Summary
I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler fra raske mennesker, der gennemgår delvis kirurgisk tonsillektomi for at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv.
Abstract
Undersøgelse af isolerede celler fra slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) giver mulighed for forståelse af immunceller respons i patologier involverer slimhinde immunitet, fordi de kan modellere vært-patogen interaktioner i vævet. Mens isolerede celler stammer fra væv var den første cellekultur model, deres anvendelse er blevet forsømt, fordi væv kan være svært at opnå. I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler (TPC' er) fra sunde menneskelige mandler til at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv. Isolering af TPC'ere fra mandlerne er hurtig, fordi mandlerne knap nok har nogen epitel og udbytte op til milliarder af alle større immuncelletyper. Denne metode gør det muligt at påvise cytokinproduktion ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR, mikroskopi, flowcytometri osv., svarende til brugen af perifere mononukleare celler (PBMCs) fra blod. Desuden, TPC'ere viser en højere følsomhed over for test af lægemidler end PBMCs, som skal overvejes for fremtidige toksicitet assays. Således ex vivo TMCs kulturer er en nem og tilgængelig slimhindemodel.
Introduction
Undersøgelser af menneskelige organer er begrænset på grund af tilgængelighed samt indlysende etiske årsager. Men de er afgørende for fuldt ud at forstå kompleksiteten af den menneskelige biologi. Kulturer af isolerede celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologiundersøgelser på grund af deres tilgængelighed. Mens isolerede cellekulturer har tilladt fremragende opdagelser, er brugen af cellelinjer kommet nærmere undersøgt, fordi de ikke fuldt ud efterligner in vivo orgelbiologi. Men kulturen i tre-dimensionelle celler eller væv explants er meget kompleks4,5,6. Faktisk er et stykke væv eller organ meget heterogent, fordi dets cellesammensætning varierer afhængigt af lokaliseringen i vævet. Således, ved hjælp af væv blokke kræver analyse af mange tekniske og biologiske replikater, hvilket fører til behovet for et stort antal donorer eller patienter.
Den slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) er strukturelt ligner lymfeknuder, men har unikke funktioner, fordi deres vigtigste rolle er at regulere slimhinde immunitet7. I modsætning til lymfeknuderne, som normalt er placeret i en vis afstand fra vævene, er MALT generelt placeret umiddelbart under slimhindevævets epitel. Histologisk består de hovedsageligt af høje koncentrationer af B- og T-celler, men også antigenoppræsendende celler som makrofager og dendritiske celler. MALT udgør omkring 50% af lymfoide væv i den menneskelige krop. MALT er opdelt i ni grupper afhængigt af deres placering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strubehoved-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiseret) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsagelig af mandlerne fra Waldeyers tonsillarrring og er den mest tilgængelige MALT8,9. Tonsiller i oropharynx udgør den største barriere, der beskytter fordøjelsessystemet og luftvejene mod (potentielle) invasive mikroorganismer10. Desuden er mandlerne dækket af en fin stratificeret planocelløs ikke-keratinizing epitel, understøttet af en kapsel bindevæv, der indeholder blodkar, nerver og lymfeknuder, giver nem adgang til immuncellerne11,12. Endvidere, tonsillektomi, den kirurgiske handling at fjerne mandler, er en fælles procedure, der udføres på børn, der har søvn-uorden vejrtrækning, hvilket gør mandler en let tilgængelig væv13 i fysiologiske indstillinger.
Mandler tillader undersøgelse af immuncellerespons i patologier, der involverer slimhindeimmunitet. Faktisk, i hiv-infektion, fordi mandler er sammensat af en høj koncentration af immunceller, de er det vigtigste mål for viral replikation, men også producere en stor mængde cytokiner, der ikke er påvist icirkulationen 14,15. På steady stater, sjældne populationer af medfødte-lignende celler er til stede i forskellige slimhindevæv, herunder mandler, men er hovedsagelig fraværende fra blod.
Således mononukleare celler fra mandler (TMCs) er en mere relevant og kompleks model end PBMCs og kan besvare mere dybtgående spørgsmål. På den anden side kan brugen af vævs explants være kompleks og ikke altid relevant for medfødte immunundersøgelser. Således har vi etableret en model til at studere slimhinde immun aktivering ved hjælp af TMCs16. Her beskriver vi en metode til effektiv isolering af TPC'er fra friske menneskelige mandler. Denne metode gør det muligt at inddrive et stort antal immunceller og samtidig bevare deres integritet for ex vivo undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøverne indsamles ikke specifikt til forskningsformål, og undersøgelsen betragtes ikke som invasiv. Men indsamling af mandler til mennesker kræver etisk godkendelse fra de lokale relevante myndigheder. I vores tilfælde blev det godkendt af Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Desuden anmodes der om samtykke fra hver patient eller juridisk repræsentant til at indhente donorernes personoplysninger (f.eks. køn, alder, historie af ENT-infektioner), som kan hjælpe med at fortolke eksperimentelle resultater.
1. Håndtering af humant tonsillarvæv
- Læg mandler fra hver donor i et sterilt 50 ml hætteglas indeholdende 25 ml PBS 1x og transport ved stuetemperatur (RT) til laboratoriet i henhold til myndighedens anbefalinger (brug tre beskyttelsesniveauer: hætteglas, en sikkerhedsboks og en pose).
BEMÆRK: Hele proceduren bør udføres på et biologisk sikkerhedsniveau 2 laboratorium. Alle humane prøver skal håndteres med forsigtighed, da de ikke tidligere har været kvalificerede og kan indeholde infektiøse agenser. -
Rengør alle værktøjer i mellem hver brug.
- Efter brug adskilles cellesien med alle de andre instrumenter (f.eks. støder, pincet) i et bad, der indeholder en vaskemiddelopløsning (1/10 volumenvaskemiddel i H2O) natten over.
- Børst hvert redskab for at fjerne vævet og vask med rent vand.
- Tør alle dele godt, derefter forberede celle si (85 ml, 37 mm diameter) ved at placere en 60 mesh stål gitter på toppen af en 10 mesh stål gitter og tæt lukke ringen.
- Anbring alt værktøjet i sterile poser og autoklave.
2. Dissektion af humant tonsillarvæv og isolering af tonsillarmononukleare celler (TPC'er)
- Placer cellesien på en 150 x 25 mm2 (SPL150) cellekulturskål og alle instrumenterne i en anden SPL150 for at holde dem sterile.
- Overfør mandlerne fra hætteglasset ind i cellesien ved hjælp af sterile pincet. Hæld også i alle PBS, som indeholder nogle celler, der har udrangeret mandlerne. Hvis det er nødvendigt, tilføje mere PBS at fordybe nettet.
BEMÆRK: Vævet skal altid nedsænkes for at undgå udtørring. - Fjern ætset, blodigt og fibroidt væv ved hjælp af pincet og en skalpel.
BEMÆRK: Mandler fjernet fra børn behøver ikke dette trin. - Skær vævet i små stykker på mindre end 0,5 cm i diameter ved hjælp af skalpel og den buede pincet. Skær alt vævet, så de små stykker kan nedsænkes på alle tidspunkter.
- Placer et par stykker af væv i cellen si og skrabe dem på nettet med et glas støder indtil kun et virkelig tyndt lag af hvid stroma tilbage. Fjern og kassér stroma for at undgå tilstopning af nettet.
- Når alle væv er blevet presset gennem nettet, skal du bruge en 10 ml pipette til at overføre alle cellesuspensionen til gitteret og skrabe det en sidste gang.
- Celleophænget overføres med en 10 ml pipette til et sterilt hætteglas. Gitteret og cellesien med PBS 1x. Lad celleaffjedringen hvile i 5 minutter ved RT på bænken. Dette trin tillader udfældning og agglomeration af sidesten stroma, døde celler, og eventuelle frigivet DNA, og vil lette det næste skridt.
- Anbring en steril 70 μm sigte oven på et nyt 50 ml hætteglas (fjern forsigtigt fra konvolutten), og overfør forsigtigt cellesuspensionen til det med en 10 ml pipette. Bland ikke suspensionen, da der ofte er en pellet til stede. Hvis sien er tilstoppet, skal du bruge bagsiden af en steril 1 ml pipettespids til at ridse cellerne gennem sien. Skift sien så ofte som nødvendigt.
- Cellerne centrifugeres ved 250 x g i 10 min. ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pelleten opses igen ved forsigtigt at blande hætteglasset, hvorefter cellerne opslæmmes med 35 ml PBS.
- I et nyt hætteglas anbringes en ny 70 μm sigte ovenpå og celleophænget overføres til det med en 10 ml pipette. Hvis sien er tilstoppet, anvendes den teknik, der er beskrevet i trin 2.7.
3. Isolering af TMC'erne efter celletæthedsgradient
BEMÆRK: TPC'erne kan bruges efter trin 2.10. Men for at opnå en klarere celleopløsning og for at fjerne andre cellerester og eventuelle røde blodlegemer tilrådes det at udføre en celletæthedsgradientisolation af de mononukleare celler.
- Der tilsættes 15 ml af tæthedsgradientmediet (d = 1,076 g/ml) i et nyt 50 ml hætteglas. Hæld TPC-løsningen oven på tæthedsgradientmediet, og vær omhyggelig med at minimere blanding af affjedringen med tæthedsgradientmediet.
- Opløsningen centrifugeres ved 1.000 x g i 30 min ved RT med acceleration og afbryd.
- Fjern med en 10 ml pipette og kassér det øverste lag (der hovedsagelig indeholder PBS 1x) uden at forstyrre grænsefladen mellem TMCs og tæthed gradient medium.
BEMÆRK: TPC'erne indeholder et lavt antal erythrocytter, derfor er løsningen klar. Således kan grænsefladen mellem løsningen af TPC'er i PBS og tæthed gradient medium være svært at visualisere. Celler kan derfor opslæmmes i RPMI 1640 suppleret med 20 mM HEPES (uden FBS), før tæthedsgradienten udføres. - Fjern TPC'erne med en steril 1 ml pipettespids, og placer den i et nyt 50 ml hætteglas.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 50 ml PBS indeholdende 2 % af føtalt kvægserum (FBS) og 2 mM EDTA, og røret centrifugeres ved 250 g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne de resterende blodplader.
- Trin 3.5 gentages, men røret centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved 4 °C.
- Forbered kulturmedium (R10) ved at supplere RPMI 1640 med 10% varmeinaktiveret FBS, 2 mM L-glutamin og antibiotisk opløsning (100 U/mL penicillium og 100 μg/ml streptomycin).
- Opslæmm tW'erne i 10 ml R10, og cellerne tælles med. I gennemsnit giver denne teknik 5 x 108-2 x 109 TPC'er pr. par mandler. Cellerne kan nu bruges til undersøgelser som PBMCs fra fuldblod (f.eks. rensning af specifik celletype, cellekultur, flowcytometri, RT-qPCR, frysning osv.).
-
Hvis det er nødvendigt, fryse cellerne til yderligere brug ved hjælp af standard teknikker til primær celle frysning.
- Tæl antallet af celler.
- Centrifuge cellerne og fjern supernatanten. Pellet opløses i nok 100% FBS til en endelig koncentration på 1 x10 8 celler/ml, og tilsæt derefter det samme volumen af en 80% FBS + 20% DMSO opløsning. Cellerne vil derefter være på 5 x 107 celler / ml. Dette trin bør udføres ved 4 °C, og FBS- og DMSO-opløsningen skal opbevares ved 4 °C, før den tages i brug.
- Celleopløsningens 1 ml fordeles i kryorør, og de anbringes i en langsomt frysebeholder, der har været ved 4 °C natten over for at kontrollere hastigheden af cellefrysning. Den anbringes ved -80 °C.
- For at tø cellerne op anbringes kryrovilerne i et varmt bad ved 37 °C i nogle få sekunder med konstant omrøring. Så snart cellerne begynder at tø op, overføres de til 49 ml R10 og centrifuges for at fjerne DMSO'en. Tæl cellerne og brug dem som PC'er.
BEMÆRK: Selv om frysning og optøning af TPC'er vil fjerne snavs, vil det også skade nogle sjældne celletyper. Hvis der er klumper eller snavs til stede efter optøning, er det bedst at passere cellesuspensionen gennem en steril 70 μm sigte, før den blev brugt.
4. Phenotyping af TPC'er af Flow Cytomery
- Hent 5 x 106 celler fra den tidligere opløsning for hvert antistofblandingspanel, der skal testes og placeres i et 5 ml cytometriør. Hent 1 x 106 celler til den ikke-inddånede kontrol.
- Cellerne i PBS vaskes i PBS og centrifugeres ved 400 x g i 5 min. ved 4 °C. Opslæmm dem i 500 μL PBS (1 x 106 celler/ml) og inkuberes med en levedygtighedsplet i 30 min ved 4 °C i mørke.
- Der tilsættes 5 μL inaktiveret humant AB serum pr. 100 μL cellesuspension og inkuberes i 15 min ved 4 °C i mørke.
- Cellerne i PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) vaskes ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
- Opslæmme TPC'erne i 500 μL vaskebuffer, der indeholder antistofferne som beskrevet i tabel 1. Cellerne inkuberes i 30 min ved 4 °C i mørke.
- Cellerne vaskes i vaskebuffer og centrifugeres ved 400 x g i 5 min. ved 4 °C. Opslæmme TPC'erne i 500 μL PBS indeholdende 0,5 % af paraformaldehyd (PFA). Opbevares i mørke ved 4 °C, indtil erhvervelse ved flow cytometri.
BEMÆRK: PFA er farligt. Brug en kommerciel brugsklar løsning til at forberede PFA-løsningen på 0,5 %.
| Antistof | Klon | Fluorokrom | Virksomhed |
| Live-Dead delte et halvt år ud | BV405 | ThermoFisher Videnskabelig | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 (CD8) | KR1 | Amcyan (Amcyan) | BD Pharmingen |
| CD8 (CD8) | BW135/80 | VioBlue delte et 2018. | Miltenyi Biotec |
| CD4 (CD4) | RPA-T4 delte et 2018. | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 (CD45) | KR. | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 (CD19) | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 (CD20) | kr. | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 (CD14) | M5E2 (M5E2) | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 (CD14) | M5E2 (M5E2) | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 (CD16) | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 (CD56) | 188 kr. | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Stillehavsblå | BD Pharmingen |
| BDCA-3 delte et år. | AD5-14H12 | FITC (FITC) | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c (CD11c) | 3.9 | Alexa Fluor 700 | dagens e-række |
Tabel 1: Liste over antistoffer til cellekarakterisering efter flowcytometri.
5. Eksempel på aktivering af TPC'er og måling af cytokinproduktion
- TIC'erne fortyndes i R10-mediet for at få en koncentration på 2 x10 6 celler/ml.
- Fordel 400.000 TPC'er i 200 μL R10 i en 96 godt rund bundplade.
- For at aktivere cellerne tilsættes 5 μg/ml af TLR7/8 agonist resiquimod (R848) natten over.
- Centrifuge pladerne og hente TMCs 'supernatant og fryse det til yderligere analyse. Cytokinproduktionen vil blive vurderet ved hjælp af perlebaserede immunoassays til at kvantificere flere opløselige cytokiner samtidigt ved hjælp af et flowcytometer efter fabrikantens protokol.
- Vurdere cellernes levedygtighed ved hjælp af en selvlysende celleoverkommelighedsanalyse efter fabrikantens protokol. Tilsæt kort tilsættes 60 μL celleoverkommelighedsopløsning til brøndene og måle luminescens inden for 10 min (erhvervelse for 1 s/ well).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først karakteriseret immunprofilen af celler til stede i kulturen og analyseret mængden af TPC'er. Vi fænotypede TPC'erne fra mandler med flowcytometri. Som vist i figur 1var alle større immuncelletyper, der foregav i PBMCs fra blod, repræsenteret i TPC'erne fra mandler. I TPC'er var hyppigheden af alle celletyper, undtagen B-celler, dog lavere end i PC'er.
Figur 1: Phenotyping af TPC'er i mandler. TMO'er fra raske donorer blev opnået efter dissektion af humant tonsillarvæv og isolering af celler. (A) Celler blev plettet, og data blev erhvervet ved flow cytometri. Data repræsenterer et repræsentativt eksperiment. ( B) Tabellen opsummerer procentdelen af hver celletype i levende TMC'er i mandler fra seks forskellige raske donorer og sammenligner hver til procentdelen af hver celletype i PBMCs fra blod, som defineret i litteraturen18,19. Data vises som procentdelen af levende celler SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi testede derefter tmcs immunologiske reaktioner. En måde at reproducere en celles aktivering mod et patogen er at stimulere de medfødte immunsensorer fra Toll-Like Receptors (TLRs) familien. TLR'er er hovedsageligt til stede i monocytter/makrofager, alle dendritiske celleundertyper (DC), plasmacytoid dendritiske celler (pDC'er) og også i B-celler. I dette eksempel studerede vi TLR7 og TLR8, fordi de specialiserer sig i antivirale reaktioner, og de fleste tilfælde af tonsillitis (dvs. tonsil infektioner) er forårsaget af en virusinfektion. Således TPC'er fra mandler (graf i blå) fra syv raske donorer blev stimuleret natten over med TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Som i PBMCs (graf i grøn), aktivering gennem TLR7/8 signalering udløste produktion af type I interferoner (IFN) og pro-inflammatoriske cytokiner. Faktisk var den cytokin, der var mest produceret i TPC'er ved aktivering, IFNα, et medlem af den type I IFN-familie, der hovedsageligt er involveret i medfødt immunitet mod virusinfektion og for det meste produceres af pc'erne. Alle cytokiner testet, undtagen IFN2/3 og IL-8, blev produceret af TMCs, men på lavere niveauer end i PBMCs. Interessant, nogle cytokiner (hovedsagelig IL-8, men også IL-6, IL-10, og TNFα) var til stede i større mængder på basale niveauer. Desuden sammenlignede vi cytokin produceret af isolerede TPC'er eller tonsillar væv blokke fremstillet som beskrevet tidligere6. Vi målte alle typer IFN produceret i supernatanten af begge cellekulturer ved hjælp af STING-37 cellelinje reporter assay som beskrevet tidligere17 og viste, at vi kun kunne måle IFN niveauer i de isolerede TPC'er.
Figur 2: TPC'er producerede cytokiner ved stimulering. (A) Rensede og isolerede TW'er (blå) og PBMCs (grøn) blev stimuleret natten over med R848 (5 μg/ml). Supernatants blev hentet og frosset indtil brug. En perle-baseret immunoassay blev udført for at kvantificere flere opløselige cytokiner samtidigt ved hjælp af et flow cytometer. Graferne repræsenterer koncentrationen i picogram pr. milliliter af hver målt cytokin. Folden stiger er kommenteret med rødt på graferne. Mann-Whitney U test. (B) Rensede og isolerede TPC'er fra mandler (blå) og tonsillar væv blokke (orange) blev stimuleret i 24 timer med Influenza A-virus (IAV). En STING-37 reporter cellelinje analyse blev brugt til at måle IFN produktion i supernatant. Kasse- og piskerisparceller med median ± minimum til maksimum. Mann-Whitney U test. P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = ikke-stimuleret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Endelig testede vi tpc'ernes levedygtighed. Der findes flere teknikker til måling af cellernes levedygtighed. Her brugte vi en selvlysende celle levedygtighed assay, en nem og hurtig to-trins analyse. Som vist i figur 3, vi klart opdaget cytotoksicitet induceret af sammensatte 1 i TMCs, som ikke var giftigt for PBMCs. Således, TPC'er viste en højere følsomhed over for det testede stof.
Figur 3: Sammensatte 1 var giftig for TPC'er. Rensede og isolerede TMO'er og PBMCs blev præinkuberet med sammensatte 1 (C1) ved forskellige koncentrationer i 1 time og derefter stimuleret natten over med R848 (5 μg/ml). Der blev hentet supernatanter, 60 μL celleoverkommelighedsopløsning blev tilføjet, og luminescens blev målt. * repræsenterer den statistiske analyse, der sammenligner C1 med NS. Kasse- og piskerisparceller med median ± minimum til maksimum. Kruskal-Wallis tester med Dunns post hoc korrektion. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = ikke-stimuleret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menneskelige mandler repræsenterer en integrativ og fysiologisk ex vivo model til at studere medfødte immunrespons på slimhinden interface, fordi de efterligner den rolle, som en sekundær lymfoide organ. Det er interessant, den cellulære sammensætning af TPC'er svarer til PBMCs og omfatter alle de store cellepopulationer, selv om deres procentdel kan være forskellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Yderligere populationer kan også findes, da alle immunresponser påbegyndes i væv (slimhinde eller sekundære lymfoide organer) og ikke i blodet.
Brugen af humane væv explants samt brugen af cellekultur eller blodlegemer hver har deres fordele. Men for undersøgelsen cytokin sekretion og celleaktivering, væv explants var ikke den bedste model. Faktisk kunne vi ikke opdage nogen IFN produktion i supernatant af væv explants (Figur 2B). Vi spekulerer på, at det er direkte forbruges af de omkringliggende celler. På den anden side kan stimulering af blodlegemer (PBMCs) efterligne den primære reaktion på infektion, men ikke efterligne, hvad der sker i vævene, hvor de fleste af cytokinerne produceres, og hvor virus replikerer. Derfor har vi oprettet en protokol til at isolere og rense celler, der udspringer af et sekundært lymfoide væv, tonsil. Vi rensede TPC'er fra sunde menneskelige mandler, som giver os mulighed for at undersøge immuncelleaktivering ved stimulering. Men en af begrænsningerne ved denne model er, at TPC'er ikke producerer så mange pro-inflammatoriske cytokiner som PBMCs ex vivo på TLR7/8 stimulation, selv om niveauet af IFNα, de store antivirale cytokiner, er ens i begge kulturer.
Undersøgelsen af sammensatte toksicitet på TPC'er versus PBMCs viste, at TPC'er er mere følsomme over for et giftigt stof (Figur 3). Således bør toksiciteten af nye lægemidler og fremtidige behandlinger testes i celler fra væv og ikke kun på cellelinjer, PBMCs eller vævs explants. Derfor synes brugen af TPC'er til test af lægemidler at være en fremtidig anvendelse af den beskrevne metode.
Mandler fra voksne eller børn kan fås og behandles som beskrevet. Vi anbefaler dog, at man henter mandler fra børn af to hovedårsager: 1) Børnetengle indeholder flere celler end de voksnes20. Faktisk, tonsillar hypertrofi er særlig udbredt hos børn, fordi de kæmper mere barndom virus. Således kan disse store mandler blive obstruktiv mandler og skal fjernes ved en delvis tonsillektomi for at undgå komplikationer som søvnapnø13; 2) Fordi voksnes mandler normalt fjernes efter flere episoder af øre-næse-hals (ENT) infektioner, disse mandler er mindre naive og indeholder færre celler.
Det er afgørende at arbejde på mandlerne så hurtigt som muligt efter fjernelse kirurgi, ideelt <3 h efter indsamling. Lige efter fjernelse og indtil dissektion holdes mandlerne fra hver side sammen i et 50 ml sterilt hætteglas indeholdende ca. 20 ml PBS, så de er helt nedsænket.
Interdonorvariabilitet kan udgøre et stort problem for reproducerbarhed. Faktisk kan variabilitet i cellulære sammensætning mellem donorer være betydelig. Vores protokol, ved hjælp af TPC'er og ikke vævudplants, begrænser denne variabilitet, fordi cellerne fra hele mandlerne blandes, før de er belagt og placeret i kultur, mens vævudplanter bringer intradonorvariabilitet i cellulær sammensætning, fordi stykkerne kommer fra forskellige områder inden for samme prøve. Delvis tonsillektomi kan kun udføres på ikke-inflade mandler, hvilket begrænser den inflammatoriske statusvariation mellem patienter. Vi anbefaler også at indsamle mandler kirurgisk fjernet på forskellige dage. Vi har tydeligt bemærket, at inter-kirurg og inter-dag variabilitet er højere end interdonor variabilitet (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenterne og N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. anerkender støtte fra ANRS for Fellowship (AAP 2016 1), Den Europæiske Molekylærbiologi Organisation EMBO for Fellowship (LT 834 2017), opstart finansieringsprogrammet "Baustein" af det medicinske fakultet ulm Universitet (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
