Summary
Este protocolo descreve como cortar e cultivar tecido cardíaco condições fisiológicas por 6 dias. Este sistema de cultura poderia ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de novas terapêuticas de insuficiência cardíaca, bem como testes confiáveis de cardiotoxicidade aguda em um modelo de coração 3D.
Abstract
Muitas drogas novas falham em estudos clínicos devido a efeitos colaterais cardiotóxicos como os ensaios in vitro disponíveis atualmente e modelos animais in vivo mal prevêem passivos cardíacos humanos, representando um fardo multibilionário para a indústria farmacêutica. Portanto, há uma necessidade médica não atendida mundial de melhores abordagens para identificar a cardiotoxicidade medicamentosa antes de realizar testes caros e demorados "primeiro no homem". Atualmente, apenas células cardíacas imaturas (cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos [hiPSC-CMs]) são usados para testar a eficiência terapêutica e a toxicidade das drogas, pois são as únicas células cardíacas humanas que podem ser cultivadas por períodos prolongados necessário para testar a eficácia e toxicidade da droga. No entanto, um único tipo de célula não pode replicar o fenótipo do complexo tecido cardíaco 3D que é formado por múltiplos tipos de células. É importante ressaltar que o efeito das drogas precisa ser testado em cardiomiócitos adultos, que têm características diferentes e respostas de toxicidade em comparação com os imaturos hiPSC-CMs. A combinação de fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular completo que imita o tecido cardíaco humano e reflete as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. Recentemente, através da otimização dos componentes da mídia cultural e das condições de cultura para incluir estimulação elétrica contínua a 1,2 Hz e oxigenação intermitente do meio de cultura, desenvolvemos uma nova configuração do sistema de cultura que preserva a viabilidade e funcionalidade de fatias de coração humano e porco por 6 dias na cultura. No protocolo atual, estamos detalhando o método para cortar e cultivar coração de porco como exemplo. O mesmo protocolo é usado para cultivar fatias de corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda que fecha a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos.
Introduction
A cardiotoxicidade induzida por drogas é uma das principais causas de retirada do mercado1. Na última década doséculo XX, oito drogas não cardiovasculares foram retiradas do mercado, pois resultaram em morte súbita por arritmias ventriculares2. Além disso, várias terapias anticancerígenas (embora em muitos casos eficazes) podem levar a vários efeitos cardiotóxicos, incluindo cardiomiopatia e arritmias. Por exemplo, tanto as terapias tradicionais (por exemplo, antrasicopas e radiação) quanto as terapias direcionadas (por exemplo, trastuzumabe) podem resultar em complicações cardiovasculares em um subconjunto de pacientes3. Uma estreita colaboração entre cardiologistas e oncologistas (através do campo emergente da "cardio-oncologia") ajudou a tornar essas complicações gerenciáveis garantindo que os pacientes possam ser tratados efetivamente2. Menos claros são os efeitos cardiovasculares de agentes mais novos, incluindo inibidores Her2 e PI3K, especialmente quando as terapias são usadas em combinação. Portanto, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis para toxicidades cardiovasculares associadas a terapias anticancerígenas emergentes antes de ensaios clínicos em humanos. A falta de disponibilidade de sistemas de cultura para tecido cardíaco humano que seja funcional e estruturalmente viável por mais de 24 h é um fator limitante para testes de cardiotoxicidade confiáveis. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um sistema confiável para a cultura do tecido cardíaco humano condições fisionicais para testar a toxicidade das drogas.
O recente movimento em direção ao uso de cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos (hiPSC-CMs) em testes de cardiotoxicidade forneceu uma solução parcial para resolver essa questão; no entanto, a natureza imatura dos hiPSC-CMs e a perda de integridade tecidual em comparação com a natureza multicelular do tecido cardíaco são grandes limitações desta tecnologia4. Um estudo recente superou parcialmente essa limitação através da fabricação de tecidos cardíacos de hiPSC-CMs em hidrogéis e submetendo-os ao aumento gradual da estimulação elétrica ao longo do tempo5. No entanto, suas propriedades eletromecânicas não atingiram a maturidade observada no miocárdio humano adulto. Além disso, o tecido cardíaco é estruturalmente mais complicado, sendo composto de vários tipos de células, incluindo células endoteliais, neurônios e vários tipos de fibroblastos estrônticos ligados a uma mistura muito específica de proteínas matrizes extracelulares6. Essa heterogeneidade da população de células não cardiomiócitos7,8,9 no coração de mamíferos adultos é um grande obstáculo na modelagem do tecido cardíaco usando tipos de células individuais. Essas principais limitações destacam a importância do desenvolvimento de métodos para permitir a cultura de tecido cardíaco intacto para estudos ideais envolvendo condições fisiológicas e patológicas do coração5.
Cultivar fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo que é semelhante ao tecido cardíaco humano que poderia refletir de forma confiável as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. No entanto, seu uso tem sido severamente limitado pelo curto período de viabilidade na cultura, que não se estende além de 24 h utilizando os protocolos mais robustos relatados até 201810,11,12. Essa limitação deveu-se a múltiplos fatores, incluindo o uso da interface ar-líquido para cultivar as fatias, e o uso de um meio de cultura simples que não suporta as altas demandas energéticas do tecido cardíaco. Recentemente desenvolvemos um sistema de cultura submerso que é capaz de fornecer estimulação elétrica contínua e otimizar os componentes da mídia cultural para manter as fatias de tecido cardíaco viáveis por até 6 dias13. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda para fechar a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos. No artigo atual, estamos detalhando o protocolo para cortar e cultivar as fatias do coração usando como exemplo um coração de porco. O mesmo processo é aplicado a corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Com este protocolo, esperamos espalhar a tecnologia para outros laboratórios da comunidade científica.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Louisville e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
1. Preparação para o corte (um dia antes do corte)
- Preparação do microtome vibratório
- Coloque a lâmina de cerâmica no suporte seguindo estas etapas: depois de desembrulhar cuidadosamente a lâmina, coloque a borda afiada primeiro na ranhura da ferramenta da lâmina. Em seguida, coloque a lâmina no suporte afrouxando os dois parafusos nos braços do suporte e deslize a lâmina cada arandela e empurre-a firmemente para trás contra as paradas traseiras. Aperte os parafusos para fixar a lâmina.
NOTA: Os parafusos não devem ser apertados demais. - Calibrar a lâmina usando o protocolo de calibração e as ferramentas de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Resumidamente, a fim de facilitar o alinhamento da lâmina com o eixo de viagem e minimizar as deflexões do eixo Z, o microtomo vibratório utiliza um dispositivo de calibração desmontável. Quando o dispositivo de calibração estiver conectado ao instrumento, sua presença será automaticamente detectada, e o microtomo vibratório assumirá o controle de ajustar as configurações de amplitude e freqüência da lâmina a uma magnitude que melhor permita o ajuste do erro de alinhamento da lâmina.- Pressione o botão Slice para iniciar o processo de alinhamento que moverá automaticamente a lâmina de modo que a borda de corte esteja na posição ideal em relação ao dispositivo de calibração para melhor avaliação de alinhamento. Siga as instruções na tela para fazer ajustes na lâmina usando a chave de fenda fornecida para garantir que o alinhamento Z esteja dentro de 1 μm.
- Autoclave o banho interno e todas as partes metálicas do microtome vibratório.
- Coloque a lâmina de cerâmica no suporte seguindo estas etapas: depois de desembrulhar cuidadosamente a lâmina, coloque a borda afiada primeiro na ranhura da ferramenta da lâmina. Em seguida, coloque a lâmina no suporte afrouxando os dois parafusos nos braços do suporte e deslize a lâmina cada arandela e empurre-a firmemente para trás contra as paradas traseiras. Aperte os parafusos para fixar a lâmina.
- Autoclave as grandes bandejas metálicas (para coletar as fatias e encharcar as tampas da placa de estimulação elétrica), quaisquer recipientes de vidro, lâminas de retângulo regulares, fórceps, tesouras, correia de cronometragem da impressora (cortá-las em pedaços de 6 mm de largura), aradoras metálicas e 5 L de água destilada dupla (ddH2O).
- Esterilize um frasco de 1 L, um frasco de 500 mL e uma bandeja de plástico para o coração in situ e perfusão in vitro com a solução cardioplégica.
- Prepare 2 L da solução do Tyrode fatiando em um béquer de 2 L.
- Para 1 L da solução do Tyrode fatiado, misture 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D -glicose (1,86 g), HEPES de 10 mM (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL de 1 Ml de solução), 1,8 mM CaCl2 (1,8 mL de 1 M solução), até 1 L de ddH2O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de 1.000 mL, 0,22 μm, filtro/armazenamento a vácuo e armazene a 4 °C durante a noite.
- Prepare 4 L da solução cardioplégica.
- Para 1 L da solução cardioplégica, misture 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL de 1 M solução), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, até 1 L de ddH2O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de 1.000 mL, 0,22 μm, filtro/armazenamento a vácuo e armazene a 4 °C durante a noite.
NOTA: Adicione 1.000 U/L heparina na solução de cardioplegia no dia do corte (ver passo 2.1).
- Para 1 L da solução cardioplégica, misture 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL de 1 M solução), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, até 1 L de ddH2O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de 1.000 mL, 0,22 μm, filtro/armazenamento a vácuo e armazene a 4 °C durante a noite.
- Preparar recentemente 500 mL de meio de cultura na garrafa original em um armário de biossegurança: mix médio 199, 1x suplemento insulina-transferrin-selnium (ITS), 10% soro bovino fetal (FBS), 5 ng/mL fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng/mL FGF-básico e 2x antibiótico-antimicotic. O filtro esteriliza através do sistema de 0,22 μm, filtro/armazenamento de vácuo e armazena a 4 °C durante a noite.
NOTA: Não ajuste o pH, adicione VEGF e FGF recentemente antes de usar. - Prepare 4% de placas de gel de ágar.
- Adicione 200 mL de ddH2O esterilizado em um frasco esterilizado de 500 mL. Pesar 8 g de agarose e despeje delicadamente no frasco. Ferva por 2 min em um microondas, depois esfrie por 5 min em temperatura ambiente.
- Despeje 25 mL em cada placa de Petri de 100 mm em um armário de biossegurança (prepare 6 pratos) e aguarde 1h para solidificar. Em seguida, sele as placas com filme de parafina, enrole com envoltório limpo e armazene a 4 °C.
- Prepare 4 L de 70% de etanol diluindo o etanol absoluto à prova de 200 em ddH2O autoclaved.
- Prepare 2x antibiótico-antimicotic em ddH2O esterilizado: misture 980 mL de ddH2O esterilizado com 20 mL de antibiótico-antimicótico o gabinete de biossegurança.
2. Perfusão de coração de porco
- Adicione 1 mL de heparina U/mL a cada 1 L de solução cardioplégica. Mantenha a solução no gelo.
NOTA: São necessários pelo menos 3 L para a perfusão e preservação do coração durante a transferência para a sala de cultura de tecidos. - Leve os seguintes itens para a sala de cirurgia do porco: um grande balde de gelo cheio de gelo, uma bandeja de metal esterilizada (mantenha no balde de gelo para perfusão cardíaca), um frasco esterilizado de 500 mL, um frasco de 1 L (para transferir o coração em solução de cardioplegia de volta para a sala de cultura de tecidos , no gelo), e uma bandeja de plástico esterilizada cheia de gelo (para manter solução cardioplégica no gelo).
- Prepare um sistema de perfusão cardíaca in-situ contendo uma torneira de 3 vias, uma seringa de 60 mL, um cateter de agulha borboleta de 18 G e tubos de extensão para o reservatório de solução cardioplégica.
- Anestesiar o porco macho yorkshire (2-3 meses de idade, 20-25 kg) primeiro com uma injeção intramuscular de um coquetel de cetamina (20 mg/kg)/xilazina (2 mg/kg). Confirme a anestesia adequada pela perda da tensão da mandíbula. Em seguida, transfira o porco para a sala de cirurgia, entubar e ventilar mecanicamente os pulmões como descrito anteriormente14.
- Manter anestesia com (1,5-2%) Isoflurano.
- Coloque o animal na posição lateral direita e raspe a pele da área do peito. Limpe a pele com esfoliante de álcool e, em seguida, esterilize o local cirúrgico com 10% (w/v) solução de povidone-iodo.
- Abra o peito por incisão de toracotomia esquerdath usando um bisturi no espaço intercostal 4, e use um retrátil entre as costelas para manter o peito aberto e expor o coração.
NOTA: Use todos os instrumentos esterilizados para este procedimento. - Insira o cateter da agulha borboleta no átrio esquerdo e fixe a agulha com um fechamento de corda da bolsa. Após a injeção intravenosa de uma dose de bolus de heparina (100 U/kg), comece a perfundir o coração in situ com 500 mL de solução cardioplégica gelada (para diminuir a freqüência cardíaca) através do cateter atrial esquerdo.
- Anestesiar profundamente o porco com 5% de isoflurano. Extirbe rapidamente o coração para fora do peito com uma tesoura cirúrgica. Cannulate a aorta com uma cânula aórtica e perfundir o coração in vitro com outro 1 L de solução cardioplégica gelada (100 mL/min) para liberar sangue de vasculatura.
- Após a perfusão cardíaca, mantenha o coração em um frasco de 1 L cheio de solução cardioplegia gelada e mantenha no gelo durante a transferência para a sala de cultura de tecidos.
3. Corte de tecido cardíaco de porco
- Coloque o banho de tecido no vibratomo, adicione gelo à jaqueta de resfriamento do banho de tecido, em seguida, adicione a solução de Tyrode no banho de tecido. Configure um frasco de plástico L para coletar o descarte de gelo derretido da jaqueta de resfriamento do banho de tecido.
- o armário de biossegurança, transfira o coração de porco para uma bandeja contendo 1 L de solução cardioplégica fria e fria.
- Disseque o coração para isolar o ventrículo esquerdo usando bisturis estéreis retráteis. Em seguida, corte o ventrículo esquerdo em blocos de 1-2 cm3 cada um usando lâminas retângulo de navalha. Use uma peça para cortar e mantenha as peças restantes em um tubo de 50 mL na solução fria de Tyrode no gelo para cortar mais tarde, se necessário.
NOTA: Massageie o tecido antes de cortar com as mãos, especialmente se este for o segundo bloco. A massação ajuda a restaurar a configuração correta da fibra muscular e previne qualquer rigidez dentro do bloco cardíaco. - Adicione 1−2 gotas de cola de tecido(Tabela de Materiais)ao suporte da amostra metálica e cole um pedaço do bloco de ágar de 4% com uma área de superfície de aproximadamente 1 cm2.
- Adicione 1-2 gotas de cola de tecido no ágar.
- Coloque o bloco cardíaco no ágar com o lado do epicárdio cardíaco voltado para baixo na cola do tecido e certifique-se de que é o mais plano possível. Em seguida, transfira o suporte de tecido com o bloco cardíaco para sua posição no banho de corte do vibratomo.
- Conecte o tubo de oxigênio ao banho de corte e à bandeja de metal preenchida com a solução de Tyrode para coletar as fatias (banho de Tyrode oxigenado). Em seguida, adicione 40 μm de filtros de células na bandeja de metal para coletar as fatias após o corte.
- Ajustando a posição de corte
- Usando o software operacional vibratome e o painel de instrumentos, ajuste a altura da lâmina/amostra. Selecione o botão de altura e siga as instruções na tela para ajustar a altura. Idealmente, tenha a lâmina perto do topo do tecido, mas abaixo dos músculos papilares e certifique-se de que há líquido cobrindo o tecido e a lâmina antes de cortar.
- Ajuste por onde começar a cortar o tecido selecionando o botão de avanço. Pressione o botão de fatia e aumente a velocidade usando o botão para mover a lâmina em direção à borda do tecido. Em seguida, pressione a fatia novamente para parar e pressione o botão de avanço para inativar o processo.
- Ajuste os parâmetros de corte: velocidade de avanço = 0,03 mm/s, frequência de vibração = 80 Hz e amplitude de vibração horizontal = 2 mm. Em seguida, comece a cortar selecionando o botão de fatia.
- Deixe o vibratome fatiar até atingir a extremidade do tecido, mas antes de atingir a parte de trás do suporte do espécime. Neste ponto, pressione fatia novamente para parar. Aperte o botão Retornar para voltar à posição inicial.
- Selecione repetição automática (clicando duas vezes) que permitirá que o microtome vibratório repita automaticamente o processo de corte por até 99 vezes.
- Coletando fatias
- Espere até que as fatias estejam em comprimento total e pareça boa (depois de passar pelas camadas musculares papilares), em seguida, comece a coletar as fatias.
- Colete as fatias usando uma pipeta pasteur de plástico cheia de solução fria de Tyrode para pegar suavemente o tecido do banho. Se necessário, use fórceps e tesouras de mola para dissociar a fatia do bloco cardíaco se o tecido ainda estiver preso.
- Transfira a fatia para um coador de células no banho de Tyrode oxigenado (ver passo 3.7) e use o líquido na pipeta pasteur de plástico para fazer com que o tecido fique deitado em um dos filtros celulares, em seguida, adicione uma arandela metálica na parte superior para segurar o tecido para baixo.
NOTA: As fatias precisam ser incubadas pelo menos por 1h na solução do Tyrode antes do processamento (isto é para o BDM relaxar o tecido).
4. Fatias de coração de culturing
-
Preparando as fatias para a cultura
- Corte a fatia das bordas para evitar bordas irregulares. Em seguida, cole-o de ambas as extremidades para poliuretano esterilizado de 6 mm de largura correia de cronometragem da impressora com fios metálicos embutidos usando cola de tecido.
- Transfira as fatias de coração suportadas para 6 placas de poço que contenham 6 mL de meio de cultura em cada poço.
- Coloque a tampa da placa de estimulação(Tabela de Materiais)na parte superior da placa de 6 poços e conecte a tampa ao estimulador elétrico de cultura celular(Tabela de Materiais). Ajuste o estimulador para estimular eletricamente as fatias de coração a 10 V, 1,2 Hz continuamente o tempo todo.
NOTA: Depois de ligar a estimulação, as fatias de coração começarão a bater, e esse movimento será visualmente óbvio. - Transfira as placas para uma incubadora e mantenha a 37 °C com ar umidificado e 5% CO2.
- Mude o meio de cultura 3x por dia e adicione 6 mL de meio de cultura por bem durante cada mudança de mídia.
NOTA: O meio de cultura é oxigenado por 5 min antes de cada mudança de mídia. O meio deve ser trocado pelo menos 1x por dia; isso é bom nos fins de semana, se necessário. Dois dias de apenas 1 mudança de mídia por dia é o máximo que é testado. -
Altere a tampa da placa de estimulação todos os dias para evitar a liberação de partículas tóxicas de grafite no meio de cultura (geralmente durante a mudança de mídia do meio-dia).
- Remova a tampa da placa de estimulação do prato de cultura e insira o plugue de espuma branca onde a tampa se conecta ao cabo para o estimulador elétrico da cultura celular, para evitar danos à água no circuito elétrico.
- Coloque a tampa da placa em um banho de água autoclaved com 2x antibiótico-antimicótico. Mantenha-o neste banho (ou seja, lavando banho) durante a noite.
- No dia seguinte, mova a tampa da placa para um banho de 70% de etanol por 5-15 min para descontaminar. Retire o máximo de líquido do dispositivo antes de trocar os banhos.
- Em seguida, transfira a tampa da placa para o terceiro e último banho (ou seja, banho limpo), que consiste em água autoclaved e 2x antibacteriano-antimicocético, para enxaguar quaisquer vestígios de etanol restantes.
- Depois de enxaguar a tampa da placa no banho limpo, use um lenço limpo sem fiapos (pulverizado com etanol) para secar qualquer água residual nas peças plásticas, em seguida, remova a peça de espuma branca e coloque cuidadosamente a tampa da placa de volta na placa de cultura.
NOTA: Não toque nos eletrodos de grafite preto que vão para o poço, pois o dispositivo não será mais estéril. - Usando fórceps estéreis, certifique-se de que o tecido está no centro do poço para que a tampa da placa não toque no tecido. Certifique-se de que o lado curvo da tampa da placa combina com o lado angular da placa e que os cantos quadrados se alintem.
NOTA: Para minimizar a contaminação das tampas da placa de estimulação, mantenha-as limpas e vazias 6 placas de poço após o término do experimento.
- Realizar um ensaio MTT, medidas de cálcio e avaliações de função contraída em fatias de coração de porco fresco (dia 0), e após 6 dias na cultura de acordo com Ou et al.13.
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Representative Results
Usando um estimulador elétrico de cultura celular comercialmente disponível que pode acomodar oito 6 placas de poço de uma só vez, emulamos o meio cardíaco adulto induzindo estimulação elétrica na frequência fisiológica (1,2 Hz), e rastreamos os componentes médios fundamentais para prolongar a duração das fatias funcionais do coração de porco na cultura13. Como os corações de porco e humano são semelhantes em tamanho e anatomia15,desenvolvemos um sistema biomimético de cultura de fatias de coração usando corações de porco e, posteriormente, validamos-o em fatias de coração humano. Aqui, nós detalhamos o protocolo para fatias de coração de porco que é o mesmo procedimento para cortar e cultivar o coração humano. A nova configuração de cultura biomimética descrita aqui, manteve a viabilidade das fatias de coração de porco por 6 dias, conforme avaliado pelo ensaio MTT(Figura 1A). Confirmamos a viabilidade funcional dessas fatias ao longo de 6 dias, avaliando sua homeostase de cálcio e força contratífica. Nos primeiros 6 dias, não há transitórios espontâneos de cálcio em cardiomiócitos, e os cardiomiócitos responderam à estimulação elétrica externa, bem como à estimulação β-adrenérgica semelhante às fatias de coração fresco(Figura 1B). Além disso, a força contratífica e as respostas ao isoproterenol são mantidas em fatias de coração cultivadas por até 6 dias, semelhantes às fatias de coração fresco(Figura 1C,D).
Figura 1: Validação da viabilidade e funcionalidade da cultura de fatias de coração de porco. (A) Quantificação da viabilidade da fatia cardíaca ao longo do tempo utilizando o ensaio MTT em sistema de cultura estimulado ou não estimulado em meio otimizado (n = 5 corações de porco cada um em triplicado, SEM é representado como barras de erro; teste ANOVA bidirecional foi realizado para comparar entre grupos, *p < 0,05). (B) Traço de sinal de cálcio representativo de uma fatia de coração fresco (dia 0) e após 6 dias na cultura (dia 6) com e sem estimulação isoproterenol (Iso) de 1 μM. Os transientes foram registrados após o carregamento das fatias cardíacas com corantes de cálcio Fluo-4 e utilizando estimulação elétrica de 1 Hz/20 V no momento da gravação. Quantificação da amplitude do sinal de cálcio com e sem estimulação com isoproterenol mostra um padrão semelhante de transitórios de cálcio no dia 0 e dia 6 na cultura (n = 4 corações de porco, 10-15 células analisadas em cada uma, SEM é representada como barras de erro; teste ANOVA bidirecional foi realizado para comparação entre grupos, *p < 0,05 comparando linha de base com estimulação Iso ao mesmo tempo, p-valueD0 vs D6 = 0,95, e p-valueD0 Iso vs D6 Iso = 0,93). (C) Configuração de avaliação da força de contractile (painel esquerdo); a fatia de coração (HS) é pendurada entre um transdutor de força (FT) e um poste estável (P) entre dois eletrodos elétricos (EE) para estimulação elétrica. Após a estimulação, os contratos de fatia e as contrações são registrados usando o software designado (painel direito). (D) Gráfico de barras mostra a quantificação da força contratestável na presença ou ausência de isoproterenol (Iso) gerado por fatias de coração de porco fresco (dia 0) e após 6 dias na cultura biomimética (n = 4 corações de porco cada um em triplicado, SEM é representado como barras de erro; teste ANOVA bidirecional foi realizado para comparação entre grupos, *p < 0,05 comparando linha de base com estimulação Iso ao mesmo tempo, força de contração: p-valueD0 vs D6 = 0,96, p-valueD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; tempo a 50% de relaxamento: p-value D0 vs D6 = 0,47, p-valueD0 Iso vs D6 Iso = 0,43). Esta figura foi modificada a partir de Ou et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Condição | Fischer et al.16 | Ou et al.13 |
| Espécie | Humano | Porco e humano |
| Doença | Corações falhando | Corações saudáveis normais |
| Preservação | Tecido preservado | Tecido fresco |
| Espessura da fatia | 300 μm | 300 μm |
| Oxigenação média | Não | Oxigenação intermitante |
| Meio Cultural | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitação | Sim | Não |
| Taxa de ritmo | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Duração da cultura | 4 meses com compromisso | 6 dias sem compromisso |
| Temperatura de Cuture | 37 | 37 |
| Carga mecânica | carregamento auxotônico | sem carga |
| Pontos de tempo testados sem nenhuma mudança na expressão genética em comparação com a fatia de coração fresco | N/A | 2 e 6 dias |
| Primeiro ponto de tempo testado para mostrar mudança na expressão genética | Dia 8. | Dia 10. |
Tabela 1: Comparação entre as condições de corte e cultivo utilizadas em Fischer et al.16 e Ou et al.13.
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Discussion
Aqui descrevemos o protocolo de vídeo detalhado para o nosso método recém-publicado para o método de throughput médio simplificado (processos de até 48 fatias/dispositivo) que permite a cultura de fatias de coração de porco por um período suficientemente longo para testar cardiotoxicidade aguda13. As condições propostas imitam o ambiente do coração, incluindo frequência de estimulação elétrica, disponibilidade de nutrientes e oxigenação intermitente. Atribuímos a viabilidade prolongada das fatias de coração em nossa cultura biomimética estimulada ao nosso foco em recriar as condições fisiológicas vivenciadas pelo coração intacto. Este conceito é apoiado por nossos dados mostrando que apenas a estimulação elétrica, sem fornecer nutrientes essenciais, não é suficiente para manter a viabilidade da fatia cardíaca13. Portanto, os novos componentes do meio cultural são o principal motor para prolongar a viabilidade e funcionalidade da fatia cardíaca na cultura. Descobrimos que é essencial incluir a FBS no meio para manter a viabilidade, o que é provável devido à exigência de uma variedade de ácidos graxos, elementos de traço, enzimas, proteínas, macromoléculas, componentes químicos e hormônios, que geralmente estão presentes no soro e entregues ao tecido cardíaco in vivo17. Além disso, descobrimos que a adição de FGF e VEGF ao meio de cultura são necessárias para melhorar a viabilidade do tecido. FGF e VEGF são fatores angiogênicos conhecidos que são essenciais para a manutenção de células endoteliais cultivadas18. Portanto, é provável que a FGF e a VEGF sejam necessárias para manter as células endoteliais e os tecidos conjuntivos na cultura para apoiar a viabilidade do tecido. Nosso trabalho é o primeiro a modificar o meio de cultura simplificado previamente relatado para a cultura de fatias cardíacas, e abre a possibilidade de otimização adicional dos componentes de mídia em estudos subsequentes.
Em tempo hábil com nosso novo método, houve outros três estudos que demonstraram a importância da estimulação eletromecânica contínua na manutenção de fatias na cultura em sistemas bioengenheiros16,,19,20. No entanto, esses estudos utilizaram o meio basal M199/ITS, que não é suficiente para manter as necessidades metabólicas das fatias cardíacas. Isso levou a vários compromissos na contratilidade da fatia e homeostase de cálcio no início da cultura16,19,20. Qiao et al.19 desenvolveram um chips bioengenheiros altamente sofisticados, que podem manter as propriedades eletrofisiológicas das fatias cardíacas por 4 dias, mas nenhuma avaliação da função contratestável foi fornecida. Watson et al.20 criaram um sistema de cultura de baixo custo (processos de até 4 fatias/dispositivo) para demonstrar a importância do comprimento do sarcomere diastólica para a manutenção das propriedades musculares cardíacas por 24 h. Finalmente, Fischer et al.16 demonstraram que a falha nas fatias de coração humano pode ser mantida in vitro por até 4 meses quando cultivada estimulação de 0,2 Hz, carregamento auxotônico e agitação de mídia em um dispositivo de bioengenharia. No entanto, essas condições induziram uma variedade de alterações nas fatias cardíacas, como refletido em seus dados RNAseq, que mostraram mais de 10 vezes a regulação da expressão genética cardíaca já no primeiro ponto de avaliação (dia 8)16. No entanto, em nosso sistema de cultura otimizado, apenas 2 e 5 transcrições foram significativamente expressas diferencialmente após 2 e 6 dias de cultura em comparação com tecido cardíaco fresco, respectivamente. No entanto, após 10 dias na cultura, houve mudanças significativas na expressão de mais de 500 transcrições. Os genes desregulados após 10 dias na cultura estavam principalmente relacionados ao músculo cardíaco, enquanto os genes upregulated estão relacionados a fibroblastos, matriz extracelular e inflamação13. A Tabela 1 inclui uma comparação completa dos protocolos de corte e cultura entre Fischer et al.16 e Ou et al.13. Portanto, nosso sistema de cultura biomimética estimulada emula as condições controláveis vivenciadas pelo coração in situ e, portanto, deve fornecer uma leitura confiável dos resultados funcionais e estruturais do tratamento medicamentoso no que diz respeito à cardiotoxicidade aguda ou eficácia em comparação com sistemas de cultura comprometidos.
Uma das principais limitações deste sistema de cultura é que, embora nosso sistema de cultura possa emular várias condições fisiológicas, ele não pode imitar mudanças na carga mecânica e o estresse de cisalhamento durante o ciclo de contração cardíaca. A otimização adicional de fatores fisiológicos e metabólicos pode ajudar a prolongar a viabilidade e a função da fatia cardíaca. Além disso, notamos uma adaptação precoce que leva à diminuição da fosforilação oxidativa que pode instigar a deterioração da viabilidade da fatia cardíaca13. Infelizmente, até agora, não conseguimos identificar um método ideal para manter a fosforilação oxidativa. É provável que o aumento do metabolismo de ácidos graxos em fatias cardíacas não seja tão simples quanto adicionar ácidos graxos ao meio de crescimento, e exigirá uma otimização adicional, que poderia ser abordada em estudos futuros. Além disso, uma fraqueza geral dessa abordagem é a falta de medição dos potenciais de ação em cardiomiócitos únicos dentro da fatia cardíaca, o que é essencial para demonstrar interrupção no eletrocardiograma e arritmia ventricular. Portanto, é necessário otimizar protocolos para isolar cardiomiócitos únicos das fatias cardíacas após o tratamento com cardiotoxinas que induzem interrupção no eletrocardiograma e avaliam seu efeito sobre o potencial de ação nos cardiomiócitos isolados.
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Disclosures
A TMAM detém equidade na Tenaya Therapeutics. Os outros autores não relatam conflitos.
Acknowledgments
O TMAM é apoiado pelo subsídio NIH P30GM127607 e pela American Heart Association 16SDG29950012. RB é suportado por P01HL78825 e UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
