Summary
Questo protocollo descrive come affettare e coltura tessuto cardiaco in condizioni fisiologiche per 6 giorni. Questo sistema di coltura potrebbe essere utilizzato come piattaforma per testare l'efficacia di nuove terapie per l'insufficienza cardiaca, nonché test affidabili della cardiotossicità acuta in un modello di cuore 3D.
Abstract
Molti nuovi farmaci falliscono negli studi clinici a causa di effetti collaterali cardiotossici, poiché i saggi in vitro attualmente disponibili e i modelli animali in vivo predicono male le passività cardiache umane, il che rappresenta un onere multimiliardario sull'industria farmaceutica. Pertanto, vi è una necessità medica insoddisfatta in tutto il mondo di approcci migliori per identificare la cardiotossicità dei farmaci prima di intraprendere studi costosi e dispendiosi in termini di tempo "first in man". Attualmente, solo le cellule cardiache immature (cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali umane [hiPSC-CMs]) vengono utilizzate per testare l'efficienza terapeutica e la tossicità dei farmaci in quanto sono le uniche cellule cardiache umane che possono essere coltivate per periodi prolungati necessario per testare l'efficacia e la tossicità del farmaco. Tuttavia, un tipo di singola cellula non può replicare il fenotipo del complesso tessuto cardiaco 3D che è formato da più tipi di cellule. È importante sottolineare che l'effetto dei farmaci deve essere testato sui cardiomiociti adulti, che hanno caratteristiche e risposte di tossicità diverse rispetto ai immaturi hiPSC-CMs. Culturing human heart slices è un modello promettente di miocardio umano intatto. Questa tecnologia fornisce l'accesso a un sistema multicellulare completo che imita il tessuto cardiaco umano e riflette le condizioni fisiologiche o patologiche del miocardio umano. Recentemente, attraverso l'ottimizzazione delle componenti dei mezzi di coltura e le condizioni di coltura per includere la stimolazione elettrica continua a 1,2 Hz e l'ossigenazione intermittente del mezzo di coltura, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di coltura che preserva la vitalità e funzionalità di fette di cuore umano e maiale per 6 giorni in coltura. Nel protocollo attuale, stiamo descrivendo in dettaglio il metodo per affettare e coltivare il cuore di maiale come esempio. Lo stesso protocollo viene utilizzato per la coltura di fette da cuori umani, cani, pecore o gatti. Questo sistema di coltura ha il potenziale per diventare un potente modello predittivo in situ umano in situ per test di cardiotossicità acuta che colma il divario tra i risultati dei test preclinici e clinici.
Introduction
La cardiotossicità indotta da farmaci è una delle principali cause di ritiro del mercato1. Nell'ultimo decennio del XXsecolo, otto farmaci non cardiovascolari sono stati ritirati dal mercato in quanto hanno provocato la morte improvvisa a causa di aritmie ventricolari2. Inoltre, diverse terapie anti-cancro (mentre in molti casi efficace) può portare a diversi effetti cardiotossici tra cui cardiomiopatia e aritmie. Ad esempio, le terapie di cancro al seno sia tradizionali (ad esempio, antracicline e radiazioni) che terapie mirate (ad esempio, trastuzumab) possono provocare complicazioni cardiovascolari in un sottoinsieme di pazienti3. Una stretta collaborazione tra cardiologi e oncologi (attraverso il campo emergente della "cardio-oncologia") ha contribuito a rendere queste complicazioni gestibili assicurando che i pazienti possano essere trattati efficacemente2. Meno evidenti sono gli effetti cardiovascolari degli agenti più recenti, tra cui Her2 e PI3K inibitori, soprattutto quando le terapie vengono utilizzate in combinazione. Pertanto, c'è una crescente necessità di strategie di screening preclinico affidabili per le tossicità cardiovascolari associate alle terapie anti-cancro emergenti prima degli studi clinici sull'uomo. La mancanza di disponibilità di sistemi di coltura per il tessuto cardiaco umano che è funzionalmente e strutturalmente praticabile per più di 24 h è un fattore limitante per test di cardiotossicità affidabili. Pertanto, è urgente sviluppare un sistema affidabile per la coltura del tessuto cardiaco umano in condizioni fisiologiche per testare la tossicità dei farmaci.
Il recente movimento verso l'uso di cardiomiociti derivati da cellule staminali derivate da cellule staminali plurimi indotti dall'uomo (hiPSC-CMs) nei test di cardiotossicità ha fornito una soluzione parziale per affrontare questo problema; tuttavia, la natura immatura degli hiPSC-CM e la perdita di integrità dei tessuti rispetto alla natura multicellulare del tessuto cardiaco sono i principali limiti di questa tecnologia4. Uno studio recente ha parzialmente superato questa limitazione attraverso la fabbricazione di tessuti cardiaci da hiPSC-CMs su idrogel e sottoponendoli ad un graduale aumento della stimolazione elettrica nel tempo5. Tuttavia, le loro proprietà elettromeccaniche non hanno raggiunto la maturità osservata nel miocardio umano adulto. Inoltre, il tessuto cardiaco è strutturalmente più complicato, essendo composto da vari tipi di cellule tra cui cellule endoteliali, neuroni e vari tipi di fibroblasti stromali collegati insieme a una miscela molto specifica di proteine della matrice extracellulare6. Questa eterogeneità della popolazione cellulare non cardiomiocite7,8,9 nel cuore dei mammiferi adulti è un ostacolo importante nella modellazione del tessuto cardiaco utilizzando singoli tipi di cellule. Queste principali limitazioni evidenziano l'importanza di sviluppare metodi per consentire la coltura di tessuto cardiaco intatto per studi ottimali che coinvolgono condizioni fisiologiche e patologiche del cuore5.
Coltivare fette di cuore umano è un modello promettente di miocardio umano intatto. Questa tecnologia fornisce l'accesso a un sistema multicellulare 3D completo che è simile al tessuto cardiaco umano che potrebbe riflettere in modo affidabile le condizioni fisiologiche o patologiche del miocardio umano. Tuttavia, il suo uso è stato fortemente limitato dal breve periodo di redditività nella cultura, che non si estende oltre 24 h utilizzando i protocolli più robusti segnalati fino2018 10,11,12. Questa limitazione era dovuta a molteplici fattori tra cui l'uso dell'interfaccia aria-liquido per la coltura delle fette, e l'uso di un semplice mezzo di coltura che non supporta le elevate esigenze energetiche del tessuto cardiaco. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura sommersi che è in grado di fornire una stimolazione elettrica continua e ottimizzato i componenti dei mezzi di coltura per mantenere le fette di tessuto cardiaco vitali fino a 6 giorni13. Questo sistema di coltura ha il potenziale per diventare un potente modello predittivo in situ umano in situ per i test di cardiotossicità acuta per colmare il divario tra i risultati dei test preclinici e clinici. Nell'articolo attuale, stiamo descrivendo in dettaglio il protocollo per affettare e coltivare le fette di cuore usando un cuore di maiale come esempio. Lo stesso processo viene applicato ai cuori umani, cani, pecore o gatti. Con questo protocollo, speriamo di diffondere la tecnologia ad altri laboratori della comunità scientifica.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali erano conformi agli orientamenti istituzionali dell'Università di Louisville e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione per il taglio (un giorno prima di affettare)
- Preparazione del microtoma vibrante
- Posizionare la lama in ceramica nel suo supporto seguendo questi passaggi: dopo aver accuratamente srotolato la lama, posizionare prima il bordo tagliente nello slot dello strumento lama. Quindi, inserire la lama nel supporto allentando le due viti sulle braccia del supporto e far scorrere la lama sotto ogni lavatrice e spingerla saldamente contro le fermate posteriori. Stringere le viti per fissare la lama.
NOT: Le viti non devono essere troppo strette. - Calibrare la lama utilizzando il protocollo di calibrazione e gli strumenti in base al protocollo del produttore.
NOT: In breve, al fine di facilitare l'allineamento della lama con l'asse di viaggio e per ridurre al minimo le deviazioni dell'asse z, il microtoma vibrante utilizza un dispositivo di calibrazione smortizzabile. Quando il dispositivo di calibrazione è collegato allo strumento la sua presenza verrà rilevata automaticamente e il microtoma vibrante prenderà il controllo della regolazione delle impostazioni di ampiezza e frequenza della lama ad una grandezza che consente meglio la regolazione dell'errore di allineamento della lama.- Premere il pulsante Sezione per avviare il processo di allineamento che sposterà automaticamente la lama in modo che il tagliente sia in posizione ottimale rispetto al dispositivo di calibrazione per una migliore valutazione dell'allineamento. Seguire le istruzioni visualizzate sullo schermo per apportare modifiche alla lama utilizzando il cacciavite fornito per garantire che l'allineamento a z sia entro 1 m.
- Autoclave il bagno interno e tutte le parti metalliche del microtoma vibrante.
- Posizionare la lama in ceramica nel suo supporto seguendo questi passaggi: dopo aver accuratamente srotolato la lama, posizionare prima il bordo tagliente nello slot dello strumento lama. Quindi, inserire la lama nel supporto allentando le due viti sulle braccia del supporto e far scorrere la lama sotto ogni lavatrice e spingerla saldamente contro le fermate posteriori. Stringere le viti per fissare la lama.
- Autoclave i grandi vassoi metallici (per la raccolta delle fette e l'immersione delle coperture della piastra di stimolazione elettrica), eventuali contenitori di vetro, lame rettangolari, pinze, forbici, cintura di temporizzazione della stampante (tagliarli in pezzi larghi 6 mm), rondelle metalliche e 5 L di acqua doppia distillata (ddH2O).
- Sterilizzare un barattolo da 1 L, un barattolo da 500 mL e un vassoio di plastica per il cuore in situ e la perfusione in vitro con la soluzione cardioplegica.
- Preparare 2 L della soluzione di taglio Tyrode in un becher da 2 L.
- Per 1 L della soluzione affettatrice Tyrode, mescolare 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D glucosio (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL di soluzione 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 mL di 1 M soluzione), fino a 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,40 utilizzando NaOH. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtratura/archiviazione a 4 gradi centigradi, 0,22 m, un sistema di filtratura/archiviazione a vuoto e conservarlo a 4 gradi centigradi.
- Preparare 4 L della soluzione cardioplegica.
- Per 1 L della soluzione cardioplegica, mescolare 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL di soluzione 1 M), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, fino a 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,40 utilizzando NaOH. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtratura/archiviazione a 4 gradi centigradi, 0,22 m, un sistema di filtratura/archiviazione a vuoto e conservarlo a 4 gradi centigradi.
NOT: Aggiungere 1.000 U/L heparin nella soluzione di cardioplegia il giorno del taglio (vedere il passaggio 2.1).
- Per 1 L della soluzione cardioplegica, mescolare 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL di soluzione 1 M), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, fino a 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,40 utilizzando NaOH. Quindi, filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtratura/archiviazione a 4 gradi centigradi, 0,22 m, un sistema di filtratura/archiviazione a vuoto e conservarlo a 4 gradi centigradi.
- Preparare appena 500 mL di mezzo di coltura nella bottiglia originale in un armadio di biosicurezza: mescolare il mezzo 199, 1x supplemento insulino-trasferiscirino-selenio (ITS), 10% siero bovino fetale (FBS), 5 ng/mL fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic e 2x antibiotic-antimycotic. Filtrare sterilizzare attraverso il sistema di filtro vuoto/immagazzinamento a 4,22 m e conservare a 4 gradi centigradi durante la notte.
NOT: Non regolare il pH, aggiungere VEGF e FGF appena prima dell'uso. - Preparare il 4% di piatti di gel di agar.
- Aggiungere 200 mL di ddH sterilizzato2O in un flacone sterilizzato da 500 mL. Pesare 8 g di agarose, e versare delicatamente nel pallone. Far bollire per 2 min in un forno a microonde, quindi raffreddare per 5 min a temperatura ambiente.
- Versare 25 mL in ogni piatto Petri da 100 mm in un mobile di biosicurezza (preparare 6 piatti) e attendere 1 h per solidificare. Quindi, sigillare le piastre con pellicola di paraffina, avvolgere con pellicola pulita e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare 4 L del 70% di etanolo diluindo l'etanolo assoluto a prova di 200 a prova di 200 a prova di autoclaved2O.
- Preparare 2x antibiotic-antimycotic in ddH sterilizzato2O: mescolare 980 mL di ddH sterilizzato2O con 20 mL di antibiotico-antimiottico sotto l'armadio di biosicurezza.
2. Perfusione cuore di maiale
- Aggiungere 1 mL di 1.000 U/mL di eparina a ogni 1 L di soluzione cardioplegica. Mantenere la soluzione sul ghiaccio.
NOT: Almeno 3 L sono necessari per la perfusione e la conservazione del cuore durante il trasferimento alla stanza di coltura dei tessuti. - Portare i seguenti oggetti nella sala operatoria dei maiali: un grande secchio di ghiaccio pieno di ghiaccio, un vassoio di metallo sterilizzato (tenere su un secchio di ghiaccio per la perfusione del cuore), un barattolo sterilizzato da 500 mL, un barattolo da 1 L (per trasferire il cuore nella cardioplegia nella stanza della coltura dei tessuti , sul ghiaccio), e un vassoio di plastica sterilizzato pieno di ghiaccio (per mantenere la soluzione cardioplegica sul ghiaccio).
- Preparare un sistema di perfusione del cuore in situ contenente un stopcock a 3 vie, una siringa da 60 mL, un catetere ad ago farfalla da 18 G e un tubo di estensione al serbatoio di soluzione cardioplegica.
- Anestesizza il maiale maschio dello Yorkshire (2-3 mesi-vecchio, 20-25 kg) prima con un'iniezione intramuscolare di un cocktail ketamina (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg). Confermare l'anestesia corretta per la perdita di tensione della mascella. Quindi, trasferire il maiale nella sala operatoria, intubare e ventilare meccanicamente i polmoni come descritto in precedenza14.
- Mantenere l'anestesia con (1,5,2%) isoflurane.
- Posizionare l'animale nella posizione laterale destra e radere la pelliccia dalla zona del torace. Pulire la pelle con scrub alcool, quindi sterilizzare il sito chirurgico con 10% (w/v) povidone-iodio soluzione.
- Aprire il torace con incisione toracotomia sinistra utilizzando un bisturi al 4esimo spazio intercostale, e utilizzare un retrattore toracico tra le costole per tenere il petto aperto ed esporre il cuore.
NOT: Utilizzare tutti gli strumenti sterilizzati per questa procedura. - Inserire il catetere dell'ago farfalla nell'atrio sinistro e fissare l'ago con una chiusura della corda della borsa. Dopo l'iniezione endovenosa di una dose di bolus di eparina (100 U/kg), iniziare a perfondere il cuore in situ con 500 mL di soluzione cardioplegica ghiacciata (per rallentare la frequenza cardiaca) attraverso il catetere atriale sinistro.
- Anesizzare profondamente il maiale con il 5% di isoflurane. Ascise rapidamente il cuore fuori dal petto con le forbici chirurgiche. Cannula con una cannula aortica e perfegi il cuore in vitro con un altro 1 L di soluzione cardioplegica ghiacciata (100 ml/min) per lavare il sangue di vascolatura.
- Dopo la perfusione cardiaca, tenere il cuore in un barattolo da 1 L pieno di soluzione di cardioplegia ghiacciata e tenere il ghiaccio durante il trasferimento nella stanza della coltura dei tessuti.
3. Taglio del tessuto del cuore di maiale
- Impostare il bagno di tessuto sul vibratome, aggiungere ghiaccio alla giacca di raffreddamento bagno tessuto, quindi aggiungere la soluzione di Tyrode nel bagno di tessuto. Impostare 1 L barattolo di plastica per raccogliere lo smaltimento del ghiaccio fuso dalla giacca di raffreddamento bagno tessuto.
- Sotto l'armadio di biosicurezza, trasferire il cuore di maiale in un vassoio contenente 1 L di soluzione cardioplegica fresca e fredda.
- Dissezionare il cuore per isolare il ventricolo sinistro utilizzando bisturi sterili retrattili. Quindi, tagliate il ventricolo sinistro in blocchi di 1-2 cm3 ciascuno utilizzando lame rettangolari di rasoio. Utilizzare un pezzo per affettare e mantenere i pezzi rimanenti in un tubo da 50 mL a freddo soluzione di Tyrode sul ghiaccio per il taglio in seguito, se necessario.
NOT: Massaggiare il tessuto prima di affettare con le mani, soprattutto se questo è il secondo blocco. Massaggiare aiuta a ripristinare la corretta configurazione della fibra muscolare e previene qualsiasi rigidità all'interno del blocco cardiaco. - Aggiungete un pezzo del bloccoTable of Materialsdi agar del 4% con una superficie di circa 1 cm2.
- Aggiungere 1/2 gocce di colla di tessuto sull'agar.
- Attaccare il blocco cardiaco all'agar con il lato dell'epicardio cardiaco rivolto verso il basso sulla colla del tessuto e assicurarsi che sia il più piatto possibile. Quindi, trasferire il supporto del tessuto con il blocco cardiaco alla sua posizione nel bagno affettato del vibratoma.
- Attaccare il tubo di ossigeno al bagno di affettare e al vassoio di metallo riempito con la soluzione di Tyrode per la raccolta delle fette (bagno di Tyrode ossigenato). Quindi, aggiungere 40 ceppi cellulari m nel vassoio di metallo per raccogliere le fette dopo il taglio.
- Regolazione della posizione di sezionamento
- Utilizzando il software di funzionamento vibratoma e il cruscotto, regolare l'altezza della lama / campione. Selezionare il pulsante altezza e seguire le istruzioni visualizzate per regolare l'altezza. Idealmente, avere la lama vicino alla parte superiore del tessuto, ma sotto i muscoli papillari e assicurarsi che ci sia liquido che copre il tessuto e la lama prima di affettare.
- Regolare il punto in cui iniziare a affettare il tessuto selezionando il pulsante di avanzamento. Premere il pulsante di taglio e aumentare la velocità utilizzando la manopola per spostare la lama verso il bordo del tessuto. Quindi, premere di nuovo il fetta per interrompere e premere il pulsante di avanzamento per disattivare il processo.
- Regolare i parametri di taglio: velocità di avanzamento: 0,03 mm/s, frequenza di vibrazione: 80 Hz e ampiezza delle vibrazioni orizzontali : 2 mm. Quindi, iniziare a tagliare selezionando il pulsante della sezione.
- Lasciare che il vibratoma si tagli emetta fino a raggiungere l'estremità del tessuto, ma prima che colpisca la parte posteriore del supporto del campione. A questo punto, premere di nuovo la fetta per interrompere. Premi il pulsante Indietro per tornare alla posizione iniziale.
- Selezionare auto repeat (cliccando due volte) che permetterà al microtoma vibrante di ripetere automaticamente il processo di affettatura per un massimo di 99 volte.
- Raccolta di sezioni
- Attendere fino a quando le fette sono a lunghezza intera e appaiono buone (dopo aver superato gli strati muscolari papillari), quindi iniziare a raccogliere le fette.
- Raccogliere le fette utilizzando una pipetta Pasteur di plastica riempita con la soluzione fredda di Tyrode per afferrare delicatamente il tessuto dal bagno. Se necessario, utilizzare pinze e forbici a molla per dissociare la fetta dal blocco cardiaco se il tessuto è ancora attaccato.
- Trasferire la fetta in un colino cellulare nel bagno di Tyrode ossigenato (vedere il passaggio 3.7) e utilizzare il liquido nella pipetta Pasteur di plastica per far sdraiare il tessuto su uno dei colino cellulari, quindi aggiungere una rondella metallica sulla parte superiore per tenere premuto il tessuto.
NOT: Le fette devono essere incubate almeno per 1 h nella soluzione del Tyrode prima dell'elaborazione (questo è per il BDM per rilassare il tessuto).
4. Culturing Fette di Cuore
-
Preparazione delle sezioni per la coltura
- Tagliare la sezione dai bordi per evitare bordi irregolari. Quindi, incollarlo da entrambe le estremità alla cinghia di tempo della stampante sterilizzata in poliuretano da 6 mm con fili metallici incorporati con colla tissutale.
- Trasferire le fette cardiache supportate a 6 piastre di pozzo che contengono 6 mL di mezzo di coltura in ogni pozzo.
- Posizionare il coperchio della piastra di stimolazione (Tabella dei materiali) sulla parte superiore della piastra 6 pozzo e collegare il coperchio alla coltura cellulare stimolatore elettrico ( Tabella deimateriali). Regolare lo stimolatore per stimolare elettricamente le fette cardiache a 10 V, 1,2 Hz continuamente per tutto il tempo.
NOTA: Dopo aver collegato la stimolazione, le fette di cuore inizieranno a battere, e questo movimento sarà visivamente ovvio. - Trasferire le piastre in un'incubatrice e mantenere a 37 gradi centigradi con aria umidificata e 5% di CO2.
- Modificare il mezzo di coltura 3volte al giorno e aggiungere 6 mL di media di coltura per bene durante ogni cambiamento media.
NOT: Il mezzo di coltura è ossigenato per 5 minuti prima di ogni cambiamento dei media. Il mezzo deve essere cambiato almeno 1x al giorno; questo va bene nei fine settimana, se necessario. Due giorni di una sola modifica multimediale al giorno è il massimo che viene testato. -
Cambiare la copertura della piastra di stimolazione ogni giorno per evitare il rilascio di particelle di grafite tossiche nel mezzo di coltura (di solito durante il cambiamento mediatico di mezzogiorno).
- Rimuovere il coperchio della piastra di stimolazione dal piatto di coltura e inserire la spina di schiuma bianca dove il coperchio si collega al cavo per lo stimolatore elettrico di coltura cellulare, per evitare danni all'acqua al circuito elettrico.
- Mettere il coperchio della piastra in un bagno di acqua autoclave con 2 x antibiotic-antimicotico. Tenerlo in questo bagno (cioè, bagno di risciacquo) durante la notte.
- Il giorno successivo, spostare il coperchio della piastra in un bagno di etanolo del 70% per un bagno da 5/15 min da decontaminare. Agitare il liquido tanto liquido dal dispositivo prima di cambiare i bagni.
- Quindi, trasferire il coperchio della piastra al terzo e ultimo bagno (ad esempio, bagno pulito), che consiste in acqua autoclaved e 2x antibatterico-antimiottico, per sciacquare eventuali tracce di etanolo rimanenti.
- Dopo aver risciacquato il coperchio della piastra nel bagno pulito, utilizzare una salvietta pulita senza lanugine (spruzzata con etanolo) per asciugare l'acqua residua sulle parti di plastica, quindi rimuovere il pezzo di schiuma bianca e riporre con cura il coperchio della piastra sulla piastra di coltura.
NOT: Non toccare gli elettrodi di grafite nera che vanno nel pozzo, in quanto il dispositivo non sarà più sterile. - Utilizzando pinze sterili, assicurarsi che il tessuto sia al centro del pozzo in modo che il coperchio della piastra non tocchi il tessuto. Assicurarsi che il lato curvo del coperchio della piastra corrisponda al lato angolato della piastra e che gli angoli quadrati siano allineati.
NOTA: Per ridurre al minimo la contaminazione delle coperture delle piastre di stimolazione, conservarle in lastre pulite e vuote 6 dopo aver terminato l'esperimento.
- Eseguire un test MTT, misurazioni del calcio e valutazioni della funzione contrattile sulle fette di cuore di maiale fresco (giorno 0), e dopo 6 giorni di cultura secondo Ou et al.13.
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Representative Results
Utilizzando uno stimolatore elettrico di coltura cellulare disponibile in commercio in grado di ospitare otto 6 piastre di pozzo contemporaneamente, abbiamo emulato l'ambiente cardiaco adulto inducendo stimolazione elettrica alla frequenza fisiologica (1,2 Hz), e sottoposto a screening per i componenti medi fondamentali per prolungare la durata delle fette di cuore di maiale funzionali nella coltura13. Poiché i cuori di maiale e umani sono simili per dimensioni e anatomia15, abbiamo sviluppato un sistema di coltura delle fette di cuore biomimetico usando cuori di maiale e successivamente lo abbiamo convalidato in fette di cuore umano. Qui, abbiamo dettagliato il protocollo per le fette di cuore di maiale che è la stessa procedura per affettare e coltivare il cuore umano. La nuova coltura biomimetica descritta qui, ha mantenuto la vitalità delle fette di cuore di maiale per 6 giorni, come valutato dal test MTT (Figura 1A). Abbiamo confermato la fattibilità funzionale di queste fette nell'arco di 6 giorni valutando la loro omeostasi di calcio e la forza contrattile. Nei primi 6 giorni, non ci sono transitori spontanei di calcio nei cardiomiociti, e i cardiomiociti hanno risposto alla stimolazione elettrica esterna e alla stimolazione z-adrenergica simile alle fette di cuore fresche (Figura 1B). Inoltre, la forza contrattile e le risposte all'isoproterenolo sono mantenute in fette di cuore coltivate per un massimo di 6 giorni, simile a quella delle fette di cuore fresco (Figura 1C,D).
Figura 1: Convalida della fattibilità e della funzionalità della coltura delle fette di cuore di maiale. (A) Quantificazione della vitalità delle fetta cardiace nel tempo utilizzando il saggio MTT in un sistema di coltura stimolato o non stimolato nel mezzo ottimizzato (n : 5 cuori di maiale ciascuno in triplice copia, SEM è rappresentato come barre di errore; test ANOVA bidirezionale è stato condotto per confrontare tra gruppi, .p < 0.05). (B) Traccia rappresentativa del segnale di calcio da una fetta di cuore fresca (giorno 0) e dopo 6 giorni di coltura (giorno 6) con e senza 1 stimolazione isoproterenola M . I transitori sono stati registrati dopo aver caricato le fette cardiache con colorante di calcio Fluo-4 e utilizzando la stimolazione elettrica di 1 Hz/20 V al momento della registrazione. La quantificazione dell'ampiezza del segnale di calcio con e senza stimolazione con isoproterenol mostra un modello simile di transitori di calcio al giorno 0 e il giorno 6 in coltura (n - 4 cuori di maiale, È stato condotto un test ANOVA bidirezionale per il confronto tra gruppi, con stimolazione della linea di base e di base allo stesso tempo, il valore pD0 vs D6 - 0,95 e il valore pD0 Iso vs D6 Iso è 0,93). (C) Impostazione della valutazione della forza contrattuale (pannello sinistro); la fetta cardiaca (HS) è appesa tra un trasduttore di forza (FT) e un posto stabile (P) tra due elettrodi elettrici (EE) per la stimolazione elettrica. Dopo la stimolazione, i contratti di fetta e le contrazioni vengono registrati utilizzando il software designato (pannello destro). (D) Grafico a barre mostra la quantificazione della forza contrattile in presenza o assenza di isoproterenolo (Iso) generato da fette di cuore di maiale fresco (giorno 0) e dopo 6 giorni nella coltura biomimetica (n - 4 cuori di maiale ciascuno in triplice copia, SEM è rappresentato come barre di errore; test ANOVA bidirezionale è stato condotto per confrontare tra i gruppi, p < 0,05 confrontando la linea di base con la stimolazione Iso allo stesso tempo, la forza di contrazione: p-valueD0 vs D6 - 0.96, p-valueD0 Iso vs D6 Iso - 0.81; tempo al 50% di rilassamento: p-value D0 vs D6 - 0,47, valore pD0 Iso vs D6 Iso - 0,43). Questa cifra è stata modificata da Ou etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Condizione | Fischer etal. | Ou etal. |
| Specie | Umano | Maiale e umano |
| Malattia | Cuori in dissesto | Cuori sani normali |
| Conservazione | Tessuto conservato | Tessuto fresco |
| Spessore della sezione | 300 m | 300 m |
| Ossigenazione media | No | Ossigenazione intermittant |
| Cultura Medium | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitazione | Sì | No |
| Tasso di pacing | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Durata della cultura | 4 mesi con compromesso | 6 giorni senza compromessi |
| Temperatura della coltura | 37 | 37 |
| Carico meccanico | carico auxotonico | nessun caricamento |
| Punti temporali testati senza variazioni nell'espressione genica rispetto alla fetta di cuore fresca | N/D | 2 e 6 giorni |
| Primo punto temporale testato per mostrare un cambiamento nell'espressione genica | Giorno 8 | Giorno 10 |
Tabella 1: Confronto tra le condizioni di taglio e di coltura utilizzate in Fischer et al.16 e Ou et al.13.
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Discussion
Qui descriviamo il protocollo video dettagliato per il nostro metodo recentemente pubblicato per la media throughput semplificata (processi fino a 48 fette/dispositivo) metodo che consente la coltura di fette di cuore di maiale per un periodo sufficientemente lungo per testare la cardiotossicità acuta13. Le condizioni proposte imitano l'ambiente del cuore, compresa la frequenza della stimolazione elettrica, la disponibilità di nutrienti e l'ossigenazione intermittente. Attribuiamo la prolungata vitalità delle fette cardiache nella nostra cultura biomimetica stimolata alla nostra attenzione a ricreare le condizioni fisiologiche vissute dal cuore intatto. Questo concetto è supportato dai nostri dati che dimostrano che la stimolazione elettrica da sola, senza fornire nutrienti essenziali, non è sufficiente a mantenere la vitalità della fetta cardiaca13. Pertanto, i nuovi componenti del mezzo di coltura sono il principale driver per prolungare la vitalità e la funzionalità della fetta di cuore nella cultura. Abbiamo scoperto che è essenziale includere FBS nel mezzo per mantenere la vitalità, che è probabilmente dovuto alla necessità di una varietà di acidi grassi, oligoelementi, enzimi, proteine, macromolecole, componenti chimici, e ormoni, che di solito sono presenti nel siero e consegnati al tessuto cardiaco in vivo17. Inoltre, abbiamo scoperto che l'aggiunta di FGF e VEGF al mezzo di coltura è necessaria per migliorare la vitalità dei tessuti. FGF e VEGF sono noti fattori angiogenici che sono essenziali per il mantenimento delle cellule endoteliali coltivate18. Pertanto, è probabile che FGF e VEGF siano necessari per mantenere le cellule endoteliali e tessuti connettivi in coltura per supportare la vitalità dei tessuti. Il nostro lavoro è il primo a modificare il mezzo di coltura semplificato precedentemente riportato per la coltura delle fette cardiache, e apre la possibilità di un'ulteriore ottimizzazione delle componenti dei media negli studi successivi.
In modo tempestivo con il nostro nuovo metodo, ci sono stati altri tre studi che hanno dimostrato l'importanza della stimolazione elettromeccanica continua nel mantenere le fette in coltura nei sistemi bioingegnerizzati16,19,20. Tuttavia, questi studi hanno utilizzato il mezzo basale M199/ITS, che non è sufficiente per mantenere le esigenze metaboliche delle fette cardiache. Questo ha portato a diversi compromessi nella contrattilità fetta e l'omeostasi di calcio presto durante la cultura16,19,20. Qiao et al.19 ha sviluppato un chip bioingegnerizzati altamente sofisticati, in grado di mantenere le proprietà elettrofisiologiche delle fette cardiache per 4 giorni, ma non è stata fornita alcuna valutazione della funzione contrattile. Watson et al.20 hanno bioingegnerizzato un sistema di coltura a bassa produttività (processi fino a 4 fette/dispositivo) per dimostrare l'importanza della lunghezza del sarcomere diastolico per il mantenimento delle proprietà muscolari cardiache per 24 h. Infine, Fischer et al.16 hanno dimostrato che le fette di cuore umano in mancanza possono essere mantenute in vitro fino a 4 mesi quando coltivate sotto la stimolazione da 0,2 Hz, il carico auxotonico e l'agitazione multimediale in un dispositivo di bioingegneria. Tuttavia, queste condizioni hanno indotto una varietà di cambiamenti nelle fette cardiache, come si riflette nei loro dati RNAseq, che hanno mostrato oltre 10 volte la regolazione dell'espressione genica cardiaca già nel primo momento di valutazione (giorno 8)16. Tuttavia, nel nostro sistema di coltura ottimizzato, solo 2 e 5 trascrizioni sono state espresse in modo differenziale dopo 2 e 6 giorni di coltura rispetto al tessuto cardiaco fresco, rispettivamente. Tuttavia, dopo 10 giorni di cultura, ci sono stati cambiamenti significativi nell'espressione di oltre 500 trascrizioni. I geni downregolati dopo 10 giorni di coltura erano per lo più correlati al muscolo cardiaco, mentre i geni upregulated sono correlati a i fibroblasti, alla matrice extracellulare e all'infiammazione13. La tabella 1 comprende un confronto completo dei protocolli di taglio e di coltura tra Fischer et al.16 e Ou et al.13. Pertanto, il nostro sistema di coltura biomimetica stimolata emula le condizioni controllabili sperimentate dal cuore in situ e, pertanto, dovrebbe fornire una lettura affidabile dei risultati funzionali e strutturali del trattamento farmacologico per quanto riguarda la cardiotossicità acuta o l'efficacia rispetto ai sistemi di coltura compromessi.
Uno dei principali limiti di questo sistema di coltura è che, sebbene il nostro sistema di coltura possa emulare diverse condizioni fisiologiche, non può imitare i cambiamenti nel carico meccanico e nello stress da taglio durante il ciclo contrattuale cardiaco. Un'ulteriore ottimizzazione dei fattori fisiologici e metabolici potrebbe aiutare a prolungare la vitalità e la funzione delle fetta cardiache. Inoltre, abbiamo notato un adattamento precoce che porta alla diminuzione della fosfororylazione ossidativa che potrebbe istigare il deterioramento della vitalità della fetta cardiaca13. Purtroppo, finora, non siamo stati in grado di identificare un metodo ottimale per mantenere il fosfororiolazione ossidativa. È probabile che migliorare il metabolismo degli acidi grassi nelle fette di cuore non è così semplice come l'aggiunta di acidi grassi al mezzo di crescita, e richiederà ulteriore ottimizzazione, che potrebbe essere affrontata in studi futuri. Inoltre, una debolezza generale di questo approccio è la misurazione mancante dei potenziali d'azione su singoli cardiomiociti all'interno della fetta cardiaca, che è essenziale per dimostrare un'interruzione dell'elettrocardiogramma e dell'aritmia ventricolare. Pertanto, è necessario ottimizzare i protocolli per isolare singoli cardiomiociti dalle fette di cuore dopo il trattamento con cardiotossine che inducono interruzione nell'elettrocardiogramma e valutare il loro effetto sul potenziale di azione sui cardiomiociti isolati.
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Disclosures
TMAM detiene equità in Tenaya Therapeutics. Gli altri autori non segnalano conflitti.
Acknowledgments
TMAM è supportato dalla sovvenzione NIH P30GM127607 e dalla sovvenzione 16SDG29950012. RB è supportato da P01HL78825 e UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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