Summary
Detta protokoll beskriver hur man skär och kultur hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden i 6 dagar. Detta kultursystem skulle kunna användas som en plattform för att testa effekten av nya hjärtsvikt therapeutics samt tillförlitlig testning av akut kardiotoxicitet i en 3D-hjärtmodell.
Abstract
Många nya läkemedel misslyckas i kliniska studier på grund av kardiotoxiska biverkningar som den för närvarande tillgängliga in vitro-analyser och in vivo djurmodeller dåligt förutsäga mänskliga hjärtåtaganden, utgör en flera miljarder dollar börda på läkemedelsindustrin. Därför finns det ett världsomspännande otillfredsställt medicinskt behov av bättre metoder för att identifiera narkotika kardiotoxicitet innan företaget kostsamma och tidskrävande "första i människan" prövningar. För närvarande används endast omogna hjärtceller (humaninducerad pluripotenta stamceller kardiomyocyter [hiPSC-CMs]) för att testa terapeutisk effektivitet och läkemedelstoxicitet eftersom de är de enda mänskliga hjärtceller som kan odlas under längre perioder läkemedelseffekt och toxicitet. En enda celltyp kan dock inte replikera fenotypen av den komplexa 3D-hjärtvävnaden som bildas av flera celltyper. Viktigt, effekten av läkemedel måste testas på vuxna kardiomyocyter, som har olika egenskaper och toxicitet svar jämfört med omogna hiPSC-CMs. Culturing mänskliga hjärtat skivor är en lovande modell av intakt mänskliga hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett flercelligt system som efterliknar den mänskliga hjärtvävnaden och återspeglar de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Nyligen, genom optimering av kulturmediekomponenter och kulturförhållanden för att inkludera kontinuerlig elektrisk stimulering vid 1,2 Hz och intermittent syresättning av odlingsmediet, utvecklade vi en ny kultur system setup som bevarar lönsamheten och funktionalitet av mänskliga och gris hjärta skivor för 6 dagar i kultur. I det nuvarande protokollet beskriver vi metoden för skivning och odling av grishjärta som ett exempel. Samma protokoll används för att odla skivor från människor, hund, får eller katt hjärtan. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning som stänger klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat.
Introduction
Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är en viktig orsak till återtag på marknaden1. Under det sista årtiondet av20-talet, åtta icke-kardiovaskulära läkemedel drogs tillbaka från marknaden eftersom de resulterade i plötslig död på grund av ventrikulära arytmier2. Dessutom, flera anti-cancer terapier (medan i många fall effektiva) kan leda till flera kardiotoxiska effekter inklusive kardiomyopati och arytmier. Till exempel kan både traditionella (t.ex. antracykliner och strålning) och riktade (t.ex. trastuzumab) bröstcancerbehandlingar resultera i kardiovaskulära komplikationer hos en delmängd av patienter3. Ett nära samarbete mellan kardiologer och onkologer (via det framväxande området "kardio-onkologi") har bidragit till att göra dessa komplikationer hanterbara att säkerställa att patienter kan behandlas effektivt2. Mindre tydliga är de kardiovaskulära effekterna av nyare medel, inklusive Her2- och PI3K-hämmare, särskilt när terapier används i kombination. Därför finns det ett växande behov av tillförlitliga prekliniska screening strategier för kardiovaskulär toxicitet i samband med nya anti-cancer terapier före kliniska prövningar på människa. Bristen på tillgång till kultursystem för mänskliga hjärtvävnad som är funktionellt och strukturellt livskraftig för mer än 24 h är en begränsande faktor för tillförlitlig konditionsränxicitet testning. Därför finns det ett akut behov av att utveckla ett tillförlitligt system för odling av mänsklig hjärtvävnad under fysiologiska förhållanden för att testa läkemedelstoxicitet.
Den senaste tidens steg mot användning av humaninducerade pluripotenta stamceller kardiomyocyter (hiPSC-CMs) i kardiotoxicitet testning har gett en partiell lösning för att ta itu med detta problem; Dock är den omogna karaktären hos hiPSC-CMs och förlusten av vävnadsintegritet jämfört med den flercelliga karaktären hos hjärtvävnaden stora begränsningar av denna teknik4. En nyligen genomförd studie har delvis övervinna denna begränsning genom tillverkning av hjärtvävnader från hiPSC-CMs på hydrogeler och utsätta dem för gradvis ökning av elektrisk stimulering över tiden5. Deras elektromekaniska egenskaper uppnådde dock inte mognaden som sågs i det vuxna mänskliga hjärtmuskeln. Dessutom är hjärtvävnaden strukturellt mer komplicerad, som består av olika celltyper inklusive endotelceller, nervceller och olika typer av stromala fibroblaster kopplade tillsammans med en mycket specifik blandning av extracellulära matrisproteiner6. Denna heterogenitet av icke-kardiomyocytecellpopulationen 7,8,9 i den vuxna däggdjur hjärta är ett stort hinder i modellering hjärtvävnad med hjälp av enskilda celltyper. Dessa stora begränsningar belyser vikten av att utveckla metoder för att möjliggöra odling av intakt hjärtvävnad för optimala studier med fysiologiska och patologiska tillstånd i hjärtat5.
Odling av mänskliga hjärtskivor är en lovande modell av intakt mänskligt hjärtmuskeln. Denna teknik ger tillgång till ett komplett 3D flercellssystem som liknar den mänskliga hjärtvävnaden som på ett tillförlitligt sätt kan återspegla de fysiologiska eller patologiska förhållandena i det mänskliga hjärtmuskeln. Dess användning har dock varit kraftigt begränsad av den korta perioden av livskraft i kulturen, som inte sträcker sig längre än 24 timmar med hjälp av de mest robusta protokoll som rapporterats fram till 201810,11,12. Denna begränsning berodde på flera faktorer, inklusive användning av luft-flytande gränssnitt för att odla skivorna, och användningen av en enkel odling medium som inte stöder de höga energiska kraven i hjärtvävnaden. Vi har nyligen utvecklat ett nedsänkt kultursystem som kan ge kontinuerlig elektrisk stimulering och optimerat komponenterna kulturmedia för att hålla hjärtvävnadsskivorna livskraftiga i upp till 6 dagar13. Detta kultursystem har potential att bli en kraftfull prediktiv människa in situ-modell för akut kardiotoxicitet testning för att minska klyftan mellan prekliniska och kliniska testresultat. I den aktuella artikeln beskriver vi protokollet för skivning och odling av hjärtat skivor med hjälp av en gris hjärta som ett exempel. Samma process tillämpas på människor, hund, får eller katt hjärtan. Med detta protokoll hoppas vi kunna sprida tekniken till andra laboratorier i forskarvärlden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök var i enlighet med de institutionella riktlinjerna från University of Louisville och godkändes av institutionella djurvårds- och användningskommittén.
1. Förberedelse för skivning (en dag före skivning)
- Beredning av den vibrerande mikrotomen
- Placera keramiska bladet i hållaren genom att följa dessa steg: Placera den vassa kanten först i bladverktygets spår. Sätt sedan in bladet i hållaren genom att lossa de två skruvarna på hållarens armar och skjut bladet under varje bricka och tryck tillbaka det mot de bakre hållplatserna. Dra åt skruvarna för att säkra bladet.
OBS: Skruvarna får inte dras åt för mycket. - Kalibrera bladet med kalibreringsprotokollet och verktygen enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Kort, för att underlätta inriktningen av bladet med köraxeln och för att minimera Z-axelns avböjningar, använder den vibrerande mikrotomen en demonterbar kalibreringsanordning. När kalibreringsanordningen är ansluten till instrumentet kommer dess närvaro automatiskt att upptäckas, och den vibrerande mikrotomen tar kontroll över att justera bladets amplitud- och frekvensinställningar till en magnitud som bäst möjliggör justering av bladjusteringsfelet.- Tryck på segmentknappen för att starta justeringsprocessen som automatiskt flyttar bladet så att skäreggen är i optimalt läge i förhållande till kalibreringsenheten för bästa justeringsutvärdering. Följ anvisningarna på skärmen för att göra justeringar av bladet med den medföljande skruvmejseln för att säkerställa att Z-justeringen ligger inom 1 μm.
- Autoklav det inre badet och alla metalldelar av den vibrerande mikrotomen.
- Placera keramiska bladet i hållaren genom att följa dessa steg: Placera den vassa kanten först i bladverktygets spår. Sätt sedan in bladet i hållaren genom att lossa de två skruvarna på hållarens armar och skjut bladet under varje bricka och tryck tillbaka det mot de bakre hållplatserna. Dra åt skruvarna för att säkra bladet.
- Autoklav de stora metallbrickorna (för att samla skivorna och blötläggning av den elektriska stimuleringsplattan täcker), eventuella glasbehållare, regelbundna rektangelblad, pincett, sax, skrivare kuggrem (skär dem i 6 mm breda bitar), metall brickor och 5 L dubbel destillerat vatten (ddH2O).
- Sterilisera en 1 L burk, en 500 ml burk och en plastbricka för hjärtat på plats och in vitro-perfusion med kardioplegisk lösning.
- Förbered 2 L av skivning Tyrodes lösning i en 2 L-bägare.
- För 1 L av skivning Tyrodes lösning, blanda 3 g/L 2,3-butanedion monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukos (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lösning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M-lösning), upp till 1 L ddH2O. Justera pH-värdet till 7.40 med NaOH. Filtrera sedan lösningen med en 1 000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem och förvara vid 4 °C över natten.
- Förbered 4 L av den kardioplegiska lösningen.
- För 1 L av den kardioplegiska lösningen, blanda 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M-lösning), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, upp till 1 L ddH2O. Justera pH-värdet till 7.40 med NaOH. Filtrera sedan lösningen med en 1 000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem och förvara vid 4 °C över natten.
OBS: Lägg till 1 000 U/L heparin i kardioplegilösning samma dag som skivning (se steg 2.1).
- För 1 L av den kardioplegiska lösningen, blanda 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M-lösning), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, upp till 1 L ddH2O. Justera pH-värdet till 7.40 med NaOH. Filtrera sedan lösningen med en 1 000 ml, 0,22 μm, vakuumfilter/lagringssystem och förvara vid 4 °C över natten.
- Nyligen förbereda 500 ml odlingsmedium i den ursprungliga flaskan i en biosäkerhet skåp: blanda medium 199, 1x insulin-transferrin-selen (ITS) tillägg, 10% fetala nötkreatur serum (FBS), 5 ng/mL vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), 10 ng/mL FGF-basic, och 2x antimymykotisk antibiotika. Filtrera sterilisera genom 0,22 μm, vakuumfilter/förvaringssystem och förvara vid 4 °C över natten.
OBS: Justera inte pH, tillsätt VEGF och FGF nyligen före användning. - Förbered 4% agar gel plattor.
- Tillsätt 200 ml steriliserad ddH2O i en 500 ml steriliserad kolv. Väg 8 g agaros och häll försiktigt i kolven. Koka i 2 min i mikrovågsugn, kyl sedan i 5 min vid rumstemperatur.
- Häll 25 ml i varje 100 mm petriskål i ett biosäkerhetsskåp (förbered 6 rätter) och vänta på 1 h för att stelna. Försegla sedan plattorna med paraffinfilm, linda in med ren wrap och förvara vid 4 °C.
- Förbered 4 L 70% etanol genom att späda ut den 200-bevis absoluta etanolen i autoklaverad ddH2O.
- Förbered 2x antibiotika-antimycotic i steriliserad ddH2O: blanda 980 ml steriliserad ddH2O med 20 ml antibiotika-antimycotic under biosäkerhetskåpet.
2. Gris hjärta Perfusion
- Tillsätt 1 ml 1 000 U/mL heparin till varje 1 L kardioplegisk lösning. Håll lösningen på is.
OBS: Minst 3 L behövs för perfusion och bevarande av hjärtat under överföringen till vävnadsodlingsrummet. - Ta följande objekt till griskirurgi rummet: en stor ishink full av is, en steriliserad metall bricka (hålla på ishink för hjärtat perfusion), en steriliserad 500 ml burk, en 1 L burk (för att överföra hjärtat i cardioplegia lösning tillbaka till vävnaden kulturrummet , på is), och en steriliserad plast bricka full av is (för att hålla kardioplegisk lösning på is).
- Förbered ett in-situ-hjärtaperfusionssystem som innehåller en 3-vägs kran, en 60 ml spruta, en 18 G fjärilsnålkateter och förlängningsslang till den kardioplegiska lösningsbehållaren.
- Bedöva Yorkshires hanval (2−3 månader gamla, 20−25 kg) först med en intramuskulär injektion av en ketamin (20 mg/kg)/xyglas (2 mg/kg) cocktail. Bekräfta korrekt anestesi genom förlust av käkspänning. Överför sedan grisen till operationssalen, intubera och ventilera lungorna mekaniskt enligt tidigare beskrivna14.
- Underhåll anestesi med (1,5−2%) isofluran.
- Placera djuret på höger sidoposition och raka pälsen från bröstområdet. Rengör huden med alkoholskrubb och sterilisera sedan operationsområdet med 10% (w /v) povidone-jodlösning.
- Öppna bröstet med vänster thoracotomy snitt med hjälp av en skalpell på den4: e interkostal utrymme, och använda en bröst upprullningsdon mellan revbenen för att hålla bröstet öppet och exponera hjärtat.
OBS: Använd alla steriliserade instrument för denna procedur. - Sätt in fjärilsnålkatetern i det vänstra atriumet och fäst nålen med en snörpängning. Efter intravenös injektion av en bolusdos heparin (100 U/kg), börja granska hjärtat på plats med 500 ml iskall kardioplegisk lösning (för att sakta ner hjärtfrekvensen) via den vänstra förmakskatikern.
- Djupt söva grisen med 5% isofluran. Snabbt punktskatt hjärtat ur bröstet med kirurgisk sax. Kanylulera aorta med en aorta kanyl och perfuse hjärtat in vitro med en annan 1 L iskalla cardioplegic lösning (100 ml /min) för att spola ut vaskulature blod.
- Efter hjärtperfusion, hålla hjärtat i en 1 L burk fylld med iskall kardioplegilösning och hålla på is under överföringen till vävnadskulturrummet.
3. Gris hjärtvävnad skivning
- Ställ in vävnadsbadet på vibratomen, tillsätt is till vävnadsbadkylan och tillsätt sedan Tyrodes lösning i vävnadsbadet. Ställ in 1 L plastburk för att samla in bortskaffande av smält is från vävnadsbadkylan.
- Under biosäkerhetsskåpet, överför grishjärtat till en bricka som innehåller 1 L färsk kall kardioplegisk lösning.
- Dissekera hjärtat för att isolera den vänstra ventrikeln med hjälp av infällbara sterila skalpell. Skär sedan den vänstra ventrikeln i block på 1−2 cm3 vardera med rakhyvelns rektangelblad. Använd ett stycke för skivning och förvara de återstående delarna i ett 50 ml-rör i kallt Tyrodes lösning på is för kapning senare, om det behövs.
OBS: Massera vävnaden innan skivning med händerna, särskilt om detta är det andra blocket. Massera hjälper till att återställa rätt muskelfiber konfiguration och förhindrar stelhet i hjärtblocket. - Tillsätt 1−2 droppar vävnadslim (Tabell av material) till metallprovhållaren och stick en bit av 4% agar blocket med en yta på ca 1 cm2.
- Tillsätt 1−2 droppar vävnadslim på agar.
- Stick hjärtblocket till agar med hjärtepepardium sidan vänd ner på vävnadslim och se till att det är så platt som möjligt. Överför sedan vävnadshållaren med hjärtblocket till sin position i vibratomens skivbad.
- Fäst syreröret på skivbadet och metallbrickan fylld med Tyrodes lösning för att samla skivorna (syresatt Tyrodes bad). Tillsätt sedan 40 μm cellsiler i metallbrickan för att samla skivorna efter skärning.
- Justera skivningsläget
- Justera höjden på bladet/provet med hjälp av vibratome-programvaran och instrumentpanelen. Välj höjdknappen och följ anvisningarna på skärmen för att justera höjden. Helst, ha bladet nära toppen av vävnaden men under papillärmusklerna och se till att det finns vätska som täcker vävnaden och bladet innan skivning.
- Justera var vävnaden ska börja skära genom att välja förknappen. Tryck på skiva knappen och öka hastigheten med hjälp av ratten för att flytta bladet mot kanten av vävnaden. Tryck sedan på segment igen för att stoppa och tryck på för-knappen för att inaktivera processen.
- Justera skärparametrarna: framhastighet = 0,03 mm/s, vibrationsfrekvens = 80 Hz och horisontell vibrationsamplitud = 2 mm. Börja sedan skära genom att markera segmentknappen.
- Låt vibratomen skiva tills den når slutet av vävnaden men innan den träffar den bakre änden av provhållaren. Tryck på segmentet igen för att stoppa. Tryck på returknappen för att gå tillbaka till startpositionen.
- Välj automatisk upprepning (klicka på den två gånger) vilket gör att den vibrerande mikrotomen automatiskt kan upprepa skivningsprocessen i upp till 99 gånger.
- Samla in segment
- Vänta tills skivorna är fulla och verkar bra (efter att ha kommit förbi papillära muskellagren), börja sedan samla skivorna.
- Samla skivorna med en pastörpipett i plast fylld med kall Tyrodes lösning för att försiktigt ta vävnaden från badet. Om det behövs, använd pincett och vårsax för att separera skivan från hjärtblocket om vävnaden fortfarande är fäst.
- Överför skivan till en cellsil i det syresatt Tyrodes bad (se steg 3.7) och använd vätskan i pastörpipetten i plast för att få vävnaden att ligga platt på en av cellsilerna och tillsätt sedan en metallbricka på toppen för att hålla ner vävnaden.
OBS: Skivorna måste inkuberas minst i 1 h i Tyrod lösning före bearbetning (detta är för BDM att slappna av vävnaden).
4. Odling Hjärta Skivor
-
Förbereda skivor för kultur
- Trimma segmentet från kanterna för att undvika ojämna kanter. Limma sedan den från båda ändar till steriliserad polyuretan 6 mm bred skrivare kuggrem med metalltrådar inbäddade med vävnad lim.
- Överför de hjärtskivor som stöds till 6 brunnsplattor som innehåller 6 ml odlingsmedium i varje brunn.
- Placera stimuleringsplattans lock (Tabell över material) på toppen av 6-brunnsplattan och anslut locket till cellkulturens elektriska stimulator ( Tabell övermaterial). Justera stimulatorn för att elektriskt stimulera hjärtskivorna vid 10 V, 1,2 Hz kontinuerligt hela tiden.
OBS: Efter att ha kopplat in stimuleringen kommer hjärtskivorna att börja slå, och denna rörelse kommer att vara visuellt uppenbar. - Överför plattorna till en inkubator och håll den vid 37 °C med fuktad luft och 5 % CO2.
- Byt odlingsmedium 3x per dag och tillsätt 6 ml odlingsmedium per brunn under varje mediebyte.
OBS: Odlingsmediet syresätts i 5 min före varje mediebyte. Medium måste ändras minst 1x per dag; Detta är okej på helgerna om det behövs. Två dagar med endast 1 medieändring per dag är det högsta som testas. -
Byt stimuleringsplattans lock varje dag för att förhindra utsläpp av giftiga grafitpartiklar i odlingsmediet (vanligtvis under mediebytet mitt på dagen).
- Ta bort stimuleringsplattans lock från odlingsskålen och sätt i den vita skumpluggen där locket ansluts till kabeln för cellkulturens elektriska stimulator, för att förhindra vattenskador på den elektriska kretsen.
- Placera plattan locket i ett bad av autoklaverat vatten med 2x antibiotika-antimycotic. Förvara den i detta bad (dvs. sköljbad) över natten.
- Nästa dag, flytta plåtlocket till ett 70% etanolbad i 5−15 min för att sanera. Skaka av dig så mycket vätska som den ska från enheten innan du byter badkar.
- Överför sedan plåtlocket till det tredje och sista badet (dvs. rent bad), som består av autoklaverat vatten och 2x antibakteriellt antimykotisk, för att skölja eventuella återstående etanolspår.
- Efter sköljning av plåtlocket i det rena badet, använd en ren luddfri torka (sprutas ner med etanol) för att torka bort eventuellt restvatten på plastdelarna, ta sedan bort den vita skumbiten och placera försiktigt tillbaka plåten på kulturplattan.
OBS: Rör inte de svarta grafitelektroderna som går in i brunnen, eftersom enheten inte längre kommer att vara steril. - Använd sterila pincett, se till att vävnaden är i mitten av brunnen så att plåtlocket inte vidrör vävnaden. Se till att den böjda sidan av plåtlocket stämmer överens med den vinklade sidan av plattan och att de fyrkantiga hörnen radas upp.
OBS: För att minimera kontaminationen av stimuleringsplattans lock, förvara dem i rena och tomma 6-brunnsplattor efter avslutad experiment.
- Utför en MTT-analys, kalciummätningar och kontraktila funktionsbedömningar på färska grishjärtan (dag 0) och efter 6 dagar i kultur enligt Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cellkultur elektrisk stimulator som rymmer åtta 6 brunnsplattor på en gång, emulerade vi den vuxna hjärtmiljön genom att inducera elektrisk stimulering vid den fysiologiska frekvensen (1,2 Hz), och screenas för de grundläggande medelstora komponenterna för att förlänga varaktigheten av funktionella grishjärta skivor i kultur13. Eftersom gris och mänskliga hjärtan är liknande i storlek och anatomi15,utvecklade vi en biomimetic hjärta skiva kultur system med gris hjärtan och därefter validerade det i mänskliga hjärtat skivor. Här beskrev vi protokollet för gris hjärta skivor som är samma förfarande för mänskliga hjärtat skivning och odling. Den nya biomimetiska kultur setup beskrivs här, bibehöll livskraften hos svin hjärta skivor i 6 dagar som bedöms av MTT analys (figur 1A). Vi bekräftade den funktionella livskraften hos dessa skivor under 6 dagar genom att bedöma deras kalcium homeostas och contractile kraft. Under de första 6 dagarna finns det inga spontana kalciumtransienter i kardiomyocyter, och kardiomyocyter svarade på yttre elektrisk stimulering samt β-adrenerga stimulering liknar färska hjärtskivor (figur 1B). Dessutom bibehålls den kontraktila kraften och svaren på isoproterenol i odlade hjärtskivor i upp till 6 dagar, liknande den hos färska hjärtskivor (figur 1C,D).
Figur 1: Validering av livsdugligheten och funktionaliteten hos grishjärtats skiva. (A)Kvantifiering av hjärtat skiva lönsamhet över tiden med hjälp av MTT-analysen i antingen stimulerade eller ofruktsamma odlingssystem i optimerat medium (n = 5 grishjärtan vardera i tre exemplar, SEM representeras som felstänger; tvåvägs ANOVA-test utfördes för att jämföra mellan grupper, *p < 0,05). ( B)Representativt kalciumsignalspår från en färsk hjärtskiva (dag 0) och efter 6 dagar i kultur (dag 6) med och utan 1 μM isoproterenol (Iso) stimulering. Transienter spelades in efter lastning hjärtat skivor med Fluo-4 kalcium färgämne och med 1 Hz/20 V elektrisk stimulering vid tidpunkten för inspelningen. Kvantifiering av kalciumsignalamplitud med och utan stimulering med isoproterenol visar ett liknande mönster av kalciumtransienter dag 0 och dag 6 i kultur (n = 4 grishjärtan, 10−15 celler som analyseras i varje, SEM representeras som felstaplar; tvåvägs ANOVA-test utfördes för att jämföra mellan grupper, *p < 0,05 och jämför baslinjen med Iso-stimulering vid samma tidpunkt, p-värdeD0 vs D6 = 0,95 och p-värdeD0 Iso vs D6 Iso = 0,93). C)Inställningarna för bedömning av kontraktilkraft (vänster panel). hjärtskivan (HS) hängs mellan en kraftgivare (FT) och en stabil stolpe (P) mellan två elektriska elektroder (EE) för elektrisk stimulering. Vid stimulering registreras segmentkontrakten och sammandragningarna med hjälp av den angivna programvaran (höger panel). DStapeldiagram visar kvantifieringen av den kontraktila kraften i närvaro eller frånvaro av isoproterenol (Iso) som genereras av färska grishjärtan (dag 0) och efter 6 dagar i biomimetisk kultur (n = 4 grishjärtan vardera i tre exemplar. SEM representeras som felstaplar; tvåvägs ANOVA-test utfördes för att jämföra mellan grupper, *p < 0,05 och jämförde baslinjen med Iso-stimulering vid samma tidpunkt, ryckkraft: p-värdeD0 vs D6 = 0,96, p-värdeD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; tid till 50% avslappning: p-värde D0 vs D6 = 0,47, p-värdeD0 Iso vs D6 Iso = 0,43). Denna siffra har ändrats från Ou et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Villkor | Fischer et al.16 | Ou et al.13 |
| Arter | Mänskliga | Gris och människa |
| Sjukdom | Sviktande hjärtan | Normala friska hjärtan |
| Bevarande | Konserverad vävnad | Färsk vävnad |
| Tjocklek för segment | 300 μm | 300 μm |
| Medelstor syresättning | Nej | Intermittant syresättning |
| Kultur Medium | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Agitation | Ja | Nej |
| Pacing takt | 0,2 Hz | 1,2 Hz |
| Varaktighet av kulturen | 4 månader med kompromiss | 6 dagar utan kompromisser |
| Cuture temperatur | 37 | 37 |
| Mekanisk lastning | auxotonic lastning | ingen lastning |
| Testade tidspunkter utan förändring i genuttryck jämfört med färsk hjärtskiva | Ej mycket | 2 och 6 dagar |
| Först testad tidspunkt för att visa förändring i genuttryck | Dag 8 | Dag 10 |
Tabell 1: Jämförelse mellan de skivnings- och odlingsförhållanden som används i Fischer et al.16 och Ou et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi detaljerade videoprotokoll för vår nyligen publicerade metod för förenklad medium genomströmning (processer upp till 48 skivor / enhet) metod som möjliggör kultur av svin hjärta skivor under en period tillräckligt lång för att testa akut kardiotoxicitet13. De föreslagna förhållandena efterliknar miljön i hjärtat, inklusive frekvensen av elektrisk stimulering, näringstillgänglighet, och intermittent syresättning. Vi tillskriver den långvariga livskraften hos hjärtskivor i vår biomimetiska stimulerade kultur till vårt fokus på att återskapa de fysiologiska tillstånd som upplevs av det intakta hjärtat. Detta koncept stöds av våra data som visar att elektrisk stimulering ensam, utan att ge viktiga näringsämnen, inte är tillräckligt för att upprätthålla hjärtat skiva livskraft13. Därför är de nya komponenterna i odlingsmediet den viktigaste drivkraften för att förlänga hjärtat skiva lönsamhet och funktionalitet i kulturen. Vi fann att det är viktigt att inkludera FBS i mediet för att upprätthålla lönsamheten, vilket sannolikt beror på kravet på en mängd olika fettsyror, spårämnen, enzymer, proteiner, makromolekyler, kemiska komponenter, och hormoner, som vanligtvis finns i serum och levereras till hjärtvävnad in vivo17. Dessutom fann vi att tillägg av FGF och VEGF till odlingsmediet behövs för att förbättra vävnadens livskraft. FGF och VEGF är kända angiogena faktorer som är nödvändiga för underhåll av odlade endotelceller18. Därför är det troligt att FGF och VEGF behövs för att upprätthålla endotelceller och bindväv i kultur för att stödja vävnadsflaska. Vårt arbete är först med att ändra det förenklade odlingsmediet som tidigare rapporterats för odling av hjärtskivor, och det öppnar möjligheten för ytterligare optimering av mediekomponenterna i efterföljande studier.
I tid med vår nya metod, det fanns tre andra studier som har visat vikten av kontinuerlig elektromekanisk stimulering för att upprätthålla skivor i kultur i bioengineered system16,19,20. Emellertid, dessa studier används den basala M199/ITS medium, vilket inte är tillräckligt för att upprätthålla de metaboliska behoven hos hjärtat skivor. Detta ledde till flera kompromisser i skiva contractility och kalcium homeostas tidigt under kultur16,19,20. Qiao et al.19 utvecklat en mycket sofistikerad bioengineered chips, som kan upprätthålla de elektrofysiologiska egenskaperna hos hjärtat skivor i 4 dagar, men ingen bedömning av kontraktil funktion lämnades. Watson et al.20 har bioengineered en låg genomströmning kultur system (processer upp till 4 skivor / enhet) för att visa vikten av diastolisk sarkomer längd för underhåll av hjärtmuskeln egenskaper för 24 h. Slutligen, Fischer et al.16 har visat att sviktande mänskliga hjärtat skivor kan upprätthållas in vitro i upp till 4 månader när odlade under 0,2 Hz stimulering, auxotonic lastning och media agitation i en bioengineering enhet. Dessa tillstånd inducerade dock en mängd förändringar i hjärtat skivor, vilket återspeglas i deras RNAseq data, som visade över 10 gånger nedreglering av hjärtgen uttryck så tidigt som den första tidpunkten för bedömning (dag 8)16. Men i vårt optimerade kultursystem uttrycktes endast 2 och 5 avskrifter signifikant efter 2 respektive 6 dagar i kultur jämfört med färsk hjärtvävnad. Men efter 10 dagar i kultur, det fanns betydande förändringar i uttrycket av över 500 utskrifter. De nedreglerade generna efter 10 dagar i kulturen var mestadels relaterade till hjärtmuskeln, medan de uppreglerade generna är relaterade till fibroblaster, extracellulär matris och inflammation13. Tabell 1 innehåller en fullständig jämförelse av skivnings- och kulturprotokoll mellan Fischer et al.16 och Ou et al.13. Därför emulerar vårt biomimetiska stimulerade kultursystem de kontrollerbara förhållanden som hjärtat upplever på plats och bör därför ge en tillförlitlig avläsning av de funktionella och strukturella resultaten av läkemedelsbehandling med avseende på akut kardiotoxicitet eller effekt jämfört med komprometterade kultursystem.
En av de stora begränsningarna i detta kultursystem är att även om vårt kultursystem kan efterlikna flera fysiologiska tillstånd, kan det inte efterlikna förändringar i mekanisk belastning och skjuvstress under hjärt contractile cykeln. Ytterligare optimering av fysiologiska och metaboliska faktorer kan bidra till att förlänga hjärtat skiva livskraft och funktion. Dessutom märkte vi en tidig anpassning som leder till försvagning av oxidativ fosforylering som kan anstifta försämring av hjärtat skiva livskraft13. Tyvärr, hittills, kunde vi inte identifiera en optimal metod för att upprätthålla oxidativ fosforylering. Det är troligt att öka fettsyra metabolism i hjärtat skivor är inte så enkelt som att lägga fettsyror till tillväxtmediet, och kommer att kräva ytterligare optimering, som skulle kunna åtgärdas i framtida studier. Dessutom är en allmän svaghet i detta tillvägagångssätt den saknade mätning av åtgärder potentialer på enstaka kardiomyocyter i hjärtat skiva, vilket är viktigt att visa störningar i elektrokardiogram och ventrikulärt arytmi. Därför finns det ett behov av att optimera protokoll för att isolera enstaka kardiomyocyter från hjärtat skivor efter behandling med kardiotoxiner som inducerar störningar i elektrokardiogram och bedöma deras effekt på den potentiella effekten på isolerade kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM har eget kapital i Tenaya Therapeutics. De andra författarna rapporterar inga konflikter.
Acknowledgments
TMAM stöds av NIH-bidraget P30GM127607 och American Heart Association grant 16SDG29950012. RB stöds av P01HL78825 och UM1HL113530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
