Summary
في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة بسهولة وتربية الخلايا أحادية النوى tonsillaar من البشر الأصحاء التي تخضع لعملية استئصال اللوزتين الجراحية الجزئية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية.
Abstract
دراسة الخلايا المعزولة من الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) يسمح فهم استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية، لأنها يمكن أن نموذج التفاعلات المضيف الممرض في الأنسجة. في حين أن الخلايا المعزولة المستمدة من الأنسجة كانت أول نموذج لثقافة الخلية ، فقد تم إهمال استخدامها لأن الأنسجة قد يكون من الصعب الحصول عليها. في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة وتربية الخلايا أحادية النوى اللوزتين بسهولة (TMCs) من اللوزتين البشرية السليمة لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية. إن عزل اللجان عبر الأراضي المُمَرَكَة من اللوزتين سريع، لأن اللوزتين بالكاد تحتويان على ظهارة وتُسفر عن مليارات من جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية. هذه الطريقة تسمح بالكشف عن إنتاج السيتوكين باستخدام عدة تقنيات، بما في ذلك immunoassays، qPCR، المجهر، تدفق cytometry، الخ. ، على غرار استخدام الخلايا أحادية النوى الطرفية (PBMCs) من الدم. وعلاوة على ذلك، تبدي الشركات عبر الأراضي عبر الوطنية حساسية أكبر لاختبار المخدرات من تلك التي تبديها شركات PBMCs، التي ينبغي النظر فيها من أجل إجراء اختبارات السمية في المستقبل. وهكذا، فإن ثقافات شركات TMCs التي تعمل في الجسم الحي هي نموذج مخاطي سهل وسهل الوصول إليه.
Introduction
وتقتصر الدراسات على الأعضاء البشرية بسبب إمكانية الوصول إلى المعلومات، فضلا عن أسباب أخلاقية واضحة. ومع ذلك ، فهي ضرورية لفهم تعقيد البيولوجيا البشرية بشكل كامل. ثقافات الخلايا المعزولة (الثقافات الأولية أو خطوط الخلايا) هي نظام قياسي في دراسات بيولوجيا الخلايا بسبب توافرها. في حين أن الثقافات الخلية المعزولة سمحت باكتشافات بارزة ، فإن استخدام خطوط الخلايا قد جاء عند التدقيق الدقيق لأنها لا تحاكي تمامًا بيولوجيا الجهاز الحي. ومع ذلك ، فإن ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد أو الأنسجة explants معقدة للغاية4،5،6. في الواقع ، قطعة من الأنسجة أو الجهاز هيطروجينية للغاية لأن تكوينها الخلوي يختلف اعتمادًا على التعريب في الأنسجة. وهكذا، فإن استخدام كتل الأنسجة يتطلب تحليل العديد من النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية، مما يؤدي إلى حاجة عدد كبير من المتبرعين أو المرضى.
الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) مشابهة هيكلياً للغدد الليمفاوية ولكن لها وظائف فريدة من نوعها، لأن دورها الرئيسي هو تنظيم المناعة المخاطية7. على عكس الغدد الليمفاوية، والتي تقع عادة على مسافة ما من الأنسجة، وتقع الشعير عادة مباشرة تحت ظهارة الأنسجة المخاطية. من الناحية النسيجية ، تتكون بشكل رئيسي من تركيزات عالية من الخلايا B و T ، ولكن أيضًا الخلايا التي تقدم المستضد مثل الضامة والخلايا التكجرية. الشعير تشكل حوالي 50٪ من الأنسجة اللمفاوية في جسم الإنسان. وتنقسم الشعير إلى تسع مجموعات اعتمادا على موقعها: غالت (القناة الهضمية- ) ، BALT (bronchus-) ، NALT (الأنف - ) ، CALT (الملتحمة) ، LALT (الحنجرة - ) ، SALT (الجلد - ) ، VALT (vulvo-) ، O -MALT (منظمة) ، ود - مالت (منتشر). و O-MALT يتكون أساسا من اللوزتين من خاتم لوزتيلار والداير وهو الأكثر سهولة MALT8,9. في الواقع، اللوزتين الموجودة في البلعوم تشكل الحاجز الرئيسي لحماية الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي من (المحتملة) الكائنات الحية الدقيقة الغازية10. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية اللوزتين من قبل ظهارة حرشفية غير كيراتينية طبقية ، مدعومة بكبسولة من النسيج الضام تحتوي على الأوعية الدموية والأعصاب واللمفية ، مما يوفر سهولة الوصول إلى الخلايا المناعية11،12. وعلاوة على ذلك، استئصال اللوزتين، وهو الفعل الجراحي لإزالة اللوزتين، هو إجراء شائع يتم إجراؤه على الأطفال الذين يعانون من اضطراب في التنفس، مما يجعل اللوزتين نسيجًا متاحًا بسهولة13 في البيئات الفسيولوجية.
اللوزتين تسمح بدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. في الواقع، في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، لأن اللوزتين تتكون من تركيز عال من الخلايا المناعية، فهي الهدف الرئيسي للتكاثر الفيروسي ولكن أيضا إنتاج كمية كبيرة من السيتوكينات التي لم يتم الكشف عنها في الدورة الدموية14،15. في الولايات ثابتة, نادرة السّكان من فطريّة مثل خلايا حاضرة في مختلفة نسيج مخاطيّ, بما في ذلك اللوزتين, غير أنّ أساسيّا غائبة من دم.
وهكذا، فإن الخلايا أحادية النواة من اللوزتين هي نموذج أكثر أهمية وتعقيداً من الخلايا PBMCs ويمكن أن تجيب على أسئلة أكثر عمقاً. من ناحية أخرى، يمكن استخدام explants الأنسجة تكون معقدة وغير ذات الصلة دائما إلى الدراسات المناعية الفطرية. وهكذا، أنشأنا نموذجا لدراسة تنشيط المناعة المخاطية باستخدام TMCs16. ونصف هنا طريقة لعزل الشركات عبر الأراضي الممَعَرَفَة بشكل فعّال عن اللوزتين البشريتين الطازجتين. هذه الطريقة تسمح باستعادة عدد كبير من الخلايا المناعية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات في الجسم الحي السابق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لا يتم جمع العينات خصيصا لأغراض البحث ولا تعتبر الدراسة الغازية. ومع ذلك، جمع اللوزتين البشرية يتطلب موافقة أخلاقية من قبل السلطات المحلية ذات الصلة. في حالتنا، تمت الموافقة عليها من قبل لجنة حماية الأشخاص (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). وعلاوة على ذلك، يطلب موافقة كل مريض أو ممثل قانوني للحصول على البيانات الشخصية للمانحين (مثل الجنس، والعمر، وتاريخ الإصابة بالحنجرة) التي يمكن أن تساعد في تفسير النتائج التجريبية.
1. التعامل مع الأنسجة لوزتيلار الإنسان
- وضع اللوزتين من كل متبرع في قارورة واحدة معقمة 50 مل تحتوي على 25 مل PBS 1x ونقل في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى المختبر وفقا لتوصيات الهيئة (استخدام ثلاثة مستويات من الحماية: قارورة، صندوق أمان، وكيس).
ملاحظة: وينبغي إجراء العملية بأكملها في مختبر من المستوى البيولوجي للسلامة 2. وينبغي التعامل مع جميع العينات البشرية بعناية لأنها لم تكن مؤهلة من قبل، وقد تحتوي على عوامل معدية. -
تنظيف جميع الأدوات في بين كل استخدام.
- بعد الاستخدام، تفكيك مصفاة الخلية والحفاظ على جميع الأدوات الأخرى (مثل، الحشرات، ملقط) في حمام يحتوي على محلول المنظفات (1/10 حجم المنظفات في H2O) بين عشية وضحاها.
- فرشاة كل أواني لإزالة الأنسجة وغسلها بالماء واضحة.
- جفف جميع الأجزاء بشكل جيد ، ثم أعد مصفاة الخلايا (85 مل ، قطر 37 مم) عن طريق وضع شبكة صلبة 60 شبكة فوق شبكة صلبة 10 شبكة وإغلاق الحلقة بإحكام.
- ضع جميع الأدوات في أكياس معقمة والأوتوكلاف.
2. تشريح الأنسجة اللوزتين البشرية وعزل الخلايا أحادية النوى Tonsillaar (TMCs)
- ضع مصفاة الخلايا على طبق استزراع الخلايا 150 × 25 مم2 (SPL150) وجميع الأدوات في SPL150 أخرى لإبقائها عقيمة.
- نقل اللوزتين من القارورة إلى مصفاة الخلية باستخدام ملقط معقمة. يصب أيضا في كل من برنامج تلفزيوني، الذي يحتوي على بعض الخلايا التي قد الخروج اللوزتين. إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني لتزج الشبكة.
ملاحظة: وينبغي أن تكون مغمورة الأنسجة في جميع الأوقات لتجنب جفاف. - إزالة الكي، والأنسجة الدموية، والليفية باستخدام ملقط ومشرط.
ملاحظة: اللوزتين إزالتها من الأطفال لا تحتاج هذه الخطوة. - قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة من أقل من 0.5 سم في القطر باستخدام مشرط وملاقط المنحنية. قطع جميع الأنسجة بحيث يمكن أن تكون مغمورة قطع صغيرة في جميع الأوقات.
- وضع بضع قطع من الأنسجة في مصفاة الخلية وكشط لهم على الشبكة مع آفة الزجاج حتى طبقة رقيقة حقا فقط من السترما الأبيض يبقى. إزالة والتخلص من stroma لتجنب انسداد الشبكة.
- مرة واحدة وقد تم ضغط جميع الأنسجة من خلال الشبكة، واستخدام ماصة 10 مل لنقل كل تعليق الخلية على الشبكة وكشط مرة أخيرة.
- نقل تعليق الخلية مع ماصة 10 مل في قارورة معقمة. غسل الشبكة ومصفاة الخلية مع برنامج تلفزيوني 1x. دع تعليق الخلية يستريح لمدة 5 دقائق في RT على مقاعد البدلاء. هذه الخطوة تسمح لهطول الأمطار وتكتل من بقايا ستروما، والخلايا الميتة، وأي الدنا صدر، وسوف تسهل الخطوة التالية.
- ضع منخلًا معقمة 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة سعة 50 مل (أزيلي بعناية من المغلف) ونقل تعليق الخلية بلطف عليه مع ماصة 10 مل. لا تخلط التعليق، لأن بيليه موجود في كثير من الأحيان. إذا تم انسداد المنخل، استخدم الجزء الخلفي من طرف ماصة 1 مل عقيمة لخدش الخلايا الحوض الصغير منخل. تغيير منخل كلما لزم الأمر.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- تجاهل افراط و resuspend بيليه عن طريق خلط بلطف القارورة، ثم إعادة تعليق الخلايا في 35 مل من برنامج تلفزيوني.
- في قارورة جديدة، ضع منخلًا جديدًا 70 ميكرومترًا على القمة ونقل تعليق الخلية عليه مع ماصة 10 مل. إذا كان منخل مسدوداً، استخدم التقنية المفصلة في الخطوة 2.7.
3- عزل الشركات عبر الأراضي الممْرَكَة بتدرج كثافة الخلايا
ملاحظة: ويمكن استخدام هذه الشركات بعد الخطوة 2-10. ومع ذلك، للحصول على حل خلية أوضح وإزالة غيرها من حطام الخلية وأي خلايا حمراء، ينصح بإجراء عزل تدرج كثافة الخلية من الخلايا أحادية النوى.
- إضافة 15 مل من متوسط الكثافة التدرج (د = 1.076 ز / مل) في قارورة جديدة 50 مل. صب حل TMCs على أعلى متوسطة التدرج الكثافة، مع الحرص على تقليل خلط التعليق مع متوسط التدرج الكثافة.
- الطرد المركزي الحل في 1000 س ز لمدة 30 دقيقة في RT مع تسارع وانقطع.
- إزالة مع ماصة 10 مل وتجاهل الطبقة العليا (التي تحتوي على معظمها PBS 1x) دون إزعاج الواجهة بين TMCs والكثافة الانحدار المتوسطة.
ملاحظة: تحتوي TMCs على عدد قليل من كريات الدم الحمراء، وبالتالي فإن الحل واضح. وهكذا، يمكن أن يكون من الصعب تصور التفاعل بين حل TMCs في برنامج تلفزيوني ومتوسط تدرج الكثافة. وبناء على ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا في RPMI 1640 تكملها 20 M HEPES (بدون FBS) قبل أن يتم تنفيذ تدرج الكثافة. - إزالة TMCs مع تلميح ماص معقمة 1 مل والميصة مكان في قارورة جديدة 50 مل.
- غسل الخلايا عن طريق إضافة 50 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 2٪ من مصل الأبقار الجنين (FBS) و 2 mM EDTA والطرد المركزي الأنبوب في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الصفائح الدموية المتبقية.
- كرر الخطوة 3.5، ولكن الطرد المركزي الأنبوب في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- إعداد المتوسطة الثقافة (R10) من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10٪ مع تنشيط الحرارة FBS، 2 M L-الجلوتامين، والمحلول المضاد الحيوي (100 U/mL البنسليوم و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
- إعادة تعليق TMCs في 10 مل من R10 وفرز الخلايا. وفي المتوسط، تنتج هذه التقنية 5 × 108-2 × 109 TMCs لكل زوج من اللوزتين. ويمكن الآن استخدام الخلايا لتحقيقات مثل PBMCs من الدم كله (على سبيل المثال، تنقية نوع الخلية المحددة، والخلايا، والخلايا الخلوية، والارتشاء- qPCR، والتجميد، الخ).
-
إذا لزم الأمر، قم بتجميد الخلايا لاستخدامها باستخدام تقنيات قياسية لتجميد الخلايا الأساسية.
- حساب عدد الخلايا.
- الطرد المركزي الخلايا وإزالة المنازع. قم بحل بيليه في ما يكفي من 100٪ FBS لتركيز النهائي من 1 × 108 خلايا / مل، ثم إضافة نفس الحجم من 80٪ FBS + 20٪ DMSO الحل. الخلايا ستكون بعد ذلك في 5 × 107 خلايا / مل. وينبغي أن يتم هذه الخطوة في 4 درجة مئوية و FBS وDDSO الحل ينبغي أن تبقى عند 4 درجة مئوية قبل استخدام.
- توزيع 1 مل من حل الخلية في الأنابيب المبردة ووضعها في وعاء التجميد البطيء الذي كان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسيطرة على معدل تجميد الخلايا. وضعه في -80 درجة مئوية.
- لإذابة الخلايا، ضع cry في حمام دافئ في 37 درجة مئوية لبضع ثوان مع الانفعالات المستمرة. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الذوبان، نقلها إلى 49 مل من R10 والطرد المركزي لإزالة DMSO. عد الخلايا واستخدامها كـ PBMCs.
ملاحظة: وعلى الرغم من أن تجميد وذوبان الجليد في هذه اللجان سيزيلان الأنقاض، فإن ذلك سيلحق الضرر أيضاً ببعض أنواع الخلايا النادرة. إذا كانت الكتل أو الحطام موجود بعد الذوبان ، فمن الأفضل تمرير تعليق الخلية من خلال منخل عقيم 70 ميكرومتر قبل استخدامه.
4- فيينوتيبينغ من TMCs حسب قياس تدفق الدراجات
- استرداد 5 × 106 خلايا من الحل السابق لكل لوحة خليط الأجسام المضادة التي تحتاج إلى اختبار ووضع في أنبوب 5 مل cytometry. استرداد 1 × 106 خلايا لعنصر التحكم غير المُطَرَّد.
- اغسل الخلايا في PBS والطرد المركزي عند 400 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. Resuspend لهم في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (1 × 106 الخلايا / مل) واحتضان مع وصمة عار قابلة للحياة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- إضافة 5 μL الحرارة المعطلة الإنسان AB مصل لكل 100 μL من تعليق الخلية واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- اغسل الخلايا في PBS + 2٪ FBS + 2 mM EDTA (غسيل العازلة) والطرد المركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- إعادة إنشاء TMCs في 500 ميكرولتر من الغسيل العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة على النحو المفصل في الجدول 1. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
- اغسل الخلايا في عازلة الغسل والطرد المركزي عند 400 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إعادة إنشاء TMCs في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5٪ من ما قبل الفورمالدهيد (PFA). تبقى في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى الحصول عن طريق تدفق cytometry.
ملاحظة: PFA خطرة. استخدم حلًا تجاريًا جاهزًا للاستخدام لإعداد حل PFA بنسبة 0.5٪ .
| جسم | استنساخ | فلووتشروم | الشركه |
| يعيش الميت | BV405 | ثيرموستر العلمية | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD فارمجن |
| CD8 | SK1 | أميسان | BD فارمجن |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | ميلتيني بيوتيك |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD فارمجن |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | دينار بحريني |
| CD19 | HD237 | النماء في مرحلة الطفولة المبكرة | بيكمان كولتر |
| CD20 | 2H7 | أليكسا فلور 700 | BD فارمجن |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD فارمجن |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD فارمجن |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD فارمجن |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD فارمجن |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD فارمجن |
| BDCA-1 | L161 | أزرق المحيط الهادئ | BD فارمجن |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | FITC | ميلتيني بيوتيك |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | ميلتيني بيوتيك |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD فارمجن |
| CD11c | 3.9 | أليكسا فلور 700 | العلوم الحيوية |
الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة لتوصيف الخلية حسب قياس التدفق الخلوي.
5- مثال على تفعيل الشركات عبر الإقليمية وقياس إنتاج السيتوكين
- تخفيف TMCs في R10 المتوسطة للحصول على تركيز 2 × 106 خلايا / مل.
- توزيع 400,000 TMCs في 200 ميكرولتر من R10 في 96 بئر أسفل لوحة مستديرة.
- لتنشيط الخلايا، إضافة 5 ميكروغرام / مل من TLR7/8 ناهض resiquimod (R848) بين عشية وضحاها.
- أجهزة الطرد المركزي لوحات واسترداد الشركات عبر الفلورية 'سوبرفنت وتجميده لمزيد من التحليل. وسيتم تقييم إنتاج السيتوكين باستخدام مناعة قائمة على الخرز لتحديد عدد السيتوكينات القابلة للذوبان في وقت واحد باستخدام مقياس تدفق cytometer بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
- تقييم جدوى الخلايا باستخدام قياس الخلية مضيئة البقاء بعد بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، إضافة 60 ميكرولتر من حل صلاحية الخلية إلى الآبار وقياس الإنارة في غضون 10 دقيقة (اقتناء لمدة 1 s/well).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن أولاً وصفنا الملامح المناعية للخلايا الموجودة في الثقافة و حللنا كمية TMCs. نحن فينوتاد TMCs من اللوزتين مع عملية استئصال cytometry التدفق. كما هو مبين في الشكل 1، كانت تمثل جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في PBMCs من الدم في TMCs من اللوزتين. بيد أن تواتر جميع أنواع الخلايا في البلدان عبر المدى، باستثناء الخلايا باء، كان أقل منه في مراكز عمل الشركات.
الشكل 1: فينبتيب من الشركات عبر الوطنية في اللوزتين. وتم الحصول على اللجان عبر الوطنية من متبرعين أصحاء بعد تشريح أنسجة اللوزتين البشرية وعزل الخلايا. (أ)كانت الخلايا ملطخة، وتم الحصول على البيانات عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة. تمثل البيانات تجربة تمثيلية. (ب) يلخص الجدول النسبة المئوية لكل نوع خلية في مراكز الـ TMCs الحية في اللوزتين من ستة متبرعين أصحاء مختلفين ويقارن كل منها بنسبة كل نوع خلية في PBMCs من الدم، كما هو محدد في الأدبيات18،19. يتم عرض البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الحية SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ثم اختبرنا الاستجابات المناعية للبلدان عبر الميكون. إحدى الطرق لإعادة إنتاج تنشيط الخلية ضد مسببات الأمراض هي تحفيز أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية من عائلة The Toll-Like Receptors (TLRs). TLRs موجودة أساسا في monocytes / الضامة، وجميع الخلايا التشعبية (DC) الأنواع الفرعية، البلازما الخلايا التشعبية (pDCs)، وأيضا في الخلايا B. في هذا المثال، درسنا TLR7 و TLR8، لأنها متخصصة في الاستجابات المضادة للفيروسات ومعظم حالات التهاب اللوزتين (أي التهابات اللوزتين) سببها عدوى فيروسية. وهكذا، تم تحفيز مراكز الـ TMCs من اللوزتين (الرسم البياني باللون الأزرق) من سبعة متبرعين أصحاء بين عشية وضحاها مع إعادة الـ TLR7/8 ligand (R848). كما هو الحال في PBMCs (الرسم البياني باللون الأخضر) ، أدى التنشيط من خلال إشارات TLR7/8 إلى إنتاج نوع I interferons (IFN) والسيتوكينات الموالية للالتهابات. في الواقع، كان السيتوكين الأكثر إنتاجا في TMCs عند تفعيل IFNα، وهو عضو في الأسرة I IFN نوع التي تشارك أساسا في المناعة الفطرية ضد العدوى الفيروسية ويتم إنتاج معظمها من قبل pDCs. وقد تم إنتاج جميع السيتوكينات التي تم اختبارها، باستثناء IFN2/3 و IL-8، من قبل شركات TMCs، وإن كان ذلك في مستويات أقل من المستويات في PBMCs. ومن المثير للاهتمام أن بعض السيتوكينات (أساسا IL-8، ولكن أيضا IL-6، IL-10، و TNFα) كانت موجودة بكميات أكبر عند المستويات القاعدية. وعلاوة على ذلك، قارنا السيتوكين التي تنتجها مراكز الـ TMCs المعزولة أو كتل الأنسجة اللوزتينية التي أعدت كما سبق وصفه6. قمنا بقياس جميع أنواع IFN المنتجة في الثقافات الضخمة لكلا الخلية باستخدام مقايسة مراسل خط الخلية STING-37 كما هو موضح سابقًا17 وأظهرنا أنه لا يمكننا قياس مستويات IFN إلا في مراكز إدارة الانبعاثات عبر الوطنية المعزولة.
الشكل 2: أنتجت مراكز الـ TMCs السيتوكينات عند التحفيز. (أ)تم تحفيز TMCs المنقية والمعزولة (الزرقاء) و PBMCs (الأخضر) بين عشية وضحاها مع R848 (5 ميكروغرام / مل). تم استرداد ونباتات اُكتُمّم وجمّدت حتى الاستخدام. تم إجراء مناعة قائمة على الخرزة لتحديد عدد السيتوكينات القابلة للذوبان في وقت واحد باستخدام مقياس تدفق. تمثل الرسوم البيانية التركيز في بيكوجرام لكل ملليلتر لكل سيتوكين مقاس. يتم تعليق الزيادات أضعاف باللون الأحمر على الرسوم البيانية. اختبار مان ويتني يو. (ب) تم تحفيز TMCs المنقية والمعزولة من اللوزتين (الأزرق) وكتل الأنسجة اللوزتين (البرتقالي) لمدة 24 ساعة مع فيروس الأنفلونزا A (IAV). تم استخدام وحدة قياس خط خلية مراسل STING-37 لقياس إنتاج IFN في الماكر. مربع وخفقات المؤامرات مع متوسط ± الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. اختبار مان ويتني يو. P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = غير محفزة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وأخيراً، اختبرنا جدوى عمل اللجان عبر الوطنية. هناك عدة تقنيات متاحة لقياس قابلية الخلية للاستمرار. هنا، استخدمنا مقايسة خلية مضيئة، مقايسة سهلة وسريعة من خطوتين. وكما هو مبين في الشكل 3،فقد اكتشفنا بوضوح السمية الخلوية الناجمة عن المركب 1 في المركبات عبر الانبعاثات، التي لم تكن سامة للبلدان المقسمة في الانبعاثات. وهكذا، أظهرت الشركات عبر الأراضي الممَرَبة حساسية أعلى للمخدرات التي تم اختبارها.
الشكل 3: المركب 1 سام للبلدان عبر الوطنية. تم احضام مركبات TMCs و PBMCs المنقية والمعزولة مسبقًا بالمركب 1 (C1) بتركيزات مختلفة لمدة ساعة واحدة ثم تم تحفيزها بين عشية وضحاها باستخدام R848 (5 ميكروغرام/مل). تم استرداد االنباتات، 60 ميكرولتر من محلول قابلية الخلية للتطبيق، وتم قياس الإنارة. وتمثل * التحليل الإحصائي الذي يقارن C1 بـ NS. مربع وخفقات المؤامرات مع متوسط ± الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. اختبار كروسكال واليس مع تصحيح دن بعد مخصص. P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = غير محفزة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اللوزتين البشرية تمثل نموذج فيزيولوجي السابقين فيزيولوجية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية في واجهة المخاطية، لأنها تحاكي دور الجهاز اللمفاوي الثانوي. ومن المثير للاهتمام أن التركيب الخلوي للبلدان عبر التخصصات الإقليمية يشبه مراكز PBMCs ويشمل جميع مجموعات الخلايا الرئيسية، على الرغم من أن نسبتها المئوية يمكن أن تكون مختلفة عن PBMCs من الدم(الشكل 1). ويمكن أيضاً العثور على مجموعات سكانية إضافية، حيث أن جميع الاستجابات المناعية تبدأ في الأنسجة (الغشاء المخاطي أو الأعضاء اللمفاوية الثانوية) وليس في الدم.
استخدام explants الأنسجة البشرية وكذلك استخدام ثقافة الخلية أو خلايا الدم كل مزاياها. ومع ذلك، بالنسبة لإفراز السيتوكين الدراسة وتنشيط الخلية، لم تكن explants الأنسجة النموذج الأفضل. في الواقع، لم نتمكن من الكشف عن أي إنتاج IFN في افرط من الأنسجة explants (الشكل 2B). نحن نتكهن بأنه يتم استهلاكه مباشرة من قبل الخلايا المحيطة. من ناحية أخرى، يمكن أن يحاكي تحفيز خلايا الدم (PBMCs) الاستجابة الأولية للعدوى ولكن لا تحاكي ما يحدث في الأنسجة، حيث يتم إنتاج معظم السيتوكينات وحيث تتكاثر الفيروسات. لذلك، وضعنا بروتوكول لعزل وتنقية الخلايا الناشئة عن الأنسجة اللمفاوية الثانوية، اللوزتين. نحن تنقية TMCs من اللوزتين البشرية صحية، والذي يسمح لنا للتحقيق في تنشيط الخلايا المناعية عند التحفيز. ومع ذلك، فإن أحد القيود على هذا النموذج هو أن TMCs لا تنتج العديد من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل PBMCs السابق vivo عند TLR7/8 التحفيز، على الرغم من أن مستويات IFNα، السيتوكين المضادة للفيروسات الرئيسية، مماثلة في كلتا الثقافتين.
وكشفت دراسة السمية المركبة على اللجان عبر الإقليمية مقابل الـ PBMCs أن هذه المركبات أكثر حساسية لدواء سام(الشكل 3). وهكذا، ينبغي اختبار سمية الأدوية الجديدة والعلاجات المستقبلية في الخلايا من الأنسجة وليس فقط على خطوط الخلية، PBMCs، أو explants الأنسجة. ولذلك يبدو أن استخدام اللجان عبر الوطنية لاختبار المخدرات هو تطبيق للأسلوب الموصوف في المستقبل.
اللوزتين من البالغين أو الأطفال يمكن الحصول عليها ومعالجتها على النحو المبين. ومع ذلك، نوصي بالحصول على اللوزتين من الأطفال لسببين رئيسيين: 1) اللوزتين للأطفال تحتوي على خلايا أكثر من البالغين20. في الواقع ، تضخم اللوزتين هو شائع بشكل خاص في الأطفال ، لأنهم يحاربون المزيد من فيروسات الطفولة. وهكذا, هذه اللوزتين كبيرة يمكن أن تصبح اللوزتين الانسدادي وتحتاج إلى إزالة بواسطة استئصال اللوزتين الجزئية لتجنب مضاعفات مثل توقف التنفس أثناء النوم13; 2) لأن اللوزتين الكبار عادة ما تتم إزالة بعد عدة نوبات من الأذن الأنف الحلق (ENT) العدوى، وهذه اللوزتين هي أقل ساذجة وتحتوي على عدد أقل من الخلايا.
من المهم للغاية العمل على اللوزتين في أقرب وقت ممكن بعد جراحة الإزالة ، من الناحية المثالية < 3 ساعة بعد جمعها. في الواقع، الحق بعد الإزالة وحتى تشريح، يتم الاحتفاظ اللوزتين من كل جانب معا في قارورة معقم 50 مل تحتوي على حوالي 20 مل من برنامج تلفزيوني، بحيث يتم غمرها تماما.
يمكن أن يمثل التباين بين الدونورين قضية رئيسية لقابلية التكاثر. والواقع أن التباين في التركيب الخلوي بين المانحين يمكن أن يكون كبيراً. بروتوكولنا، باستخدام TMCs وليس explants الأنسجة، يحد من هذا التباين لأن الخلايا من اللوزتين كلها مختلطة قبل أن يتم مطلية ووضعها في الثقافة، في حين explants الأنسجة جلب تقلب داخلاً في التركيب الخلوي لأن القطع تأتي من مناطق مختلفة داخل نفس العينة. لا يمكن إجراء استئصال اللوزتين الجزئي إلا على اللوزتين غير المفلورتين ، مما يحد من تقلب الحالة الالتهابية بين المرضى. نوصي أيضا بجمع اللوزتين جراحيا إزالة في أيام مختلفة. لقد لاحظنا بوضوح أن المتغيرات بين الجراحين وبين الأيام هي أعلى من تباين بين الدونورين (البيانات غير مبينة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل الوكالة الوطنية لمراقبة التنمية في منطقة سيدا وهرهبات ANRS (J-P. ح) للتجارب وN.B. زمالة (AAP 2017 166). تعترف N.S. بالدعم المقدم من ANRS للحصول على الزمالة (AAP 2016 1)، والمنظمة الأوروبية لبيولوجيا الجزيئية EMBO للزمالة (LT 834 2017)، وبرنامج تمويل الشركات الناشئة "باوشتاين" من كلية الطب في جامعة أولم (LSBN.0147) وDFG دويتشه Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
