Summary
Bu protokol, 6 gün boyunca fizyolojik koşullar altında kalp dokusunun nasıl dilimlenir ve kültürlenir. Bu kültür sistemi yeni kalp yetmezliği terapötik etkinliğini test etmek için bir platform olarak yanı sıra bir 3D kalp modelinde akut kardiyotoksisite güvenilir test olarak kullanılabilir.
Abstract
Birçok yeni ilaçlar şu anda mevcut in vitro tahliller ve in vivo hayvan modelleri kötü insan kardiyak yükümlülüklerini tahmin olarak kardiyotoksik yan etkileri nedeniyle klinik çalışmalarda başarısız, ilaç endüstrisi üzerinde multi-milyar dolarlık bir yük poz. Bu nedenle, pahalı ve zaman alıcı 'insan ilk' denemeler üstlenmeden önce ilaç kardiyotoksisite belirlemek için daha iyi yaklaşımlar için dünya çapında karşılanmamış tıbbi ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece olgunlaşmamış kalp hücreleri (insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler [hiPSC-CMs]) onlar uzun süre kültürlenebilir tek insan kalp hücreleri olarak terapötik verimlilik ve ilaç toksisitesi test etmek için kullanılır uyuşturucu etkinliğini ve toksisitesini test etmek için gereklidir. Ancak, tek bir hücre tipi birden fazla hücre tipi oluşan karmaşık 3D kalp dokusunun fenotip kopyalayamaz. Daha da önemlisi, ilaçların etkisi yetişkin kardiyomiyositler üzerinde test edilmesi gerekir, hangi farklı özellikleri ve toksisite yanıtları olgunlaşmamış hiPSC-CMs ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, insan kalp dokusunu taklit eden ve insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını yansıtan tam bir çok hücreli sisteme erişim sağlar. Son zamanlarda, kültür medya bileşenlerinin optimizasyonu ve kültür koşulları nın 1.2 Hz'de sürekli elektriksel uyarımı ve kültür ortamının aralıklı oksijenletılmasını içermesi ile, yaşanabilirliği koruyan yeni bir kültür sistemi kurulumu geliştirdik. ve kültürde 6 gün boyunca insan ve domuz kalp dilimleri işlevselliği. Mevcut protokolde, domuz kalbini dilimleme ve dilimleme yöntemini örnek olarak ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Aynı protokol insan, köpek, koyun veya kedi kalplerinden gelen kültür dilimleri için kullanılır. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatır akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir.
Introduction
İlaca bağlı kardiyotoksisite piyasa çekilmesi önemli bir nedenidir1. 20. yüzyılın son on yılında, sekiz non-kardiyovasküler ilaçlar piyasadan çekildi onlar ventriküler aritmiler nedeniyle ani ölümle sonuçlandı2. Buna ek olarak, çeşitli anti-kanser tedavileri (birçok durumda etkili iken) kardiyomiyopati ve aritmiler de dahil olmak üzere çeşitli kardiyotoksik etkilere yol açabilir. Örneğin, hem geleneksel (örneğin, antrasiklinler ve radyasyon) ve hedeflenen (örneğin, trastuzumab) meme kanseri tedavileri hastaların bir alt kümesinde kardiyovasküler komplikasyonlara neden olabilir3. Kardiyologlar ve onkologlar arasında yakın bir işbirliği ("kardiyo-onkoloji" gelişmekte olan alan üzerinden) hastaların etkili bir şekilde tedavi edilebilir sağlanması bu komplikasyonları yönetilebilir hale yardımcı oldu2. Her2 ve PI3K inhibitörleri de dahil olmak üzere yeni ajanların kardiyovasküler etkileri daha az belirgindir, özellikle tedaviler birlikte kullanıldığında. Bu nedenle, insan klinik çalışmalar öncesinde ortaya çıkan anti-kanser tedavileri ile ilişkili kardiyovasküler toksisite için güvenilir preklinik tarama stratejileri için artan bir ihtiyaç vardır. 24 saatten fazla işlevsel ve yapısal olarak uygulanabilir olan insan kalp dokusu için kültür sistemlerinin bulunmaması güvenilir kardiyotoksisite testi için sınırlayıcı bir faktördür. Bu nedenle, ilaç toksisitesi test etmek için fizyolojik koşullar altında insan kalp dokusu kültüriçin güvenilir bir sistem geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Kardiyotoksisite testlerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPSC-CMs) kullanımına yönelik son hamle, bu sorunu çözmek için kısmi bir çözüm sağlamıştır; ancak, hiPSC-CMs olgunlaşmamış doğası ve kalp dokusunun çok hücreli doğası ile karşılaştırıldığında doku bütünlüğünün kaybı bu teknolojinin önemli sınırlamalar vardır4. Yakın tarihli bir çalışma kısmen hidrojeller üzerinde hiPSC-CMs kardiyak dokuların imalatı ve zaman içinde elektriksel stimülasyon kademeli artışa tabi ile bu sınırlama üstesinden gelmiştir5. Ancak, elektromekanik özellikleri yetişkin insan miyokardinde görülen olgunluğa ulaşamadı. Ayrıca, kalp dokusu yapısal olarak daha karmaşıktır, endotel hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri oluşan, nöronlar ve stromal fibroblastlar çeşitli türleri ile birlikte hücre dışı matriks proteinlerinin çok özel bir karışımı ile bağlantılı6. Erişkin memeli kalpte kardiyomiyosit hücre popülasyonu7,8,9 bu heterojenlik tek tek hücre tipleri kullanılarak kalp dokusumodellemesinde önemli bir engeldir. Bu önemli sınırlamalar kalbin fizyolojik ve patolojik koşullarını içeren optimal çalışmalar için bozulmamış kardiyak doku kültürünü sağlamak için yöntemler geliştirmenin önemini vurgulamak5.
Culturing insan kalp dilimleri bozulmamış insan miyokardiyum umut verici bir modeldir. Bu teknoloji, insan miyokardinin fizyolojik veya patolojik koşullarını güvenilir bir şekilde yansıtabilecek insan kalp dokusuna benzeyen tam bir 3Boyutlu çok hücreli sisteme erişim sağlar. Ancak, kullanımı ciddi 2018 10,11,,12kadar bildirilen en sağlam protokolleri kullanarak 24 saat ötesine geçmez kültür, canlılık kısa süre ile sınırlı olmuştur.12 Bu sınırlama, dilimleri kültüre getirmek için hava-sıvı arabiriminin kullanımı ve kardiyak dokunun yüksek enerjik taleplerini desteklemeyen basit bir kültür ortamının kullanımı da dahil olmak üzere birden fazla faktörden kaynaklandı. Biz son zamanlarda sürekli elektrik stimülasyon sağlamak mümkün ve kadar 6 gün13için kardiyak doku dilimleri canlı tutmak için kültür medya bileşenleri optimize bir batık kültür sistemi geliştirdik. Bu kültür sistemi preklinik ve klinik test sonuçları arasındaki boşluğu kapatmak için akut kardiyotoksisite testi için yerinde güçlü bir tahmine sahip insan olma potansiyeline sahiptir. Mevcut makalede, bir örnek olarak bir domuz kalbi kullanarak kalp dilimleri dilimleme ve kültüriçin protokol ayrıntılı vardır. Aynı işlem insan, köpek, koyun veya kedi kalpleri için de uygulanır. Bu protokolle, teknolojiyi bilim camiasındaki diğer laboratuvarlara yaymayı umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Louisville Üniversitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Dilimleme için hazırlık (Dilimlemeden Bir Gün Önce)
- Titreşimli mikrotomun hazırlanması
- Seramik bıçağı şu adımları izleyerek tutucuya yerleştirin: bıçağı dikkatlice açtıktan sonra keskin kenarı önce bıçak aletinin yuvasına yerleştirin. Daha sonra, tutucunun kollarındaki iki vidayı gevşeterek bıçağı tutucuya takın ve bıçağı her yıkayıcının altına kaydırın ve arka stoplara sıkıca geri itin. Bıçağı sabitlemek için vidaları sıkın.
NOT: Vidalar aşırı sıkılaştırılmamalıdır. - Kalibrasyon protokolünü ve araçlarını kullanarak bıçağı üreticinin protokolüne göre kalibre edin.
NOT: Kısaca, bıçağın seyahat ekseni ile hizalanmasını kolaylaştırmak ve Z eksenindeki sapmaları en aza indirmek için titreşimli mikrotom sökülebilir bir kalibrasyon cihazı kullanır. Kalibrasyon cihazı cihaza takıldığında varlığı otomatik olarak algılanır ve titreşen mikrotom bıçağın genlik ve frekans ayarlarını en iyi şekilde bıçak hizalama hatasının ayarlanmasına olanak sağlayacak bir büyüklüğe ayarlamayı kontrol altına alır.- En iyi hizalama değerlendirmesi için kesme kenarının kalibrasyon cihazına göre en uygun konumda olması için bıçağı otomatik olarak hareket ettirecek hizalama işlemini başlatmak için Dilim düğmesine basın. Z hizasının 1 μm'lik bir mesafede olduğundan emin olmak için sağlanan tornavidayı kullanarak bıçakta ayarlamalar yapmak için ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Otoklav iç banyo ve titreşen mikrotom tüm metal parçaları.
- Seramik bıçağı şu adımları izleyerek tutucuya yerleştirin: bıçağı dikkatlice açtıktan sonra keskin kenarı önce bıçak aletinin yuvasına yerleştirin. Daha sonra, tutucunun kollarındaki iki vidayı gevşeterek bıçağı tutucuya takın ve bıçağı her yıkayıcının altına kaydırın ve arka stoplara sıkıca geri itin. Bıçağı sabitlemek için vidaları sıkın.
- Büyük metal tepsileri (dilimleri toplamak ve elektrikstimülasyon plakası kapakları ıslatmak için), herhangi bir cam kap, düzenli dikdörtgen bıçaklar, forsepsler, makas, yazıcı zamanlama kayışı (6 mm genişliğinde parçalar halinde kesilmiş), metal yıkağılar ve 5 L çift distile su (ddH2O).
- Kardiyoplegic solüsyon ile kalp için bir adet 1 L kavanoz, bir adet 500 mL kavanoz ve bir plastik tepsi yi sterilize edin.
- Dilimleme Tyrode çözeltisinin 2 L'sini 2 L kabında hazırlayın.
- Dilimleme Tyrode çözeltisinin 1 L'si için 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoz (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 1 M çözelti), 1,8 mM CaCl2 (1 MM çözelti1,8 mL), 1 L ddH2O. NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
- Kardiyoplejik çözeltinin 4 L'sini hazırlayın.
- Kardiyoplegic çözeltinin 1 L'si için 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1 M Çözelti1,2 mL), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, 1 L ddH2O.NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
NOT: Kardiyopleji çözeltisinde dilimleme gününe 1.000 U/L heparin ekleyin (bkz. adım 2.1).
- Kardiyoplegic çözeltinin 1 L'si için 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1 M Çözelti1,2 mL), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL heparin, 1 L ddH2O.NaOH kullanarak pH'ı 7.40'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 1.000 mL, 0,22 m m, vakum filtresi/depolama sistemi kullanarak filtreleyin ve bir gecede 4 °C'de saklayın.
- Yeni bir biyogüvenlik kabine orijinal şişe kültür orta 500 mL hazırlamak: mix orta 199, 1x insülin-transferrin-selenyum (ITS) takviyesi, 10% fetal sığır serum (FBS), 5 ng / mL vasküler endotelal büyüme faktörü (VEGF), 10 ng / mL FGF-temel, ve 2x antibiyotik-antimikotik. Filtre 0,22 μm, vakum filtre / depolama sistemi ile sterilize ve 4 ° C gecede saklayın.
NOT: PH'ı ayarlamayın, kullanmadan önce VEGF ve FGF'yi taze olarak ekleyin. - % 4 agar jel plakaları hazırlayın.
- 500 mL sterilize edilmiş bir şişeye 200 mL steril ddH2O ekleyin. Tartmak 8 g agarose, ve yavaşça şişe içine dökün. Bir mikrodalga 2 dakika kaynatın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika soğutun.
- Her 100 mm Petri kabına 25 mL'lik bir biyogüvenlik kabinine dökün (6 tabak hazırlayın) ve katılaşmak için 1 saat bekleyin. Daha sonra tabakları parafin filmle kapatın, temiz sargı ile sarın ve 4 °C'de saklayın.
- Otoklavd ddH2O 200-proof mutlak etanol seyrelterek% 70 etanol 4 L hazırlayın.
- SterilddH2 O 2x antibiyotik-antimikotik hazırlayın: biyogüvenlik kabinesi altında 20 mL antibiyotik-antimikotik ile steril ddH2O 980 mL karıştırın.
2. Domuz Kalp Perfüzyon
- Kardiyoplegic çözeltinin her 1 L'sine 1 000 U/mL heparin 1 mL ekleyin. Çözeltiyi buzda tut.
NOT: Doku kültür odasına transfer sırasında kalbin perfüzyonu ve korunması için en az 3 L gereklidir. - Domuz ameliyathanesine aşağıdaki öğeleri alın: buz dolu büyük bir buz kovası, bir steril metal tepsi (kalp perfüzyonu için buz kovası üzerinde tutmak), bir sterilize 500 mL kavanoz, bir 1 L kavanoz (kardiyopleji çözeltisi geri doku kültür odasına kalp aktarmak için , buz üzerinde), ve bir sterilize plastik tepsi buz dolu (buz üzerinde kardiyoplejik çözüm tutmak için).
- 3 yönlü stopcock, 60 mL şırınga, 18 G kelebek iğne kateter ve kardiyoplegic solüsyon rezervuarına uzatma tüpü içeren yerinde kalp perfüzyon sistemi hazırlayın.
- Yorkshire erkek domuz (2−3 aylık, 20−25 kg) ilk ketamin (20 mg/kg)/xylazine (2 mg/kg) kokteyl intibak ile anestezi. Çene gerginliği kaybı ile uygun anestezi onaylayın. Daha sonra, ameliyathaneye domuz transfer, entübatve mekanik olarak daha önce açıklandığı gibi akciğerlerihavalandırmak 14.
- Anesteziyi %1,5−2 ile koruyun isoflurane.
- Sağ yan pozisyonda hayvan yerleştirin ve göğüs bölgesinden kürk tıraş. Alkol scrub ile cildi temizleyin, sonra% 10 (w / v) povison-iyot çözeltisi ile cerrahi site sterilize.
- 4interkostal alanda bir neşter kullanarak sol torakotomi kesi tarafından göğüs açın, ve göğüs açık tutmak ve kalp maruz kaburga arasında bir göğüs retraktör kullanın.
NOT: Bu işlem için tüm sterilize aletleri kullanın. - Kelebek iğne kateterini sol atriyuma yerleştirin ve iğneyi bir çanta ipi kapatmasıyla düzeltin. Bolus dozheparin (100 U/kg) intravenöz enjeksiyondan sonra, sol atriyal kateter ile 500 mL buz gibi kardiyoplegic solüsyon (kalp hızını yavaşlatmak için) ile kalbi yerinde perfüzyon başlar.
- %5 isoflurane ile domuzu derinden anestezi yedirin. Hızlı bir şekilde cerrahi makas ile göğüs kalbini dışarı çıkarmak. Aort aort bir aort kanül ile kanül ve vaskülature kan dışarı floş için buz gibi soğuk kardiyoplejik çözelti (100 mL / dk) başka bir 1 L ile in vitro kalp perpin.
- Kalp perfüzyonu sonrasında, kalbi buz gibi kardiyopleji solüsyonu ile dolu 1 L'lik bir kavanozda tutun ve doku kültür odasına transfer sırasında buzda tutun.
3. Domuz Kalp Dokusu Dilimleme
- Vibratom üzerinde doku banyosu kurmak, doku banyosu soğutma ceket buz ekleyin, sonra doku banyosu içine Tyrode çözeltisi ekleyin. Doku banyosu soğutma ceket erimiş buz bertaraf toplamak için 1 L plastik kavanoz ayarlayın.
- Biyogüvenlik dolabıaltında domuz kalbini 1 L taze soğuk kardiyoplejik solüsyon içeren bir tepsiye aktarın.
- Geri çekilebilir steril neşterler kullanarak sol ventrikül izole etmek için kalp diseksiyon. Daha sonra, jilet dikdörtgen bıçaklar kullanarak 1−2 cm3 her bloklar halinde sol ventrikül kesin. Dilimleme için tek parça kullanın ve gerekirse daha sonra kesmek için buz üzerinde soğuk Tyrode çözeltisi 50 mL tüp içinde kalan parçaları tutun.
NOT: Özellikle bu ikinci blok ise, elile dilimleme önce doku masaj. Masaj doğru kas lif yapılandırması geri yardımcı olur ve kalp bloğu içinde herhangi bir sertlik önler. - Metal numune tutucuya 1−2 damla doku tutkal(Malzeme Tablosu)ekleyin ve yaklaşık 1 cm2yüzey alanına sahip %4'lük agar bloğundan bir parça yapıştırın.
- Agar üzerine 1−2 damla doku tutkal ekleyin.
- Kalp bloğunu agar'a yapıştırın ve kardiyak epikardiyum tarafı doku tutkalına bakacak şekilde ve mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Daha sonra, vibratom dilimleme banyosunda konumuna kalp bloğu ile doku tutucu aktarın.
- Dilimleme banyosu ve metal tepsi dilimleme banyosu (oksijenli Tyrode banyosu) toplamak için Tyrode çözeltisi ile dolu oksijen tüpü takın. Daha sonra, kesme den sonra dilimleri toplamak için metal tepsiye 40 μm hücresüzler ekleyin.
- Dilimleme konumunu ayarlama
- Vibratom işletim yazılımını ve gösterge panelini kullanarak bıçağın/numunenin yüksekliğini ayarlayın. Yükseklik düğmesini seçin ve yüksekliği ayarlamak için ekrandaki yönergeleri izleyin. İdeal olarak, bıçak doku üst yakın ama papiller kasların altında var ve dilimleme önce doku ve bıçak kapsayan sıvı olduğundan emin olun.
- İleri düğmesini seçerek dokuyu dilimlemeye başlayacağınız yeri ayarlayın. Dilim düğmesine basın ve bıçağı dokunun kenarına doğru hareket ettirmek için düğmeyi kullanarak hızı artırın. Ardından, durdurmak için tekrar dilime basın ve işlemi etkinleştirmek için önceden düğmesine basın.
- Kesme parametrelerini ayarlayın: ilerleme hızı = 0,03 mm/s, titreşim frekansı = 80 Hz ve yatay titreşim genliği = 2 mm. Ardından dilim düğmesini seçerek dilimlemeye başlayın.
- Vibratom un doku sonuna ulaşana kadar ancak numune tutucunun arka ucuna çarpmadan önce dilimlesin. Bu noktada, durdurmak için tekrar dilime basın. Başlangıç konumuna geri dönmek için İade düğmesine basın.
- Titreşen mikrotomun dilimleme işlemini 99 kez otomatik olarak tekrarlamasını sağlayacak otomatik yinelemeyi (iki kez tıklatarak) seçin.
- Dilimleri toplama
- Dilimler tam uzunlukta ve iyi görünene kadar bekleyin (papiller kas katmanları geçtikten sonra), sonra dilimleri toplamaya başlayın.
- Yavaşça banyodan doku kapmak için soğuk Tyrode's çözeltisi ile dolu plastik bir Pasteur pipet kullanarak dilimleri toplamak. Gerekirse, doku hala bağlı ise kalp bloğundan dilim ayrıştırmak için forceps ve bahar makas kullanın.
- Oksijenli Tyrode banyosunda bir hücre süzgeci için dilim aktarın (adım 3.7 bakınız) ve hücre süzgeçleri üzerinde düz yalan doku almak için plastik Pasteur pipet sıvı kullanın, sonra aşağı doku tutmak için üst bir metal yıkayıcı ekleyin.
NOT: Dilimler işleme önce Tyrode çözeltisi en az 1 saat için kuluçkaya yatmalıdır (Bu BDM için doku dinlenmek için).
4. Culturing Kalp Dilimleri
-
Dilimleri kültüre hazırlama
- Pürüzsüz kenarlardan kaçınmak için dilimi kenarlardan kırpın. Daha sonra, doku tutkal kullanılarak gömülü metal teller ile sterilize poliüretan 6 mm genişliğinde yazıcı zamanlama kemeri her iki ucundan tutkal.
- Desteklenen kalp dilimlerini her kuyuda 6 mL kültür ortamı içeren 6 kuyu plakasına aktarın.
- Stimülasyon plakası kapağını(Malzeme Tablosu)6 kuyu plakasının üstüne yerleştirin ve kapağı hücre kültürü elektrik stimülatörüne bağlayın (Malzeme Tablosu). Uyarıcıyı, kalp dilimlerini sürekli olarak 10 V, 1,2 Hz'de sürekli olarak uyarmak için ayarlayın.
NOT: Uyarımı taktıktan sonra kalp dilimleri atmaya başlar ve bu hareket görsel olarak belirgin olacaktır. - Plakaları bir kuvöze aktarın ve 37 °C'de nemli hava ve %5 CO2ile koruyun.
- Kültür ortamını günde 3 x değiştirin ve her ortam değişikliği sırasında her kuyu başına 6 mL kültür ortamı ekleyin.
NOT: Kültür ortamı her ortam değişikliğinden önce 5 dakika oksijenlenir. Orta günde en az 1x değiştirilmelidir; gerekirse hafta sonları sorun yok. Günde sadece 1 ortam değişikliği iki gün test edilen maksimum. -
Kültür ortamında (genellikle gün ortası ortam değişimi sırasında) toksik grafit parçacıklarının salınımını önlemek için stimülasyon plakası kapağını her gün değiştirin.
- Uyarım plakası kapağını kültür çanağından çıkarın ve elektrik devresinin su hasarını önlemek için kapağın hücre kültürü elektrik uyarıcısı için kabloya bağlandığı beyaz köpük fişini takın.
- 2x antibiyotik-antimikotik ile otoklavlı su banyosunda plaka kapağı yerleştirin. Bu banyoda saklayın (yani, durulama banyosu) bir gecede.
- Ertesi gün, dekontamine 5−15 dakika için% 70 etanol banyo içine plaka kapağı hareket ettirin. Banyoları değiştirmeden önce cihazdan çok fazla sıvı çalkalayın.
- Daha sonra, otoklavlı su ve 2x antibakteriyel-antimikotik oluşan üçüncü ve son banyo (yani, temiz banyo), herhangi bir kalan etanol izleri durulamak için plaka kapağı aktarın.
- Temiz banyoda plaka kapağını duruladıktan sonra, plastik parçalar daki artık suyu kurutmak için temiz bir tüy bırakmayan mendil (etanol ile püskürtülür) kullanın, ardından beyaz köpük parçasını çıkarın ve plaka kapağını kültür plakasına dikkatlice yerleştirin.
NOT: Cihaz artık steril olmayacağından, kuyuya giren siyah grafit elektrotlara dokunmayın. - Steril çalgılar kullanarak, plaka kapağı doku dokunmaz böylece doku kuyunun merkezinde olduğundan emin olun. Plaka örtüsünün kavisli tarafının plakanın açılı tarafıyla eşleştiğinden ve kare köşelerin hizaya olduğundan emin olun.
NOT: Stimülasyon plakası kapaklarının kontaminasyonunu en aza indirmek için, deneyi tamamladıktan sonra temiz ve boş 6 kuyu plakasında saklayın.
- Taze domuz kalp dilimleri (gün 0) üzerinde bir MTT tayini, kalsiyum ölçümleri ve kontraktil fonksiyon değerlendirmeleri gerçekleştirin ve Ou ve ark.13göre kültürde 6 gün sonra .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aynı anda sekiz 6 kuyu plakaları barındırabilir bir ticari hücre kültürü elektrik uyarıcı kullanarak, fizyolojik frekansta elektriksel stimülasyon indükleyerek yetişkin kardiyak ortam taklit (1.2 Hz), ve kültür fonksiyonel domuz kalp dilimleri süresini uzatmak için temel orta bileşenleri için taranmış13. Domuz ve insan kalpleri boyutu ve anatomi15benzer olduğundan, biz domuz kalpleri kullanarak bir biyomimetik kalp dilimi kültür sistemi geliştirdi ve daha sonra insan kalp dilimleri içinde doğruladı. Burada, insan kalp dilimleme ve kültür için aynı prosedür domuz kalp dilimleri için protokol ayrıntılı. Burada açıklanan yeni biyomimetik kültür kurulumu, MTT tsurel tarafından değerlendirildiği gibi 6 gün boyunca domuz kalp dilimlerinin canlılığını korudu (Şekil 1A). Kalsiyum homeostazlarını ve kontraktil kuvvetlerini değerlendirerek bu dilimlerin 6 gün boyunca fonksiyonel canlılığını doğruladık. İlk 6 gün içinde kardiyomiyositlerde spontan kalsiyum geçiciliği yoktur ve kardiyomiyositler eksternal elektriksel stimülasyona ve taze kalp dilimlerine benzer β-adrenerjik stimülasyona yanıt verecektir(Şekil 1B). Buna ek olarak, kontraktil kuvvet ve izoproterenol yanıtları kadar kültürlü kalp dilimleri tutulur 6 gün, taze kalp dilimleri benzer(Şekil 1C,D).
Şekil 1: Domuz kalp dilimi kültürünün canlılığının ve işlevselliğinin doğrulanması. (A) Kalp diliminin zaman içinde ölçülmesi, optimize edilmiş ortamda uyarılmış veya uyarılmamış kültür sisteminde MTT testi kullanılarak ölçülebilir (n = 5 domuz kalbi her biri triplicate olarak, SEM hata çubukları olarak temsil edilir; gruplar arasında karşılaştırmak için iki yönlü ANOVA testi yapılmıştır, *p < 0.05). (B) Temsili kalsiyum sinyali taze bir kalp dilimi (gün 0) ve kültür de 6 gün sonra (gün 6) ve 1 μM izoproterenol olmadan (Iso) stimülasyonu. Geçici ler kalp dilimlerifluo-4 kalsiyum boya ile yüklendikten ve kayıt sırasında 1 Hz/20 V elektriksel stimülasyon kullanılarak kaydedildi. İzoproterenol ile kalsiyum sinyal genliği ve stimülasyon olmadan sayısallaştırma kültürde 0 ve gün 6 'da benzer bir kalsiyum geçici desen gösterir (n = 4 domuz kalpleri, Her birinde analiz edilen 10−15 hücre, SEM hata çubukları olarak temsil edilir; gruplar arasında karşılaştırma yapmak için iki yönlü ANOVA testi yapılmıştır, *p < 0.05 bazini aynı anda Iso stimülasyonuile karşılaştırarak, p-değeriD0 vs D6 = 0,95 ve p-değeriD0 Iso vs D6 Iso = 0,93) yapılmıştır. (C) Sözleşmeli kuvvet değerlendirme kurulumu (sol panel); kalp dilimi (HS) elektriksel stimülasyon için iki elektrik elektrot (EE) arasında bir kuvvet dönüştürücü (FT) ve kararlı bir direğine (P) asılıdır. Uyarılma üzerine, dilim sözleşmeleri ve kasılmalar belirlenen yazılım (sağ panel) kullanılarak kaydedilir. (D) Çubuk grafiği, taze domuz kalp dilimleri (gün 0) tarafından oluşturulan izoproterenol (İso) varlığında veya yokluğunda ve biyomimetik kültürde 6 gün sonra (n = 4 domuz kalbi her biri triplicate olarak, SEM hata çubukları olarak temsil edilir; gruplar arasında karşılaştırma kkarşılaştırmak için iki yönlü ANOVA testi yapılmıştır, *p < 0.05 bazçizgisini aynı anda Iso stimülasyonla karşılaştırarak, seğirme kuvveti: p-değeriD0 vs D6 = 0,96, p-değeriD0 Iso vs D6 Iso = 0,81; zaman %50 gevşeme: p-değeri D0 vs D6 = 0.47, p-değeriD0 Iso vs D6 Iso = 0.43). Bu rakam Ou ve ark.13'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Durum | Fischer ve ark.16 | Ou ve ark.13 |
| Tür | Insan | Domuz ve insan |
| Hastalığı | Başarısız kalpler | Normal sağlıklı kalpler |
| Koruma | Korunmuş doku | Taze doku |
| Dilim kalınlığı | 300 μm | 300 μm |
| Orta Oksijenlenme | № | Aralıklı oksijenlenme |
| Kültür Orta | M199/ITS | M199/ITS/FBS/VEGF/FGF |
| Ajitasyon | Evet | № |
| Pacing oranı | 0.2 Hz | 1.2 Hz |
| Kültürün süresi | Uzlaşma ile 4 ay | 6 gün ödün vermeden |
| Cuture Sıcaklık | 37 | 37 |
| Mekanik yükleme | yardımcı yükleme | yükleme yok |
| Taze kalp dilimiile karşılaştırıldığında gen ekspresyonunda değişiklik olmayan test edilmiş zaman noktaları | Yok | 2 ve 6 gün |
| Gen ekspresyonundaki değişimi göstermek için ilk test edilen zaman noktası | 8. Gün | 10. Gün |
Tablo 1: Fischer ve ark.16 ve Ou ve ark.13'tekullanılan dilimleme ve dilimleme koşulları arasında karşılaştırma .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada basitleştirilmiş orta iş batışı (48 dilim/cihaza kadar süreçler) akut kardiyotoksisiteyi test etmek için yeterince uzun bir süre domuz kalp dilimleri kültürünü sağlayan yöntem için son zamanlarda yayınlanan yöntemimiz için ayrıntılı video protokolünü açıklıyoruz13. Önerilen koşullar, elektriksel stimülasyon sıklığı, besin kullanılabilirliği ve aralıklı oksijenasyon da dahil olmak üzere kalbin çevresini taklit eder. Biyomimetik uyarılmış kültürümüzdeki kalp dilimlerinin uzun süreli canlılığını, sağlam kalbin yaşadığı fizyolojik koşulları yeniden yaratmaya odaklanmamıza bağlıyoruz. Bu kavram, elektriksel stimülasyonun tek başına, temel besin maddesi sağlamadan, kalp diliminin canlılığını korumak için yeterli olmadığını gösteren verilerimizle desteklenir13. Bu nedenle, kültür ortamının yeni bileşenleri kültürde kalp dilimi canlılık ve işlevsellik uzatmak için önemli bir sürücü vardır. Biz yağ asitleri, eser elementler, enzimler, proteinler, makromoleküller, kimyasal bileşenler, ve hormonlar, genellikle serum mevcut ve vivo17kalp dokusuna teslim çeşitli gereksinimi nedeniyle büyük olasılıkla canlılık korumak için orta FBS dahil etmek esastır bulundu. Ayrıca, doku canlılığını artırmak için kültür ortamına FGF ve VEGF eklenmesine ihtiyaç duyulduğunu bulduk. FGF ve VEGF kültürlü endotel hücrelerinin bakımı için gerekli olan anjiyojenik faktörler bilinmektedir18. Bu nedenle, FGF ve VEGF doku canlılığını desteklemek için kültür de endotel hücreleri ve bağ dokuları korumak için gerekli olması muhtemeldir. Çalışmamız, daha önce kalp dilimlerini geliştirmek için bildirilen basitleştirilmiş kültür ortamını ilk kez değiştirmektir ve sonraki çalışmalarda medya bileşenlerinin daha fazla optimizasyonu olanağı nı açmaktadır.
Yeni yöntemimizle zamanında, biyomühendislik sistemlerinde kültür dilimlerinin korunmasında sürekli elektromekanik stimülasyonun önemini gösteren üç çalışma daha vardır16,19,20. Ancak bu çalışmalarda kalp dilimlerinin metabolik ihtiyaçlarını korumak için yeterli olmayan bazal M199/ITS ortamı kullanılmıştır. Bu dilim kontraktility ve kalsiyum homeostaz erken kültür sırasında çeşitli tavizler yol açtı16,19,20. Qiao ve ark.19, kalp dilimlerinin elektrofizyolojik özelliklerini 4 gün boyunca koruyabilen son derece gelişmiş bir biyomühendislik çipi geliştirdi, ancak kontraktil fonksiyonun değerlendirilmesi yapılmadı. Watson ve ark.20, 24 saat boyunca kardiyak kas özelliklerinin bakımı için diyastolik sarcomere uzunluğunun önemini göstermek için düşük iş gücü kültür sistemi (4 dilime kadar süreçler) biyomühendislik le uyumludur. Son olarak, Fischer ve ark.16 başarısız insan kalp dilimleri bir biyomühendislik cihazında 0.2 Hz stimülasyon, yardımcı yükleme ve medya ajitasyon altında kültürlü 4 aya kadar in vitro muhafaza edilebilir göstermiştir. Ancak, bu koşullar kalp dilimlerinde çeşitli değişikliklere neden, onların RNAseq verilerinde yansıtıldığı gibi, hangi değerlendirme ilk kez noktası (gün 8)16gibi erken kardiyak gen ekspresyonunun 10 kat downregülasyon gösterdi . Ancak, optimize edilmiş kültür sistemimizde, kültürde 2 ve 6 gün sonra taze kalp dokusuna göre sadece 2 ve 5 transkript anlamlı olarak farklı olarak ifade edildi. Ancak, kültür de 10 gün sonra, 500'den fazla transkript ifade önemli değişiklikler vardı. Kültürde 10 gün sonra indirgenmiş genler çoğunlukla kardiyak kas ile ilgili iken, upregulated genler fibroblastlar ile ilgili, ekstrasellüler matriks, ve inflamasyon13. Tablo 1 Fischer ve ark.16 ve Ou ve ark.13arasındaki dilimleme ve kültür protokollerinin tam bir karşılaştırmaiçerir. Bu nedenle, biyomimetik uyarılmış kültür sistemimiz kalbin yerinde yaşadığı kontrol edilebilir koşulları taklit eder ve bu nedenle, uyuşturucu tedavisinin akut kardiyotoksisite veya etkinliği açısından, tehlikeye atılmış kültür sistemlerine göre fonksiyonel ve yapısal sonuçlarının güvenilir bir şekilde okunmasını sağlamalıdır.
Bu kültür sisteminin en önemli sınırlamalarından biri, kültür sistemimizin çeşitli fizyolojik koşulları taklit edebilse de, kardiyak kontraktil döngü sırasında mekanik yük ve kesme gerilimindeki değişiklikleri taklit edememesidir. Fizyolojik ve metabolik faktörlerin daha fazla optimizasyon kalp dilimi canlılık ve fonksiyon uzatır yardımcı olabilir. Ayrıca, biz kalp dilimi canlılık bozulmayı kışkırtabilir oksidatif fosforilasyon azalmasına yol açan bir erken adaptasyon fark13. Ne yazık ki, şimdiye kadar oksidatif fosforilasyon korumak için en uygun yöntemi belirlemek mümkün değildi. Bu kalp dilimlerinde yağ asidi metabolizmasını artırmak büyüme ortamına yağ asitleri ekleyerek kadar basit değildir muhtemeldir, ve daha fazla optimizasyon gerektirecektir, hangi gelecekteki çalışmalarda ele alınabilir. Ayrıca, bu yaklaşımın genel bir zayıflık kalp dilimi içinde tek kardiyomiyositler üzerinde eylem potansiyellerinin eksik ölçümü, hangi elektrokardiyogram ve ventriküler aritmi bozulma göstermek için gereklidir. Bu nedenle, elektrokardiyogramda bozulmaya neden kardiyotoksinler ile tedavi den sonra kalp dilimlerinden tek kardiyomiyositizole etmek ve izole kardiyomiyositler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için protokolleri optimize etmek için bir ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMAM Tenaya Therapeutics'de hisse senedi sahibidir. Diğer yazarlar çakışma bildirmez.
Acknowledgments
TMAM NIH hibe P30GM127607 ve Amerikan Kalp Derneği hibe 16SDG29950012 tarafından desteklenir. RB P01HL78825 ve UM1HL113530 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks - | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
