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Immunology and Infection

单核细胞分离研究人类粘膜淋巴组织中先天免疫反应

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/60914
* These authors contributed equally

Summary

在本协议中,我们解释了如何轻松地处理和培养来自健康人类的扁桃体单核细胞,从接受部分手术扁桃体切除术,以研究激活时的先天免疫反应,模仿粘膜组织中的病毒感染。

Abstract

研究粘膜相关淋巴组织(MALT)的分离细胞,可以理解涉及粘膜免疫的病理学中的免疫细胞反应,因为它们可以模拟组织中宿主-病原体相互作用。虽然从组织中提取的分离细胞是第一个细胞培养模型,但由于组织难以获得,它们的使用一直被忽视。在本协议中,我们解释了如何从健康的人类扁桃体中轻松处理和培养扁桃体单核细胞(TPC),以研究激活时的先天免疫反应,模仿粘膜组织中的病毒感染。TCC与扁桃体分离是快速的,因为扁桃体几乎没有任何上皮,并产生高达数十亿所有主要免疫细胞类型。该方法允许使用多种技术检测细胞因子的产生,包括免疫测定、qPCR、显微镜、流细胞测定等,类似于从血液中使用外周单核细胞(PBMC)。此外,TPC 对药物检测的敏感性高于 PBMC,未来毒性检测需要考虑这一点。因此,前维质TCC培养是一种简单易用的粘膜模型。

Introduction

由于可及性以及明显的伦理原因,对人体器官的研究受到限制。然而,它们对于完全理解人类生物学的复杂性至关重要。分离细胞(原发物系或细胞系)的培养物是细胞生物学研究中的标准系统,因为它们的可用性。虽然分离的细胞培养允许杰出的发现,但细胞系的使用却受到更密切的审查,因为它们在体内器官生物学中并不完全模仿。然而,三维细胞或组织外植的培养高度复杂44,5,6。5,6事实上,一块组织或器官是高度异质的,因为它的细胞组成因组织中的定位而异。因此,使用组织块需要分析许多技术和生物复制,导致需要大量捐赠者或患者。

粘膜相关的淋巴组织(MALT)在结构上与淋巴结相似,但具有独特的功能,因为它们的主要作用是调节粘膜免疫7。与淋巴结(通常位于与组织距离)不同,MALT通常位于粘膜组织上皮的正下方。从组织学上讲,它们主要由高浓度的B和T细胞组成,但也由抗原呈现细胞组成,如巨噬细胞和树突细胞。MALT约占人体淋巴组织的50%。MALT根据其位置细分为九组:GALT(古特-)、BALT(布朗丘斯-)、NALT(鼻腔)、CALT(结节)、LALT(喉部)、SALT(皮肤)、VALT(vulvo-)、O-MALT(组织)和D-MALT(扩散)。O-MALT主要由瓦尔德耶扁桃体环的扁桃体组成,是最容易接触的MALT88、9。9事实上,位于奥罗巴林的扁桃体是保护消化道和呼吸道免受(潜在)侵入性微生物侵害的主要屏障10。此外,扁桃体被细分层的鳞状非角质上皮覆盖,由含有血管、神经和淋巴的结缔组织胶囊支撑,便于进入免疫细胞11,12。11,此外,扁桃体切除术是切除扁桃体手术,是治疗睡眠障碍呼吸的儿童的常见手术,使扁桃体在生理环境中很容易获得组织13。

通西尔允许研究涉及粘膜免疫的病理学中的免疫细胞反应。事实上,在HIV感染中,由于扁桃体是由高浓度的免疫细胞组成的,它们是病毒复制的主要目标,但也产生大量的细胞因子,在循环中未检测到14,15。,15在稳定状态下,各种粘膜组织(包括扁桃体)中存在罕见的先天性细胞,但基本上不在血液中。

因此,吨位体单核细胞(TPC)是一个比PBPC更相关和复杂的模型,可以回答更深刻的问题。另一方面,组织外植物的使用可能很复杂,并不总是与先天免疫研究相关。因此,我们建立了一个模型来研究使用TCC16粘膜免疫活化。在这里,我们描述了一种将TCC与新鲜人类扁桃体有效隔离的方法。这种方法允许恢复大量的免疫细胞,同时保持其完整性,用于前活体研究。

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Protocol

标本不是专门为研究目的收集的,研究不被视为侵入性。然而,人类扁桃体收集需要当地有关当局的道德批准。就我们而言,它得到了个人保护委员会(IDRCB/EUDRACT:2018A0135847)的批准。此外,请每位患者或法律代表同意获得捐赠者的个人数据(例如性别、年龄、耳鼻喉科感染史),以帮助解释实验结果。

1. 处理人体扁桃体组织

  1. 将每个捐赠者的扁桃体放入一个无菌的50 mL小瓶中,含有25 mL PBS 1x,并根据当局的建议在室温(RT)下运送到实验室(使用三级保护:小瓶、保险箱和袋子)。
    注:整个过程应在生物安全2级实验室进行。所有人类标本都应谨慎处理,因为它们以前没有合格,可能含有传染性病原体。
  2. 在每次使用之间清洁所有工具。
    1. 使用后,拆卸细胞滤网,并在装有洗涤剂溶液的浴缸中保持所有其他仪器(例如,虫子、钳子),过夜。2
    2. 刷每个器具,取出纸巾,用清水清洗。
    3. 将所有部件干燥好,然后通过将 60 个网状钢栅放在 10 个网状钢网顶部并紧紧闭环,准备电池滤网(85 mL,直径 37 mm)。
    4. 将所有工具放入无菌袋和高压灭菌器中。

2. 解剖人通西尔组织与单核细胞分离

  1. 将细胞滤网放在一个 150 x 25 mm2 (SPL150) 细胞培养盘中,并将所有仪器放入另一个 SPL150 中,使其保持无菌。
  2. 使用无菌钳将扁桃体从小瓶转移到细胞滤网中。也倒入所有的PBS,其中包含一些细胞已经出口扁桃体。如有必要,添加更多 PBS 以浸入网格。
    注:组织应始终浸入,以避免干燥。
  3. 使用钳子和手术刀去除烧灼、血腥和肌瘤组织。
    注:从儿童中删除的通西尔不需要此步骤。
  4. 使用手术刀和弯曲的钳子将组织切成直径小于0.5厘米的小片。切掉所有纸巾,以便小块随时被浸没。
  5. 将几块组织放入细胞过滤器中,用玻璃刺将其刮到网格上,直到只剩下一层非常薄的白色隔板。拆下并丢弃频闪以避免堵塞网格。
  6. 一旦所有组织被挤压通过网格,使用10 mL移液器将所有细胞悬浮液转移到网格上,并刮它最后一次。
  7. 用 10 mL 移液器将细胞悬浮液转移到无菌小瓶中。使用 PBS 1x 清洗网格和细胞滤网。让电池悬架在 RT 在工作台上休息 5 分钟。这一步允许剩余性基马、死细胞和任何释放的DNA的沉淀和聚集,并将促进下一步。
  8. 将无菌的 70 μm 筛子放在新的 50 mL 小瓶(小心地从信封中取出)上,用 10 mL 移液器轻轻将细胞悬浮液转移到上面。请勿混合悬架,因为颗粒经常出现。如果筛子堵塞,请使用无菌 1 mL 移液器尖端的背面划伤筛槽的细胞。根据需要经常更换筛子。
  9. 在250 x g下离心10分钟,在4°C下。
  10. 丢弃上清液,通过轻轻混合小瓶重新悬浮颗粒,然后将细胞重新悬浮在35 mL的PBS中。
  11. 在新的小瓶中,将新的 70 μm 筛子放在顶部,用 10 mL 移液器将细胞悬浮液转移到上面。如果筛子堵塞,请使用步骤 2.7 中详述的技术。

3. 按细胞密度梯度隔离TPC

注:可以使用 MCC 在步骤 2.10 之后使用。然而,为了获得更清晰的细胞溶液并去除其他细胞碎片和任何红细胞,建议对单核细胞进行细胞密度梯度隔离。

  1. 在新的 50 mL 小瓶中加入 15 mL 的密度梯度介质(d = 1.076 g/mL)。将 TMC 解决方案倒在密度梯度介质之上,小心尽量减少悬架与密度梯度介质的混合。
  2. 在 RT 时将溶液在 1,000 x g下离心 30 分钟,加速度并断开。
  3. 使用 10 mL 移液器拆下并丢弃上层(主要包含 PBS 1x),而不会干扰 TPC 和密度梯度介质之间的接口。
    注:TCC含有少量红细胞,因此溶液清晰。因此,PBS中TCC溶液与密度梯度介质之间的接口难以可视化。因此,在进行密度梯度之前,可以在 RPMI 1640 中重新悬浮,并辅以 20 mM HEPES(不含 FBS)。
  4. 使用无菌 1 mL 移液器尖端拆下 TCC,放入新的 50 mL 小瓶中。
  5. 通过加入含有2%胎儿牛血清(FBS)和2 mM EDTA的50 mLPBS洗涤细胞,在4°C下以250 x g将管子离心10分钟,以去除剩余的血小板。
  6. 重复步骤 3.5,但在 4 °C 下以 400 x g将管离心 10 分钟。
  7. 制备培养介质(R10),将RPMI 1640与10%热灭活FBS、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素溶液(100 U/mL青霉素和100微克/mL链球菌霉素)补充。
  8. 在 10 mL R10 中重新挂起 TMC 并计数电池。平均而言,该技术每对扁桃体产生 5 x 108-2 x 109 TFC。这些细胞现在可用于研究,如来自全血的PBMC(例如,特定细胞类型的纯化、细胞培养、流动细胞学、RT-qPCR、冷冻等)。
  9. 如果需要,使用标准技术冻结细胞以进一步使用。
    1. 计算单元格数。
    2. 离心细胞并取出上清液。将颗粒溶解在足够 100% 的 FBS 中,最终浓度为 1 x 108细胞/mL,然后加入相同体积的 80% FBS = 20% DMSO 溶液。细胞将在5 x 107细胞/mL。此步骤应在 4°C 下完成,在使用前应将 FBS 和 DMSO 溶液保持在 4 °C。
    3. 将1 mL的细胞溶液分发到冷冻管中,并将其放入一个缓慢冷冻容器中,该容器在4°C下过夜,以控制细胞冷冻速率。将其置于-80°C。
    4. 要解冻细胞,在37°C的温浴中放置低温,持续搅拌几秒钟。细胞一旦开始解冻,将其转移到49 mL的R10和离心机,以去除DMSO。对单元格进行计数,并将其用作 PBMC。
      注:虽然冷冻和解冻TCC将清除碎片,但它也会损害一些罕见的细胞类型。如果解冻后出现结块或碎屑,最好在使用之前通过无菌的 70 μm 筛子通过细胞悬浮液。

4. 按流细胞测定对TPC的Phenotyy)进行

  1. 从需要测试的每个抗体混合物面板的先前溶液中回收 5 x 106个细胞,并将其放入 5 mL 细胞测量管中。检索未染色控件的 1 x 106个单元格。
  2. 在4°C下以400 x g清洗PBS和离心机中的细胞5分钟。将其悬浮在 500 μL 的 PBS(1 x 106细胞/mL)中,在黑暗中以 4°C 的活性污渍孵育 30 分钟。
  3. 每100 μL细胞悬浮液加入5μL热灭活人类AB血清,在黑暗中4°C孵育15分钟。
  4. 在 4 °C 下,将 PBS 中的电池 + 2% FBS = 2 mM EDTA(洗涤缓冲液)和离心机在 400 x g下 5 分钟。
  5. 在含有抗体的500μL中重新悬浮TCC,如表1所述。在黑暗中4°C下孵育细胞30分钟。
  6. 在4°C下以400 x g清洗洗涤缓冲液和离心机中的细胞5分钟。在含有0.5%甲醛(PFA)的PBS500μL中重新悬浮MCC。保持在4°C的黑暗,直到通过流细胞测定采集。
    注:PFA 是危险的。使用商业即用即用解决方案准备 0.5% 的 PFA 解决方案。
抗体 克隆 氟铬 公司
活死 BV405 赛默费舍尔科学
CD3 SP34-2 V500 BD 普芬根
CD8 SK1 阿姆奇扬 BD 普芬根
CD8 BW135/80 维奥蓝 米尔泰尼·比奥泰克
CD4 RPA-T4 PE-Cy7 BD 普芬根
CD45 喜30 PerCP-cy5.5 屋宇 署
CD19 HD237 幼儿发展 贝克曼·库尔特
CD20 2H7 亚历克萨·弗卢700 BD 普芬根
CD14 M5E2 PE-cy7 BD 普芬根
CD14 M5E2 Apc BD 普芬根
CD16 3G8 APC-H7 BD 普芬根
CD56 MEM188 体育 BD 普芬根
CD123 7G3 体育 BD 普芬根
BDCA-1 L161 太平洋蓝色 BD 普芬根
BDCA-3 公元5-14H12 FITC 米尔泰尼·比奥泰克
BDCA-4 公元5-17F6 Apc 米尔泰尼·比奥泰克
HLA-DR G646-6 PerCP-cy5.5 BD 普芬根
CD11c 3.9 亚历克萨·弗卢700 ebioscience

表1:流动细胞测定细胞表征抗体清单。

5. TPC激活和细胞因子生产测量的例子

  1. 稀释 R10 介质中的 TMC,获得 2 x 106细胞/mL 的浓度。
  2. 在 96 个井圆底板上以 200 μL 的 R10 分配 400,000 个 TCC。
  3. 要激活细胞,请隔夜加入TLR7/8激动剂(R848)的5μg/mL。
  4. 离心板并取回TPC的上清液,并冷冻以进行进一步分析。细胞因子的生产将使用基于珠子的免疫测定来评估,以便根据制造商的协议,使用流动细胞仪同时量化多可溶性细胞因子。
  5. 按照制造商的协议,使用发光细胞可行性测定评估细胞的可行性。简单地说,在孔中加入60μL的细胞活力溶液,并在10分钟内测量发光(1 s/孔的采集)。

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Representative Results

我们首先对培养中存在的细胞的免疫特征进行了特征分析,并分析了TCC的含量。我们用流细胞测定从扁桃体中输入TPC。如图1所示,血液中PBMC中存在的所有主要免疫细胞类型都代表扁桃体中的TPC。然而,在TPC中,除B细胞外,所有细胞类型的频率都低于PBMC。

Figure 1
图1:吨位中TPC的菲菲平。从健康捐赠者那里获得TCC,是在解剖人类扁桃体组织和分离细胞后获得的。(A) 细胞被染色,数据是通过流细胞学获得的。数据表示具有代表性的实验。(B) 该表汇总了六种不同健康捐赠者以扁桃体为单位的活TCC中每个细胞类型的百分比,并将每个细胞类型与血液中PBMC中每个细胞类型的百分比进行比较,如文献18、19,19所定义。数据显示为活单元格 SD 的百分比。请点击此处查看此图形的较大版本。

然后,我们测试了TPC的免疫反应。重现细胞对病原体的活化的一种方法是刺激来自Toll-Like受体(TVR)家族的先天免疫传感器。TMR主要存在于单核细胞/巨噬细胞、所有树突细胞(DC)亚型、血浆细胞树突细胞(pDC)以及B细胞中。在此示例中,我们研究了 TLR7 和 TLR8,因为它们专门从事抗病毒反应,大多数扁桃体炎(即扁桃体感染)是由病毒感染引起的。因此,来自七个健康捐赠者的扁桃体(蓝色图)的TCC在一夜之间用TLR7/8配体(R848)受到刺激。与 PBMC(绿色图形)一样,通过 TLR7/8 信令激活触发了 I 型干扰素 (IFN) 和亲炎细胞因子的生产。事实上,在激活时,在TPC中产生率最大的细胞因子是IFN®,I IFN型家族的成员,主要参与对病毒感染的先天免疫,主要由pDC生产。除IFN2/3和IL-8外,所有被测试的细胞因子都是由TCC生产的,尽管其水平低于PBMC。 有趣的是,一些细胞因子(主要是IL-8,但也包括IL-6、IL-10和TNF®)在基础水平上存在较多。此外,我们比较了由分离的TPC或扁桃体组织团生产的细胞因子,如前所述的6。我们使用前17描述的 STING-37 细胞系报告器测定测量了两种细胞培养物中超清的所有类型的 IFN,并表明我们只能测量分离的 TMC 中的 IFN 水平。

Figure 2
图2:TPC在刺激时产生细胞因子。A) 纯化和分离的 TPC(蓝色)和 PBPC(绿色)在一夜之间用 R848 (5 μg/mL) 刺激。超级发电机被检索和冻结,直到使用。进行了基于珠子的免疫测定,使用流动细胞计同时量化多可溶性细胞因子。这些图表示每个测量的细胞因子每毫升的皮分图浓度。折叠增加在图表上用红色表示。曼-惠特尼U测试。(B) 用甲型流感病毒 (IAV) 刺激扁桃体(蓝色)和扁桃体组织群(橙色)的纯化和分离性 TCC 24 小时。STING-37记者细胞系测定用于测量上清液中的IFN产量。中间 = 最小到最大值的框和胡须图。曼-惠特尼U测试。P < 0.001, =P < 0.01, =P < 0.05.NS = 非刺激。请点击此处查看此图形的较大版本。

最后,我们测试了 TPC 的可行性。有几种技术可用于测量细胞的可行性。在这里,我们使用发光细胞可行性测定,一个简单和快速的两步测定。如图3所示,我们清楚地检测到了化合物1在TPC中引起的细胞毒性,对PBMC没有毒性。因此,TCC对所测试的药物表现出更高的敏感性。

Figure 3
图3:化合物1对TCC有毒。纯化和分离的TPC和PBMC在不同浓度下用化合物1(C1)预孵育1小时,然后用R848(5微克/米L)在一夜之间刺激。检索了超钠剂,添加了60μL的细胞活力溶液,并测量了发光。* 表示比较 C1 与 NS 的统计分析。中间 = 最小到最大值的框和胡须图。克鲁斯卡尔-瓦利斯测试与邓恩的后临时纠正。P < 0.0001, =P < 0.001, =P < 0.01, =P < 0.05.NS = 非刺激。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

人类扁桃体代表一个综合和生理的外活体模型,用于研究粘膜界面的先天免疫反应,因为它们模仿了二次淋巴器官的作用。有趣的是,TPC的细胞组成与PBMC相似,包括所有主要细胞群,尽管它们的百分比与血液中的PBMC不同(图1)。也可以发现额外的种群,因为所有的免疫反应都是在组织(粘血或继发淋巴器官)中启动的,而不是血液中。

使用人体组织外植以及使用细胞培养或血细胞各有其优点。然而,对于研究细胞因子分泌和细胞活化,组织外植不是最好的模型。事实上,我们无法检测到组织外植的上清液中的任何IFN生产(2B)。我们推测它直接被周围的细胞消耗。另一方面,刺激血细胞(PBMC)可以模仿对感染的主要反应,但不模仿组织中发生的情况,因为大多数细胞因子都是产生细胞因子的,病毒在哪里复制。因此,我们建立了一个协议,以分离和纯化由继发淋巴组织,扁桃体产生的细胞。我们从健康的人类扁桃体中纯化了TMC,这使我们能够研究刺激时的免疫细胞激活。然而,该模型的局限性之一是,TCC在TLR7/8刺激时产生的亲炎细胞因子没有TLR7/8刺激时的PBMC,尽管主要抗病毒细胞因子IFN®的水平在这两种培养物中都相似。

对TPC与PBMC的化合物毒性的研究表明,TCC对有毒药物更敏感(图3)。因此,新药的毒性和未来的治疗应在组织的细胞中进行测试,而不仅仅是在细胞系、PBMC或组织外植株上。因此,使用TMC进行药物检测似乎是未来应用所述方法。

成人或儿童的扁桃体可以获得和处理,如所述。然而,我们建议从儿童那里获得扁桃体有两个主要原因:1) 儿童扁桃体比成人的20个细胞含有更多的细胞。事实上,扁桃体肥大在儿童中特别常见,因为他们对抗更多的儿童病毒。因此,这些大扁桃体可以变成阻塞性扁桃体,需要通过局部扁桃体切除术切除,以避免并发症,如睡眠呼吸暂停13;2) 由于成人扁桃体通常在几次耳鼻喉感染后被切除,这些扁桃体不那么天真,并且包含较少的细胞。

在切除手术后,尽快处理扁桃体至关重要,最好在收集后进行<3 h。事实上,在拆卸后,直到解剖,每侧的扁桃体被保存在一个50mL无菌小瓶中,含有约20 mL的PBS,因此它们完全被淹没。

捐赠者间变异性可能是可重复性的一个主要问题。事实上,捐赠者之间的细胞组成变化可能很大。我们的协议,使用TPC,而不是组织外植,限制这种变异性,因为来自整个扁桃体的细胞在被镀层和放入培养之前混合,而组织外植带带来细胞组合的供体内变异,因为碎片来自同一标本的不同区域。部分扁桃体切除术只能在非发炎扁桃体上进行,从而限制患者之间的炎症状态变异性。我们还建议在不同日期通过手术切除收集扁桃体。我们清楚地注意到,外科医生间和日间变异性高于捐赠者间变异性(未显示数据)。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家国防和保全会的支持。H) 用于实验和 N.B. 研究金(AAP 2017 166)。N.S. 感谢ANRS对奖学金(AAP 2016 1)、欧洲分子生物学组织EMBO奖学金(LT 834 2017)、乌尔姆大学医学院(LSBN.0147)和德国福森斯格梅施泰因施夫DFG(SM 544/1)的启动资助计划的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 meshes steel grid - 1910 µm Dutscher 198586 To put in the cell strainer Cellector
60 meshes steel grid - 230 µm Dutscher 198591 To put in the cell strainer Cellector
70 µm white ClearLine cell strainers Dutscher 141379C
Anios Excell D detergent Dutscher 59852 Detergent
Antibiotic solution, 100x Thermo Fisher 15140122 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media
BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Biosciences 352063 FACS Tubes
Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter Dutscher 198585
CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay Promega G7572 Viability assay
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Conical tubes Falcon 50 mL Dutscher 352070
Curved tweezers Dutscher 711200
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without calcium and magnesium
EnVision PerkinElmer Measures the luminescence
Fetal Bovine Serum (FBS) To add to culture media
Fluorescence labeles antibodies See Table 1
Glass Pestle Dutscher 198599
Hepes (1 M) Thermo Fisher 15630056 Use at 20 mM
Incubator
LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel BioLegend 740390 Bead-based immunoassay
Lymphoprep StemCell 7801 Density gradient medium
Mr. Frosty container Thermo Fisher 5100-0001 Slow freezing container
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Fisher 28908
Resiquimod (R848) InvivoGen tlrl-r848 TLR7/8 agonist
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) Dutscher 330009
Surgical blade sterile N°23 Dutscher 132523
UltraComp eBeads Compensation Beads Thermo Fisher 01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 To make wash buffer in PBS

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免疫学和感染,第160期,粘血症相关淋巴组织,扁桃体,扁桃体单核细胞,免疫,前活细胞培养,细胞因子,宿主-病原体相互作用
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Smith, N., Bekaddour, N.,More

Smith, N., Bekaddour, N., Leboulanger, N., Richard, Y., Herbeuval, J. P. Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (160), e60914, doi:10.3791/60914 (2020).

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