg instruksjonene på skjermen for å foreta justeringer av bladet ved hjelp av den medfølgende skrutrekkeren for å sikre at Z-justeringen er innenfor 1 μm.
- Autoklav det indre badet og alle metalldelene av vibrerende mikrotome.
- Plasser det keramiske bladet i holderen ved å følge disse trinnene: Etter nøye å ha pakket bladet, plasser den skarpe kanten først inn i sporet på bladverktøyet. Deretter monterer du bladet i holderen ved å løsne de to skruene på armene på holderen og skyv bladet under hver skive og skyv det godt tilbake mot de bakre stoppene. Stram til skruene for å feste bladet.
- Autoklav de store metallbrettene (for å samle skiver og soaking de elektriske stimuleringsplatedekslene), eventuelle glassbeholdere, vanlige rektangelblader, tang, saks, skrivertimingbelte (kutt dem i 6 mm brede stykker), metallskiver og 5 L dobbeltdestillert vann (ddH2O).
- Steriliser en 1 L krukke, en 500 ml krukke og en plastbrett for hjertet in situ og in vitro perfusjon med kardioplegisk oppløsning.
- Forbered 2 L av den kutteNde Tyrodes løsning i et 2 L beger.
- For 1 L av den kuttende Tyrodes oppløsning, bland 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml oppløsning på 1 m), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml oppløsning), opptil 1 l ddH2O. Juster pH til 7,40 ved hjelp av NaOH. Deretter filtrerer du løsningen med et 1000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem og oppbevares ved 4 °C over natten.
- Forbered 4 L av kardioplegisk oppløsning.
- For 1 L av kardioplegisk oppløsning, bland 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml oppløsning på 1 m), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparin, opptil 1 L ddH2O. Juster pH til 7,40 ved hjelp av NaOH. Deretter filtrerer du løsningen med et 1000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem og oppbevares ved 4 °C over natten.
MERK: Tilsett 1000 U/L heparin i kardioplegiløsning dagen for kutting (se trinn 2.1).
- For 1 L av kardioplegisk oppløsning, bland 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml oppløsning på 1 m), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparin, opptil 1 L ddH2O. Juster pH til 7,40 ved hjelp av NaOH. Deretter filtrerer du løsningen med et 1000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem og oppbevares ved 4 °C over natten.
- Nyforberede 500 ml kultur medium i den opprinnelige flasken i en biosikkerhet kabinett: bland medium 199, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) supplement, 10% føtal storfe serum (FBS), 5 ng / ml vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), 10 ng / ml FGF-grunnleggende, og 2x antibiotika-antimykotisk. Filtrer steriliser gjennom 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem og oppbevar esi ved 4 °C over natten.
MERK: Ikke juster pH, tilsett VEGF og FGF ferskt før bruk. - Forbered 4% agar gelplater.
- Tilsett 200 ml sterilisert ddH2O i en 500 ml sterilisert kolbe. Vei 8 g agarose, og hell forsiktig i kolben. Kok i 2 min i mikrobølgeovn, deretter avkjøl i 5 min ved romtemperatur.
- Hell 25 ml i hver 100 mm Petriskål i et biosikkerhetsskap (lag 6 retter) og vent på 1 t for å stivne. Deretter forsegleplatene med parafinfilm, pakk med ren wrap, og lagre ved 4 °C.
- Forbered 4 L 70% etanol ved å fortynne 200-bevis absolutt etanol i autoklet ddH2O.
- Forbered 2x antibiotika-antimykotisk i sterilisert ddH2O: bland 980 ml sterilisert ddH2O med 20 ml antibiotika-antimykotisk under biosikkerhetsskapet.
2. Gris hjerte perfusjon
- Tilsett 1 ml 1000 U/ml heparin til hver 1 L kardioplegisk oppløsning. Hold løsningen på is.
MERK: Minst 3 L er nødvendig for perfusjon og bevaring av hjertet under overføring til vevkulturrommet. - Ta følgende elementer til griskirurgirommet: en stor isbøtte full av is, ett sterilisert metallbrett (hold deg på isbøtte for hjerteperfusjon), en sterilisert 500 ml krukke, en 1 L krukke (for å overføre hjertet i kardioplegiløsning tilbake til vevkulturrommet , på is), og ett sterilisert plastbrett fullt av is (for å holde kardioplegisk løsning på is).
- Forbered et in-situ hjerteperfusjonssystem som inneholder en 3-veis stoppekran, en 60 ml sprøyte, et 18 G sommerfuglnålkateter og forlengelsesrør til kardioplegisk løsningsreservoar.
- Bedøve Yorkshire hanngris (2-3 måneder gammel, 20–25 kg) først med en intramuskulær injeksjon av en ketamin (20 mg/kg)/xylazin (2 mg/kg) cocktail. Bekreft riktig anestesi ved tap av kjevespenning. Deretter overfører grisen til operasjonsrommet, intuberer og mekanisk ventilerlungene som tidligere beskrevet14.
- Opprettholde anestesi med (1,5−2 %) isoflurane.
- Plasser dyret på høyre sidestilling og barber pelsen fra brystområdet. Rengjør huden med alkoholskrubb, og steriliser deretter det kirurgiske stedet med 10 % (w/v) povidon-jodoppløsning.
- Åpne brystet ved venstre thoracotomy snitt ved hjelp av en skalpell på 4th intercostal plass, og bruk en brystretraktor mellom ribbeina for å holde brystet åpent og utsette hjertet.
MERK: Bruk alle steriliserte instrumenter til denne prosedyren. - Sett sommerfuglnålkateteret inn i venstre atrium og fest nålen med en veskestrenglukking. Etter intravenøs injeksjon av en bolusdose heparin (100 E/kg), begynner du å perfuse hjertet in situ med 500 ml iskald kardioplegisk oppløsning (for å bremse hjertefrekvensen) via venstre atriekateter.
- Dypbedøve grisen med 5% isoflurane. Raskt avgiftsvis hjertet ut av brystet med kirurgisk saks. Kanyle aorta med en aorta kanyle og perfuse hjertet in vitro med en annen 1 L iskald kardioplegisk oppløsning (100 ml / min) for å skylle ut vaskulatur blod.
- Etter hjerteperfusjon, hold hjertet i en 1 L krukke fylt med iskald kardioplegi løsning og holde på is under overføring til vev kulturrommet.
3. Gris hjerte vev kutting
- Sett opp vevebadet på vibratomen, legg is til vevsbadetkjølejakke, og legg deretter Tyrodes løsning inn i vevsbadet. Sett opp 1 L plastkrukke for å samle avhending av smeltet is fra vevsbadetkjølejakke.
- Under biosikkerhetsskapet overfører du grisehjertet til et brett som inneholder 1 l frisk kald kardioplegisk oppløsning.
- Dissekere hjertet for å isolere venstre ventrikkel ved hjelp av uttrekkbare sterile skalpell. Deretter skjærer du venstre ventrikkel i blokker på 1-2 cmhver ved hjelp av barberrektangelblader. Bruk ett stykke til kutting og hold de resterende bitene i et 50 ml rør i kaldt Tyrodes løsning på is for kutting senere, om nødvendig.
MERK: Masser vevet før du kutter med hendene, spesielt hvis dette er den andre blokken. Massering bidrar til å gjenopprette riktig muskelfiber konfigurasjon og forhindrer stivhet i hjerteblokken. - Tilsett 1-2 dråper vevlim (Materialbord) til metallprøveholderen og fest et stykke av 4% agarblokken med et overflateareal på ca. 1 cm2.
- Tilsett 1-2 dråper vevlim på agaren.
- Hold hjerteblokken til agaren med hjerteepikardiet siden vendt ned på vevlimet og sørg for at den er så flat som mulig. Deretter overfører du vevsholderen med hjerteblokken til sin posisjon i det kuttede badet i vibratomen.
- Fest oksygenrøret til det kuttede badet og metallbrettet fylt med Tyrodes løsning for å samle skivene (oksygenert Tyrodes bad). Deretter legger du til 40 μm cellesiler i metallbrettet for å samle skivene etter kutting.
- Justere skjæreposisjonen
- Bruk vibratome-driftsprogramvaren og dashbordet til å justere høyden på bladet/prøven. Velg høydeknappen, og følg instruksjonene på skjermen for å justere høyden. Ideelt sett har bladet nær toppen av vevet, men under papillærmuskulaturen og sørg for at det er væske som dekker vevet og bladet før kutting.
- Juster hvor du skal begynne å kutte vevet ved å velge forhåndsknappen. Trykk på skiveknappen og øk hastigheten ved hjelp av knappen for å bevege bladet mot kanten av vevet. Trykk deretter på slice igjen for å stoppe, og trykk på forskuddsknappen for å deaktivere prosessen.
- Juster skjæreparametrene: forskuddshastighet = 0,03 mm/s, vibrasjonsfrekvens = 80 Hz og horisontal vibrasjonsamplitude = 2 mm. Deretter begynner du å kutte slice ved å velge slice-knappen.
- La vibratome skjære til den når enden av vevet, men før den treffer baksiden av prøveholderen. På dette tidspunktet trykker du på slice igjen for å stoppe. Trykk på Retur-knappen for å gå tilbake til startposisjonen.
- Velg automatisk gjentakelse (ved å klikke på den to ganger) som gjør det mulig for vibrerende mikrotome å gjenta kuttprosessen automatisk i opptil 99 ganger.
- Samle skiver
- Vent til skiver er full lengde og vises bra (etter å ha kommet forbi papillær muskellag), og begynn deretter å samle skiver.
- Samle skiver ved hjelp av en plast Pasteur pipette fylt med kald Tyrode løsning for å forsiktig ta vevet fra badekaret. Bruk om nødvendig tang og vårsaks for å ta avstand fra skiven fra hjerteblokken hvis vevet fortsatt er festet.
- Overfør skiven til en cellesil i det oksygenerte Tyrodes bad (se trinn 3.7) og bruk væsken i plastpasteurpipetten for å få vevet til å ligge flatt på en av cellesilene, og legg deretter til en metallskive på toppen for å holde vevet nede.
MERK: Skivene må inkuberes minst i 1 h i Tyrodes løsning før behandling (dette er for BDM å slappe av vevet).
4. Å pkulere hjerteskiver
-
Forbereder skiver for kultur
- Trim skiven fra kantene for å unngå ujevne kanter. Lim den deretter fra begge ender til sterilisert polyuretan 6 mm bredt skriverregisterbelte med metallledninger innebygd ved hjelp av vevslim.
- Overfør de støttede hjerteskivene til 6 brønnplater som inneholder 6 ml kulturmedium i hver brønn.
- Plasser stimuleringsplatedekselet (Materialbord) på toppen av 6-brønnplaten og koble dekselet til cellekulturen elektrisk stimulator (Materialbord). Juster stimulatoren for å stimulere hjerteskivene elektrisk ved 10 V, 1,2 Hz kontinuerlig hele tiden.
MERK: Etter at stimuleringen er koblet til, begynner hjerteskivene å slå, og denne bevegelsen vil være visuelt åpenbar. - Overfør platene til en inkubator og vedlikehold ved 37 °C med fuktet luft og 5 % CO2.
- Endre kultur medium 3x per dag og legge til 6 ml kultur medium per brønn under hver medieendring.
MERK: Kulturmedium er oksygenert i 5 min før hver medieendring. Medium må endres minst 1x per dag; dette er greit i helgene om nødvendig. To dager med bare 1 medieendring per dag er det maksimale som testes. -
Endre stimuleringsplatens deksel hver dag for å forhindre frigjøring av giftige grafittpartikler i kulturmediet (vanligvis midt på dagen medieendring).
- Fjern stimuleringsplatedekselet fra kulturfatet og sett inn den hvite skumpluggen der dekselet kobles til kabelen for cellekulturens elektriske stimulator, for å forhindre vannskader på den elektriske kretsen.
- Plasser platedekselet i et bad med autoklavet vann med 2x antibiotika-antimykotisk. Oppbevar den i dette badet (dvs. svåk bad) over natten.
- Neste dag, flytt platedekselet til et 70% etanolbad i 5-15 min for å dekontaminere. Rist av så mye væske fra enheten før du bytter bad.
- Deretter overfører du platedekselet til det tredje og siste badet (dvs. rent bad), som består av autoklaved vann og 2x antibakteriell-antimykotisk, for å skylle eventuelle gjenværende etanolspor.
- Etter svåk av platedekselet i det rene badet, bruk en ren lofri klut (sprayet ned med etanol) for å tørke av restvann på plastdelene, fjern deretter det hvite skumstykket og plasser platedekselet forsiktig tilbake på kulturplaten.
MERK: Ikke berør de svarte grafittelektrodene som går inn i brønnen, da enheten ikke lenger vil være steril. - Bruk sterile tang, sørg for at vevet er i midten av brønnen slik at platedekselet ikke berører vevet. Pass på at den buede siden av platedekselet stemmer overens med den vinklede siden av platen, og at de firkantede hjørnene er på linje.
MERK: For å minimere kontaminering av stimuleringsplatedekslene, hold dem i rene og tomme 6 brønnplater etter at eksperimentet er fullført.
- Utfør en MTT-analyse, kalsiummålinger og kontraktile funksjonsvurderinger på friske grisehjerteskiver (dag 0), og etter 6 dager i kultur i henhold til Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig cellekultur elektrisk stimulator som kan romme åtte 6 brønnplater samtidig, emulerte vi det voksne hjertemiljøet ved å indusere elektrisk stimulering ved fysiologisk frekvens (1,2 Hz), og screenet for de grunnleggende mellomstore komponentene for å forlenge varigheten av funksjonelle grishjerteskiver i kultur13. Siden gris og menneskelige hjerter er like i størrelse og anatomi15, utviklet vi et biomimetisk hjertestykkekultursystem ved hjelp av grishjerter og senere validert det i menneskelige hjerteskiver. Her detaljerte vi protokollen for grishjerteskiver som er den samme prosedyren for menneskelig hjertekutting og kuling. Det nye biomimetiske kulturoppsettet som er beskrevet her, opprettholdt levedyktigheten til grisehjerteskivene i 6 dager som vurdert av MTT-analyse (Figur 1A). Vi bekreftet den funksjonelle levedyktigheten til disse skivene over 6 dager ved å vurdere kalsiumhomeostase og kontraktile kraft. I de første 6 dagene er det ingen spontankalsiumtransienter i kardiomyocytter, og kardiomyocytter reagerte på ekstern elektrisk stimulering samt β-adrenerge stimulering som ligner friske hjerteskiver (figur 1B). I tillegg opprettholdes kontraktilekraften og svarene på isoproterenol i kultiverte hjerteskiver i opptil 6 dager, tilsvarende friske hjerteskiver (Figur 1C,D).
Figur 1: Validering av levedyktigheten og funksjonaliteten til grishjerteskivekulturen. (A) Kvantifisering av hjerteskivelevedyktighet over tid ved hjelp av MTT-analysen i enten stimulert eller ustimulert kultursystem i optimalisert medium (n = 5 grishjerter hver i triplicate, SEM er representert som feilstenger; toveis ANOVA-test ble utført for å sammenligne mellom grupper, *p < 0,05). (B) Representativ kalsiumsignalspor fra en frisk hjerteskive (dag 0) og etter 6 dager i kultur (dag 6) med og uten 1 μM isoproterenol (Iso) stimulering. Transienter ble registrert etter lasting av hjerteskiver med Fluo-4 kalsiumfarget og bruk av 1 Hz/20 V elektrisk stimulering på opptakstidspunktet. Kvantifisering av kalsiumsignalamplitude med og uten stimulering med isoproterenol viser et lignende mønster av kalsiumtransientene på dag 0 og dag 6 i kultur (n = 4 grishjerter, 10-15 celler analysert i hver, SEM er representert som feilfelt; toveis ANOVA-test ble utført for å sammenligne mellom grupper, *p < 0,05 som sammenligner baseline med Iso-stimulering samtidig, p-verdiD0 vs D6 = 0,95 og p-verdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,93). (C) Kontraktile force vurdering oppsett (venstre panel); hjerteskiven (HS) henges mellom en krafttransduser (FT) og en stabil stolpe (P) mellom to elektriske elektroder (EE) for elektrisk stimulering. Ved stimulering registreres skivekontraktene og sammentrekningene ved hjelp av den angitte programvaren (høyre panel). (D) Bar graf viser kvantifisering av kontraktile kraft i nærvær eller fravær av isoproterenol (Iso) generert av friske gris hjerte skiver (dag 0) og etter 6 dager i biomimetisk kultur (n = 4 gris hjerter hver i triplicate, SEM er representert som feilfelt; toveis ANOVA-test ble utført for å sammenligne mellom grupper, *p < 0,05 som sammenligner baseline med Iso-stimulering samtidig, rykningerkraft: p-verdiD0 vs D6 = 0,96, p-verdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; tid til 50% avslapning: p-verdi D0 vs D6 = 0,47, p-verdiD0 Iso vs D6 Iso = 0,43). Dette tallet er endret fra Ou et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilstand | Fischer et al.16 | 13. |
| Arter | Menneskelige | Gris og menneske |
| Sykdom | Sviktende hjerter | Normale sunne hjerter |
| Bevaring | Bevart vev | Friskt vev |
| Slice tykkelse | 300 μm (300 μm) | 300 μm (300 μm) |
| Middels oksygenering | nei | Intermittert oksygenering |
| Kultur Medium | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitasjon | ja | nei |
| Tempohastighet | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Varighet av kulturen | 4 måneder med kompromiss | 6 dager uten kompromisser |
| Kutting Temperatur | 37 | 37 |
| Mekanisk lasting | auxotonisk lasting | ingen lasting |
| Testede tidspunkter uten endring i genuttrykk sammenlignet med frisk hjerteskive | N/a | 2 og 6 dager |
| Første testede tidspunkt for å vise endring i genuttrykk | Dag 8 | Dag 10 |
Tabell 1: Sammenligning mellom kutting og kuling som brukes i Fischer et al.16 og Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi den detaljerte videoprotokollen for vår nylig publiserte metode for forenklet medium gjennomstrømning (prosesser opp til 48 skiver / enhet) metode som muliggjør kultur av gris hjerteskiver for en periode tilstrekkelig lang til å teste akutt kardiotoksisitet13. De foreslåtte forholdene etterligner hjertets miljø, inkludert hyppigheten av elektrisk stimulering, næringstilgjengelighet og intermitterende oksygenering. Vi tilskriver den langvarige levedyktigheten til hjerteskiver i vår biomimetiske stimulerte kultur til vårt fokus på å gjenskape de fysiologiske forholdene som oppleves av det intakte hjertet. Dette konseptet støttes av våre data som viser at elektrisk stimulering alene, uten å gi essensielle næringsstoffer, ikke er tilstrekkelig til å opprettholde hjerteskivelevedyktighet13. Derfor er de nye komponentene i kulturmediet den viktigste driveren for å forlenge hjertet skive levedyktighet og funksjonalitet i kultur. Vi fant at det er viktig å inkludere FBS i mediet for å opprettholde levedyktigheten, noe som sannsynligvis skyldes kravet om en rekke fettsyrer, sporstoffer, enzymer, proteiner, makromolekyler, kjemiske komponenter og hormoner, som vanligvis er tilstede i serum og leveres til hjertevev in vivo17. Videre fant vi at tillegg av FGF og VEGF til kulturmediet er nødvendig for å forbedre vev levedyktighet. FGF og VEGF er kjente angiogene faktorer som er avgjørende for vedlikehold av kultiverte endotelceller18. Derfor er det sannsynlig at FGF og VEGF er nødvendig for å opprettholde endotelceller og bindevev i kultur for å støtte vev levedyktighet. Vårt arbeid er det første til å endre det forenklede kulturmediet som tidligere ble rapportert for å putere hjerteskiver, og det åpner muligheten for ytterligere optimalisering av mediekomponentene i påfølgende studier.
I tide med vår nye metode var det tre andre studier som har vist viktigheten av kontinuerlig elektromekanisk stimulering i å opprettholde skiver i kultur i biokonstruerte systemer16,19,20. Disse studiene brukte imidlertid basal M199/ITS-mediet, som ikke er tilstrekkelig til å opprettholde de metabolske behovene til hjerteskiver. Dette førte til flere kompromisser i skiven kontraktilitet og kalsium homeostase tidlig under kultur16,19,20. Qiao et al.19 utviklet en svært sofistikert bioengineered chips, som kan opprettholde de elektrofysiologiske egenskapene til hjertet skiver i 4 dager, men ingen vurdering av kontraktile funksjonen ble gitt. Watson et al.20 har biokonstruert et lavt gjennomstrømningskultursystem (prosesser opp til 4 skiver /enhet) for å demonstrere viktigheten av diastolisk sarkomerlengde for vedlikehold av hjertemuskelegenskaper i 24 timer. Til slutt har Fischer et al.16 vist at sviktende menneskelige hjerteskiver kan opprettholdes in vitro i opptil 4 måneder når dyrket under 0,2 Hz stimulering, auxotonisk lasting og media agitasjon i en bioengineering enhet. Disse forholdene induserte imidlertid en rekke endringer i hjerteskivene, noe som gjenspeiles i deres RNAseq-data, som viste over 10 nedfellingsregulering av hjertegenuttrykk så tidlig som første gangs vurderingspunkt (dag 8)16. Men i vårt optimaliserte kultursystem ble bare 2 og 5 transkripsjoner betydelig forskjellig uttrykt etter 2 og 6 dager i kultur sammenlignet med friske hjertevev, henholdsvis. Men etter 10 dager i kultur, var det betydelige endringer i uttrykket av over 500 transkripsjoner. De nedregulerte genene etter 10 dager i kulturen var for det meste relatert til hjertemuskelen, mens de upregulerte genene er relatert til fibroblaster, ekstracellulær matrise og betennelse13. Tabell 1 inneholder en full sammenligning av kutt- og kulturprotokoller mellom Fischer et al.16 og Ou et al.13. Derfor emulerer vårt biomimetiske stimulerte kultursystem de kontrollerbare forholdene som oppleves av hjertet in situ, og derfor bør gi en pålitelig avlesning av funksjonelle og strukturelle utfall av narkotikabehandling med hensyn til akutt kardiotoksisitet eller effekt sammenlignet med kompromitterte kultursystemer.
En av de store begrensningene i dette kultursystemet er at selv om vårt kultursystem kan etterligne flere fysiologiske forhold, kan det ikke etterligne endringer i mekanisk belastning og skjærstress under hjertekontraktilesyklusen. Ytterligere optimalisering av fysiologiske og metabolske faktorer kan bidra til å forlenge hjerteskivelevedyktighet og funksjon. I tillegg la vi merke til en tidlig tilpasning som fører til reduksjon av oksidativ fosforylering som kan instigate forverring av hjertet skive levedyktighet13. Dessverre, så langt, var vi ikke i stand til å identifisere en optimal metode for å opprettholde oksidativ fosforylering. Det er sannsynlig at å forbedre fettsyremetabolismen i hjerteskiver ikke er så enkelt som å legge fettsyrer til vekstmediet, og vil kreve ytterligere optimalisering, som kan løses i fremtidige studier. Videre er en generell svakhet i denne tilnærmingen den manglende målingen av handlingspotensialer på enkle kardiomyocytter i hjerteskiven, noe som er viktig for å demonstrere forstyrrelser i elektrokardiogram og ventrikulær arytmi. Derfor er det behov for å optimalisere protokoller for å isolere enkelt kardiomyocytter fra hjerteskiver etter behandling med kardiotoksiner som induserer forstyrrelser i elektrokardiogram og vurderer deres effekt på handlingspotensialet på de isolerte kardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM har egenkapital i Tenaya Therapeutics. De andre forfatterne rapporterer ingen konflikter.
Acknowledgments
TMAM støttes av NIH-stipendet P30GM127607 og American Heart Association stipend 16SDG29950012. RB støttes av P01HL78825 og UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
