Summary
In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.
Abstract
Het bestuderen van geïsoleerde cellen uit slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) maakt het mogelijk om de respons van immuuncellen in pathologieën met mucosale immuniteit te begrijpen, omdat ze gastheerpathogenische interacties in het weefsel kunnen modelleren. Terwijl geïsoleerde cellen afkomstig van weefsels waren de eerste cel cultuur model, het gebruik ervan is verwaarloosd omdat weefsel kan moeilijk te verkrijgen. In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen (TMC's) verwerken en kweken van gezonde menselijke amandelen om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in slijmvliesweefsels nabootst. Isolatie van TMC's uit de amandelen is snel, omdat de amandelen nauwelijks epitheel hebben en tot miljarden van alle grote immuunceltypes opleveren. Deze methode maakt detectie van cytokine productie met behulp van verschillende technieken, waaronder immunoassays, qPCR, microscopie, flow cytometrie, enz., vergelijkbaar met het gebruik van perifere mononucleaire cellen (PBMCs) uit bloed. Bovendien vertonen TMC's een hogere gevoeligheid voor geneesmiddelentests dan PBMCs, waarmee rekening moet worden gehouden met toekomstige toxiciteitstests. Ex vivo TMC-culturen zijn dus een eenvoudig en toegankelijk slijmvliesmodel.
Introduction
Studies over menselijke organen zijn beperkt als gevolg van toegankelijkheid en voor de hand liggende ethische redenen. Ze zijn echter essentieel om de complexiteit van de menselijke biologie volledig te begrijpen. Culturen van geïsoleerde cellen (primaire culturen of cellijnen) zijn een standaardsysteem in celbiologiestudies vanwege hun beschikbaarheid. Terwijl geïsoleerde celculturen hebben toegestaan uitstekende ontdekkingen, het gebruik van cellijnen is gekomen op nadere toetsing, omdat ze niet volledig na te bootsen in vivo orgaanbiologie. De cultuur van driedimensionale cellen of weefselexplants is echter zeer complex4,5,6. Inderdaad, een stuk weefsel of orgaan is zeer heterogeen omdat de celsamenstelling verschilt afhankelijk van de lokalisatie in het weefsel. Dus, het gebruik van weefselblokken vereist de analyse van vele technische en biologische replicaties, wat leidt tot de noodzaak van een groot aantal donoren of patiënten.
De slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) zijn structureel vergelijkbaar met de lymfeklieren, maar hebben unieke functies, omdat hun belangrijkste rol is het reguleren van slijmvliesimmuniteit7. In tegenstelling tot de lymfeklieren, die zich meestal op enige afstand van de weefsels bevinden, bevindt MALT zich over het algemeen direct onder het epitheel van het slijmvliesweefsel. Histologisch gezien bestaan ze voornamelijk uit hoge concentraties B- en T-cellen, maar ook antigeen-presenterende cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. MOUT vormen ongeveer 50% van het lymfeweefsel in het menselijk lichaam. Mout is onderverdeeld in negen groepen, afhankelijk van hun locatie: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasale-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (georganiseerd) en D-MALT (diffuus). De O-MALT bestaat voornamelijk uit de amandelen van Waldeyer's tonsillaire ring en is de meest toegankelijke MALT8,9. Inderdaad, amandelen in de oropharynx vormen de belangrijkste barrière ter bescherming van de spijsvertering en luchtwegen tegen (potentiële) invasieve micro-organismen10. Bovendien worden de amandelen bedekt met een fijne gelaagde plaveisel niet-keratiniserend epitheel, ondersteund door een capsule bindweefsel dat bloedvaten, zenuwen en lymfotica bevat, waardoor gemakkelijk toegang is tot de immuuncellen11,12. Bovendien is tonsillectomie, de chirurgische handeling van het verwijderen van amandelen, een veel voorkomende procedure uitgevoerd bij kinderen met slaapstoornissen ademhaling, waardoor amandelen een gemakkelijk beschikbaar weefsel13 in fysiologische instellingen.
Tonsils maken de studie van immuuncelrespons in pathologieën met betrekking tot mucosale immuniteit mogelijk. Inderdaad, bij hiv-infectie, omdat amandelen zijn samengesteld uit een hoge concentratie van immuuncellen, ze zijn het belangrijkste doelwit van virale replicatie, maar produceren ook een grote hoeveelheid cytokinen die niet worden gedetecteerd in de circulatie14,15. In stabiele toestanden zijn zeldzame populaties van aangeboren cellen aanwezig in verschillende slijmvliesweefsels, waaronder de amandelen, maar zijn in wezen afwezig in bloed.
Mononucleaire cellen uit amandelen (TMC's) zijn dus een relevanter en complexer model dan PBMC's en kunnen diepgaandere vragen beantwoorden. Aan de andere kant kan het gebruik van weefselexplants complex zijn en niet altijd relevant voor aangeboren immuunstudies. Zo hebben we een model opgesteld om mucosale immuunactivering te bestuderen met behulp van TMC's16. Hier beschrijven we een methode voor een efficiënte isolatie van TMC's van verse menselijke amandelen. Deze methode maakt het herstel van een groot aantal immuuncellen mogelijk terwijl hun integriteit behouden blijft voor ex vivo-studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De specimens worden niet specifiek verzameld voor onderzoeksdoeleinden en de studie wordt niet als invasief beschouwd. Echter, menselijke amandelen collectie vereist ethische goedkeuring door de lokale relevante autoriteiten. In ons geval is het goedgekeurd door het Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Bovendien wordt toestemming van elke patiënt of wettelijke vertegenwoordiger gevraagd om persoonsgegevens van donoren (bijvoorbeeld geslacht, leeftijd, geschiedenis van KNO-infecties) te verkrijgen die kunnen helpen bij het interpreteren van experimentele resultaten.
1. Behandeling van het menselijke tonsillaire weefsel
- Plaats amandelen van elke donor in één steriele flacon van 50 mL met 25 mL PBS 1x en transport bij kamertemperatuur (RT) naar het laboratorium volgens de aanbevelingen van de autoriteit (gebruik drie beschermingsniveaus: flesjes, een veiligheidsbox en een zak).
LET OP: De gehele procedure moet worden uitgevoerd in een biologisch veiligheidslaboratorium 2. Alle menselijke specimens moeten met zorg worden behandeld omdat ze niet eerder gekwalificeerd zijn en besmettelijke agentia kunnen bevatten. -
Reinig alle gereedschappen tussen elk gebruik.
- Na gebruik desgemonteerde de celzeef en bewaar met alle andere instrumenten (bijvoorbeeld stamper, tangen) in een bad met een wasmiddeloplossing (1/10 volume wasmiddel in H2O) 's nachts.
- Borstel elk gebruiksvoorwerp om het weefsel te verwijderen en was met helder water.
- Droog alle onderdelen goed, bereid de celzeef (85 mL, 37 mm diameter) door het plaatsen van een 60 mesh stalen rooster op de top van een 10 mesh stalen rooster en sluit de ring.
- Plaats alle gereedschappen in steriele zakken en autoclave.
2. Dissectie van het menselijke tonsillaire weefsel en isolatie van de Tonsillar Mononucleaire cellen (TMC's)
- Plaats de celzeef op een celkweekschotel van 150 x25 mm 2 (SPL150) en alle instrumenten in een andere SPL150 om ze steriel te houden.
- Breng de amandelen van de flacon in de cel zeef met behulp van steriele tangen. Giet ook in alle PBS, die een aantal cellen die de amandelen hebben uitgestoten bevat. Voeg indien nodig meer PBS toe om het raster onder te dompelen.
LET OP: Het weefsel moet te allen tijde worden ondergedompeld om uitdroging te voorkomen. - Verwijder cauterized, bloederig, en vleesboom weefsel met behulp van tangen en een scalpel.
LET OP: Amandelen die van kinderen worden verwijderd, hebben deze stap niet nodig. - Snijd de weefsels in kleine stukjes van minder dan 0,5 cm in diameter met behulp van de scalpel en de gebogen pincet. Snijd al het weefsel, zodat de kleine stukjes te allen tijde kunnen worden ondergedompeld.
- Plaats een paar stukjes weefsel in de cel zeef en schraap ze op het rooster met een glazen stamper tot slechts een heel dun laagje witte stroma blijft. Verwijder en gooi de stroma weg om te voorkomen dat het raster verstopt raakt.
- Zodra alle weefsels zijn geperst door het rooster, gebruik maken van een 10 mL pipet om alle cel schorsing over te dragen op het rooster en schraap het een laatste keer.
- Breng de celsuspensie met een pipet van 10 mL over in een steriele flacon. Was het rooster en de celzeef met PBS 1x. Laat de celopening 5 minuten rusten bij RT op de bank. Deze stap maakt de neerslag en agglomeratie van de overgebleven stroma, dode cellen, en alle vrijgegeven DNA, en zal de volgende stap te vergemakkelijken.
- Plaats een steriele zeef van 70 μm bovenop een nieuwe flacon van 50 mL (verwijder voorzichtig uit de envelop) en breng de celopening er voorzichtig op met een pipet van 10 mL. Meng de vering niet, want er is vaak een pellet aanwezig. Als de zeef verstopt is, gebruik dan de achterkant van een steriele pipetpunt van 1 mL om de cellen via de zeef te krassen. Verander de zeef zo vaak als nodig is.
- Centrifugeren de cellen op 250 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg en zet de pellet opnieuw op door de flacon voorzichtig te mengen en zet de cellen opnieuw op in 35 mL PBS.
- In een nieuw flesje plaatst u er een nieuwe zeef van 70 μm op en breng de celopening erop met een pipet van 10 mL. Als de zeef verstopt is, gebruikt u de techniek die in stap 2.7 is beschreven.
3. Isolatie van de TMC's door celdichtheidsgradiënt
LET OP: De TMC's kunnen worden gebruikt na stap 2.10. Echter, om een duidelijkere celoplossing te verkrijgen en om andere celpuin en rode cellen te verwijderen, wordt geadviseerd om een celdichtheidsgradiëntisolatie van de mononucleaire cellen uit te voeren.
- Voeg 15 mL van het dichtheidsgradiëntmedium (d = 1.076 g/mL) toe in een nieuwe flacon van 50 mL. Giet de TMC-oplossing bovenop het dichtheidsgradiëntmedium, waarbij voorzichtig wordt om het mengen van de suspensie met het dichtheidsgradiëntmedium te minimaliseren.
- Centrifuge de oplossing op 1.000 x g gedurende 30 minuten op RT met versnelling en afbreken.
- Verwijder met een pipet van 10 mL en gooi de bovenste laag (meestal PBS 1x) weg zonder de interface tussen de TMCs en het dichtheidsgradiëntmedium te verstoren.
LET OP: De TMCs bevat een laag aantal erytrocyten, daarom is de oplossing duidelijk. Zo kan de interface tussen de oplossing van TMC's in PBS en het dichtheidsgradiëntmedium moeilijk te visualiseren zijn. Daarom kunnen cellen opnieuw worden opgetrokken in RPMI 1640 aangevuld met 20 mM HEPES (zonder FBS) voordat het dichtheidsgradiënt wordt uitgevoerd. - Verwijder de TMC's met een steriele pipettip van 1 mL en plaats in een nieuwe flacon van 50 mL.
- Was de cellen door 50 mL PBS toe te voegen met 2% foetaal runderserum (FBS) en 2 g mM EDTA en de buis gedurende 10 minuten bij 4 °C te centrifugeren en de buis te centrifugeren om de resterende bloedplaatjes te verwijderen.
- Herhaal stap 3,5, maar centrifuge de buis op 400 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Bereid kweekmedium (R10) voor door RPMI 1640 aan te vullen met 10% warmte geïnactiveerde FBS, 2 mM L-glutamine en de antibioticumoplossing (100 U/mL penicillium en 100 μg/mL streptomycine).
- Resuspend de TMC's in 10 mL R10 en tel de cellen. Gemiddeld levert deze techniek 5 x 108-2 x 10TMC's per paar amandelen op. De cellen kunnen nu worden gebruikt voor onderzoeken zoals PBMCs uit volbloed (bijvoorbeeld zuivering van specifiek celtype, celkweek, stroomcytometrie, RT-qPCR, bevriezing, enz.).
-
Indien nodig, bevriezen van de cellen voor verder gebruik met behulp van standaard technieken voor primaire cel bevriezing.
- Tel het aantal cellen.
- Centrifugeren de cellen en verwijder de supernatant. Los de pellet op in voldoende 100% FBS voor een uiteindelijke concentratie van 1 x 108 cellen/mL en voeg vervolgens hetzelfde volume toe van een 80% FBS + 20% DMSO-oplossing. De cellen bevinden zich dan op 5 x 107 cellen/mL. Deze stap moet worden uitgevoerd bij 4 °C en de FBS- en DMSO-oplossing moet op 4 °C worden gehouden voordat deze wordt gebruikt.
- Verdeel 1 mL van de celoplossing in cryotubes en stop ze in een langzame vriescontainer die 's nachts op 4 °C is geweest om de snelheid van het bevriezen van cellen te regelen. Plaats het op -80 °C.
- Om de cellen te ontdooien, plaatst u de cryovials in een warm bad op 37 °C gedurende een paar seconden met constante agitatie. Zodra de cellen beginnen te ontdooien, breng ze naar 49 mL R10 en centrifuge om de DMSO te verwijderen. Tel de cellen en gebruik ze als PBMCs.
LET OP: Hoewel het bevriezen en ontdooien van de TMC's zal verwijderen puin, zal het ook schade aan een aantal zeldzame celtypes. Als klonten of vuil aanwezig zijn na het ontdooien, is het het beste om de celsuspensie door een steriele zeef van 70 μm te laten passeren voordat u deze gebruikt.
4. Fenotypering van TMC's door Flow Cytometry
- Haal 5 x 106 cellen uit de vorige oplossing voor elk antilichaammengselpaneel dat getest moet worden en plaats in een cytometriebuis van 5 mL. Haal 1 x 106 cellen op voor het onbevlekte besturingselement.
- Was de cellen in PBS en centrifuge op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Resuspend ze in 500 μL PBS (1 x 106 cellen/mL) en incubeer met een levensvatbaarheidsvlek gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 5 μL warmte geïnactiveerd menselijk AB serum per 100 μL celsuspensie toe en broed gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was de cellen in PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wasbuffer) en centrifuge op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- De TMC's opnieuw opschorten in 500 μL wasbuffer met de antilichamen zoals beschreven in tabel 1. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
- Was de cellen in Wasbuffer en centrifuge op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspend de TMC's in 500 μL PBS met 0,5% van paraformaldehyde (PFA). Houd in het donker op 4 °C tot de verwerving door stroom cytometrie.
LET OP: PFA is gevaarlijk. Gebruik een commerciële kant-en-klare oplossing om de 0,5% PFA-oplossing voor te bereiden.
| Antilichaam | Kloon | Fluorchrome | Bedrijf |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Wetenschappelijk | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Pacific Blauw | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiowetenschappen |
Tabel 1: Lijst van antilichamen voor celkarakterisering door stroomcytometrie.
5. Voorbeeld van activering van TMC's en meting van cytokineproductie
- Verdun de TMC's in R10 medium om een concentratie van 2 x 106 cellen/mL te krijgen.
- Verdeel 400.000 TMC's in 200 μL R10 in een 96 goed ronde bodemplaat.
- Om de cellen te activeren, voeg je 's nachts 5 μg/mL van de TLR7/8 agonist resiquimod (R848) toe.
- Centrifugeren de platen en haal de TMC's supernatant en bevriezen voor verdere analyse. Cytokine productie zal worden beoordeeld met behulp van kraal-gebaseerde immunoassays om meerdere oplosbare cytokinen gelijktijdig kwantificeren met behulp van een flow cytometer volgens het protocol van de fabrikant.
- Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een luminescente cel levensvatbaarheidstest volgens het protocol van de fabrikant. Voeg kort 60 μL celreconstieoplossing toe aan de putten en meet luminescentie binnen 10 min (acquisitie voor 1 s/well).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We kenmerkten eerst het immuunsysteem profiel van cellen aanwezig in de cultuur en analyseerden de hoeveelheid TMC's. We phenotyped de TMC's van amandelen met flow cytometrie. Zoals blijkt uit figuur 1,waren alle belangrijke immuunceltypen die in PBMC's in bloed aanwezig waren, in de TMC's van amandelen. In TMC's was de frequentie van alle celtypen, behalve B-cellen, echter lager dan in PBMC's.
Figuur 1: Fenotypering van TMC's in amandelen. TMC's van gezonde donoren werden verkregen na dissectie van menselijk tonsillarweefsel en isolatie van cellen. (A) Cellen werden gekleurd, en gegevens werden verkregen door flow cytometrie. Gegevens vertegenwoordigen een representatief experiment. (B) De tabel geeft een overzicht van het percentage van elk celtype in levende TMC's in amandelen van zes verschillende gezonde donoren en vergelijkt elk met het percentage van elk celtype in PBMC's uit bloed, zoals gedefinieerd in de literatuur18,19. Gegevens worden weergegeven als het percentage levende cellen SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Vervolgens hebben we de immunologische reacties van de TMC's getest. Een manier om de activering van een cel tegen een ziekteverwekker te reproduceren, is door de aangeboren immuunsensoren van de Tol-Like Receptoren (TLRs) familie te stimuleren. TLRs zijn voornamelijk aanwezig in monocyten/macrofagen, alle dendritische cel (DC) subtypes, plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) en ook in B-cellen. In dit voorbeeld bestudeerden we TLR7 en TLR8, omdat ze gespecialiseerd zijn in antivirale reacties en de meeste gevallen van tonsillitis (d.w.z. tonsillinfecties) worden veroorzaakt door een virale infectie. Zo werden TMC's uit amandelen (grafiek in blauw) van zeven gezonde donoren 's nachts gestimuleerd met de TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Net als in PBMCs (grafiek in het groen), activering via TLR7/8 signalering geactiveerd productie van type I interferons (IFN) en pro-inflammatoire cytokinen. In feite was de cytokine die het meest in TMC's wordt geproduceerd bij activering IFNα, een lid van het type I IFN-familie dat voornamelijk betrokken is bij aangeboren immuniteit tegen virale infectie en meestal wordt geproduceerd door de pDC's. Alle geteste cytokinen, met uitzondering van IFN2/3 en IL-8, werden geproduceerd door TMC's, hoewel op lagere niveaus dan in PBMC's. Interessant is dat sommige cytokinen (voornamelijk IL-8, maar ook IL-6, IL-10 en TNFα) in grotere hoeveelheid aanwezig waren op basale niveaus. Verder hebben we vergeleken met de cytokine geproduceerd door geïsoleerde TMC's of door tonsillaire weefselblokken bereid zoals eerder beschreven6. We maten alle soorten IFN geproduceerd in de supernatant van beide celculturen met behulp van de STING-37 cel lijn reporter test zoals eerder beschreven17 en toonde aan dat we alleen ifn niveaus in de geïsoleerde TMC's konden meten.
Figuur 2: TMC's produceerden cytokinen bij stimulatie. AA) Gezuiverde en geïsoleerde TMC's (blauw) en PBMCs (groen) werden 's nachts gestimuleerd met R848 (5 μg/mL). Supernatants werden opgehaald en bevroren tot gebruik. Een op kraal gebaseerde immunoassay werd uitgevoerd om meerdere oplosbare cytokinen gelijktijdig te kwantificeren met behulp van een stroomcytometer. De grafieken vertegenwoordigen de concentratie in picogrammen per milliliter van elke gemeten cytokine. De vouwverhogingen worden geannoteerd in rood op de grafieken. Mann-Whitney U test. (B) Gezuiverde en geïsoleerde TMC's uit amandelen (blauw) en tonsillaire weefselblokken (oranje) werden gedurende 24 uur gestimuleerd met influenza A-virus (IAV). Een STING-37 reporter cel lijn test werd gebruikt om IFN productie te meten in de supernatant. Doos- en snorharenpercelen met mediaan ± tot maximum. Mann-Whitney U test. P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = niet gestimuleerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tot slot hebben we de levensvatbaarheid van de TMC's getest. Er zijn verschillende technieken beschikbaar om de levensvatbaarheid van cellen te meten. Hier gebruikten we een luminescente cel levensvatbaarheid test, een eenvoudige en snelle twee-staps test. Zoals blijkt uit figuur 3,hebben we duidelijk de cytotoxiciteit gedetecteerd die werd veroorzaakt door verbinding 1 in TMC's, die niet giftig was voor PBMCs. Zo toonden TMC's een hogere gevoeligheid voor het geteste medicijn.
Figuur 3: Verbinding 1 was giftig voor TMC's. Gezuiverde en geïsoleerde TMC's en PBMC's werden voorincubeerd met verbinding 1 (C1) bij verschillende concentraties gedurende 1 uur en vervolgens 's nachts gestimuleerd met R848 (5 μg/mL). Supernatants werden opgehaald, 60 μL van cel levensvatbaarheid oplossing werd toegevoegd, en luminescentie werd gemeten. De * vertegenwoordigt de statistische analyse waarin C1 met NS wordt vergeleken. Doos- en snorharenpercelen met mediaan ± tot maximum. Kruskal-Wallis test met Dunn's post hoc correctie. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = niet gestimuleerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menselijke amandelen vertegenwoordigen een integratief en fysiologisch ex vivo-model om aangeboren immuunreacties te bestuderen op de slijmkoselsinterface, omdat ze de rol van een secundair lymfoïde orgaan nabootsen. Interessant is dat de cellulaire samenstelling van de TMC's vergelijkbaar is met de PBMCs en alle grote celpopulaties omvat, hoewel hun percentage kan verschillen van PBMCs van bloed(figuur 1). Extra populaties kunnen ook worden gevonden, omdat alle immuunreacties worden geïnitieerd in weefsels (slijmvlies of secundaire lymfoïde organen) en niet in bloed.
Het gebruik van menselijke weefselexplants evenals het gebruik van celkweek of bloedcellen hebben elk hun voordelen. Echter, voor de studie cytokine afscheiding en cel activering, weefsel explants waren niet het beste model. In feite konden we geen IFN-productie detecteren in de supernatant van weefselexplants(figuur 2B). We speculeren dat het direct wordt geconsumeerd door de omringende cellen. Aan de andere kant kan stimulatie van bloedcellen (PBMC's) de primaire reactie op infectie nabootsen, maar niet nabootsen wat er in de weefsels gebeurt, waar de meeste cytokinen worden geproduceerd en waar virussen zich vermenigvuldigen. Daarom hebben we een protocol opgezet om cellen die ontstaan uit een secundair lymfoïde weefsel, de amandel, te isoleren en te zuiveren. We zuiverden TMC's van gezonde menselijke amandelen, waardoor we immuuncelactivering kunnen onderzoeken bij stimulatie. Een van de beperkingen van dit model is echter dat TMC's niet zoveel pro-inflammatoire cytokinen produceren als PBMCs ex vivo bij TLR7/8-stimulatie, hoewel de niveaus van IFNα, de belangrijkste antivirale cytokine, in beide culturen vergelijkbaar is.
Uit de studie van de toxiciteit op TMC's en PBMCs bleek dat TMC's gevoeliger zijn voor een giftig medicijn (figuur 3). Zo moet de toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen en toekomstige behandelingen worden getest in cellen uit weefsels en niet alleen op cellijnen, PBMC's of weefselexplants. Daarom lijkt het gebruik van TMC's voor het testen van geneesmiddelen een toekomstige toepassing van de beschreven methode.
Amandelen van volwassenen of kinderen kunnen worden verkregen en verwerkt zoals beschreven. We raden echter aan om amandelen van kinderen te verkrijgen om twee belangrijke redenen: 1) De amandelen van kinderen bevatten meer cellen dan devolwassenen ' 20. Inderdaad, tonsillar hypertrofie komt vooral voor bij kinderen, omdat ze vechten meer kindervirussen. Zo kunnen deze grote amandelen obstructieve amandelen worden en moeten ze worden verwijderd door een gedeeltelijke tonsillectomie om complicaties zoals slaapapneu13te voorkomen; 2) Omdat de amandelen van volwassenen meestal worden verwijderd na verschillende episodes van oor-neus-keel (KNO) infecties, deze amandelen zijn minder naïef en bevatten minder cellen.
Het is van cruciaal belang om zo snel mogelijk na de verwijderingsoperatie aan de amandelen te werken, idealiter <3 uur na het ophalen. Inderdaad, direct na verwijdering en tot de dissectie, de amandelen van elke kant worden bij elkaar gehouden in een 50 mL steriele flacon met ongeveer 20 mL PBS, zodat ze volledig worden ondergedompeld.
Interdonor variabiliteit kan een belangrijk probleem voor reproduceerbaarheid vertegenwoordigen. Inderdaad, variabiliteit in cellulaire samenstelling tussen donoren kan aanzienlijk zijn. Ons protocol, met behulp van TMC's en niet weefsel explants, beperkt deze variabiliteit, omdat de cellen uit de hele amandelen worden gemengd voordat ze verguld en geplaatst in de cultuur, terwijl weefsel explants brengen intradonor variabiliteit in cellulaire samenstelling, omdat de stukken afkomstig zijn uit verschillende gebieden binnen hetzelfde monster. Gedeeltelijke tonsillectomie kan alleen worden uitgevoerd op niet-ontstoken amandelen, wat de inflammatoire statusvariabiliteit tussen patiënten beperkt. We raden ook aan om amandelen te verzamelen die op verschillende dagen operatief worden verwijderd. We hebben duidelijk gemerkt dat interchirurg en inter-dag variabilities hoger zijn dan interdonor variabiliteit (gegevens niet getoond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) voor de experimenten en N.B. fellowship (AAP 2017 166). N.S. erkent steun van de ANRS for fellowship (AAP 2016 1), de European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), het startup funding programma "Baustein" van de Medische Faculteit van de Universiteit van de Universiteit van de Universiteit (LSBN.0147) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
