Summary
Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.
Abstract
Die Untersuchung isolierter Zellen aus Mukosa-assoziierten Lymphgeweben (MALT) ermöglicht das Verständnis der Reaktion von Immunzellen in Pathologien mit Schleimhautimmunität, da sie Wirtspathogen-Wechselwirkungen im Gewebe modellieren können. Während isolierte Zellen aus Geweben das erste Zellkulturmodell waren, wurde ihre Verwendung vernachlässigt, da Gewebe schwer zu erhalten sein kann. Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Mandelzellen (TMCs) von gesunden menschlichen Mandeln leicht verarbeiten und kulturieren kann, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen. Die Isolierung von TMCs von den Mandeln ist schnell, da die Mandeln kaum Epithel haben und bis zu Milliarden aller großen Immunzelltypen erwirtschaften. Diese Methode ermöglicht den Nachweis der Zytokinproduktion mit verschiedenen Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw., ähnlich wie bei der Verwendung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Blut. Darüber hinaus weisen TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteltests auf als PBMCs, die bei zukünftigen Toxizitätstests berücksichtigt werden müssen. Daher sind ex vivo TMCs Kulturen ein einfaches und zugängliches Schleimhautmodell.
Introduction
Studien an menschlichen Organen sind aufgrund der Zugänglichkeit sowie offensichtlicher ethischer Gründe eingeschränkt. Sie sind jedoch unerlässlich, um die Komplexität der menschlichen Biologie vollständig zu verstehen. Kulturen isolierter Zellen (Primärkulturen oder Zelllinien) sind aufgrund ihrer Verfügbarkeit ein Standardsystem in zellbiologischen Studien. Während isolierte Zellkulturen hervorragende Entdeckungen ermöglicht haben, ist die Verwendung von Zelllinien genauer unter die Lupe genommen worden, weil sie die in vivo Organbiologie nicht vollständig imitieren. Die Kultur der dreidimensionalen Zellen oder Gewebeexplanten ist jedoch hochkomplex4,5,6. Tatsächlich ist ein Stück Gewebe oder Organ sehr heterogen, da seine Zellzusammensetzung je nach Lokalisierung im Gewebe unterschiedlich ist. Daher erfordert die Verwendung von Gewebeblöcken die Analyse vieler technischer und biologischer Repliken, was zu einer großen Anzahl von Spendern oder Patienten führt.
Die Schleimhaut-assoziierten Lymphgewebe (MALT) sind strukturell den Lymphknoten ähnlich, haben aber einzigartige Funktionen, da ihre Hauptaufgabe darin besteht, die Schleimhautimmunität zu regulieren7. Im Gegensatz zu den Lymphknoten, die sich in der Regel in einiger Entfernung vom Gewebe befinden, befindet sich MALT in der Regel direkt unter dem Epithel des Schleimhautgewebes. Histologisch bestehen sie hauptsächlich aus hohen Konzentrationen von B- und T-Zellen, aber auch aus Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen. MALT machen etwa 50% des Lymphgewebes im menschlichen Körper aus. MALT sind je nach Standort in neun Gruppen unterteilt: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktiv), LALT (Larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisiert) und D-MALT (diffus). Der O-MALT besteht hauptsächlich aus den Mandeln des Waldeyer Tonsillar-Rings und ist der zugänglichste MALT8,9. Tatsächlich stellen Mandeln im Oropharynx die Hauptbarriere zum Schutz der Verdauungs- und Atemwege vor (potenziellen) invasiven Mikroorganismen10dar. Darüber hinaus werden die Mandeln von einem fein geschichteten Plattenepithel ohne Keratinisieren bedeckt, das von einer Kapsel aus Bindegewebe unterstützt wird, die Blutgefäße, Nerven und Lymphatik enthält und einen einfachen Zugang zu den Immunzellen11,12ermöglicht. Darüber hinaus ist die Tonsillektomie, der chirurgische Akt der Entfernung von Mandeln, ein häufiges Verfahren, das bei Kindern mit schlafgestörter Atmung durchgeführt wird, wodurch Mandelnin physiologischen Umgebungen leicht zugänglich sind.
Tonsillen ermöglichen die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. In der Tat, bei HIV-Infektion, weil Mandeln aus einer hohen Konzentration von Immunzellen bestehen, sind sie das Hauptziel der Virusreplikation, sondern produzieren auch eine große Menge an Zytokinen, die nicht im Kreislauf14,15nachgewiesen werden. In stabilen Zuständen sind seltene Populationen von angeborenen Zellen in verschiedenen Schleimhautgeweben vorhanden, einschließlich der Mandeln, aber im Wesentlichen fehlen im Blut.
Daher sind mononukleäre Zellen aus Mandeln (TMCs) ein relevanteres und komplexeres Modell als PBMCs und können tiefergehende Fragen beantworten. Andererseits kann die Verwendung von Gewebeexplantationen komplex und nicht immer relevant für angeborene Immunstudien sein. So haben wir ein Modell zur Untersuchung der Mukosal-Immunaktivierung mit TMCs16erstellt. Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Isolierung von TMCs von frischen menschlichen Mandeln. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Immunzellen unter Beibehaltung ihrer Integrität für Ex-vivo-Studien.
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Protocol
Die Proben werden nicht speziell für Forschungszwecke gesammelt und die Studie gilt nicht als invasiv. Die Sammlung menschlicher Mandeln bedarf jedoch der ethischen Zustimmung der zuständigen Behörden vor Ort. In unserem Fall wurde es vom Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) genehmigt. Darüber hinaus wird die Zustimmung jedes Patienten oder gesetzlichen Vertreters einzuholen, um die personenbezogenen Daten der Spender (z. B. Geschlecht, Alter, Geschichte von HNO-Infektionen) zu erhalten, die bei der Interpretation experimenteller Ergebnisse helfen können.
1. Umgang mit dem menschlichen Tonsillargewebe
- Legen Sie Mandeln von jedem Spender in eine sterile 50 ml Durchstechflasche mit 25 ml PBS 1x und transportieren Sie sie bei Raumtemperatur (RT) gemäß den Empfehlungen der Behörde ins Labor (verwenden Sie drei Schutzstufen: Fläschchen, einen Safe und einen Beutel).
HINWEIS: Das gesamte Verfahren sollte in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Alle menschlichen Exemplare sollten mit Vorsicht behandelt werden, da sie bisher nicht qualifiziert waren und Infektionserreger enthalten können. -
Reinigen Sie alle Werkzeuge zwischen den einzelnen Verwendungen.
- Nach Gebrauch das Zellsieb zerlegen und mit allen anderen Instrumenten (z.B. Stößel, Zange) in einem Bad mit einer Waschmittellösung (1/10 Volumenwaschmittel in H2O) über Nacht aufbewahren.
- Bürsten Sie jedes Utensil, um das Gewebe zu entfernen und mit klarem Wasser zu waschen.
- Trocknen Sie alle Teile gut, bereiten Sie dann das Zellsieb (85 ml, 37 mm Durchmesser) vor, indem Sie ein 60-Mesh-Stahlgitter auf ein 10-Mesh-Stahlgitter legen und den Ring fest schließen.
- Legen Sie alle Werkzeuge in sterile Taschen und Autoklaven.
2. Zerlegung des menschlichen Tonsillargewebes und Isolierung der Tonsillar Mononuklezellen (TMCs)
- Legen Sie das Zellsieb auf eine 150 x 25 mm2 (SPL150) Zellkulturschale und alle Instrumente in einem anderen SPL150, um sie steril zu halten.
- Übertragen Sie die Mandeln von der Durchstechflasche mit steriler Zange in das Zellsieb. Gießen Sie auch in alle PBS, die einige Zellen enthält, die die Mandeln ausgetreten sind. Fügen Sie ggf. weitere PBS hinzu, um das Raster einzutauchen.
HINWEIS: Das Gewebe sollte jederzeit eingetaucht werden, um eine Austrocknung zu vermeiden. - Entfernen Sie kauterisiertes, blutiges und fibroides Gewebe mit Zangen und einem Skalpell.
HINWEIS: Tonsillen, die von Kindern entfernt wurden, brauchen diesen Schritt nicht. - Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell und der gekrümmten Pinzette in kleine Stücke mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 cm. Schneiden Sie das gesamte Gewebe, so dass die kleinen Stücke jederzeit eingetaucht werden können.
- Legen Sie ein paar Gewebestücke in das Zellsieb und kratzen Sie sie mit einem Glasschädling auf das Gitter, bis nur noch eine wirklich dünne Schicht weißer Stroma übrig bleibt. Entfernen und verwerfen Sie die Stroma, um eine Verstopfung des Rasters zu vermeiden.
- Sobald alle Gewebe durch das Gitter gequetscht wurden, verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die gesamte Zellsuspension auf das Gitter zu übertragen und ein letztes Mal zu kratzen.
- Die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette in eine sterile Durchstechflasche übertragen. Waschen Sie das Gitter und das Zellsieb mit PBS 1x. Lassen Sie die Zellaufhängung für 5 min bei RT auf der Bank ruhen. Dieser Schritt ermöglicht die Ausfällung und Agglomeration der übrig gebliebenen Stroma, abgestorbener Zellen und jeder freigesetzten DNA und erleichtert den nächsten Schritt.
- Legen Sie ein steriles 70-m-Sieb auf eine neue 50 ml-Durchstechflasche (vorsichtig aus der Hülle entfernen) und übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 10 ml Pipette darauf. Mischen Sie die Suspension nicht, da häufig ein Pellet vorhanden ist. Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die Rückseite einer sterilen 1 ml Pipettenspitze, um die Zellen durch das Sieb zu kratzen. Ändern Sie das Sieb so oft wie nötig.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 x g für 10 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet durch sanftes Mischen der Durchstechflasche wieder auf, und suspendieren Sie die Zellen dann in 35 ml PBS.
- In einer neuen Durchstechflasche ein neues 70-m-Sieb drauflegen und die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette darauf übertragen. Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die in Schritt 2.7 beschriebene Technik.
3. Isolierung der TMCs durch Zelldichtegradient
HINWEIS: Die TMCs können nach Schritt 2.10 verwendet werden. Um jedoch eine klarere Zelllösung zu erhalten und andere Zellablagerungen und alle roten Zellen zu entfernen, wird empfohlen, eine Zelldichtegradientenisolation der mononukleären Zellen durchzuführen.
- Fügen Sie 15 ml des Dichtegradientenmediums (d = 1.076 g/ml) in eine neue 50 ml Durchstechflasche ein. Gießen Sie die TMCs-Lösung auf das Dichtegradientenmedium, wobei Sie darauf achten, das Mischen der Suspension mit dem Dichtegradientenmedium zu minimieren.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.000 x g für 30 min bei RT mit Beschleunigung und Abbruch.
- Mit einer 10 ml Pipette entfernen und die obere Schicht (die meist PBS 1x enthält) verwerfen, ohne die Schnittstelle zwischen den TMCs und dem Dichtegradientenmedium zu stören.
HINWEIS: Die TMCs enthalten eine geringe Anzahl von Erythrozyten, daher ist die Lösung klar. Somit kann die Schnittstelle zwischen der Lösung von TMCs in PBS und dem Dichtegradientenmedium schwer zu visualisieren sein. Dementsprechend können Zellen in RPMI 1640 resuspendiert werden, ergänzt mit 20 mM HEPES (ohne FBS), bevor der Dichtegradient durchgeführt wird. - Entfernen Sie die TMCs mit einer sterilen 1 ml Pipettenspitze und legen Sie sie in eine neue 50 ml Durchstechflasche.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 ml PBS hinzufügen, die 2 % fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM EDTA enthalten, und zentrifugieren Sie das Rohr bei 250 x g für 10 min bei 4 °C, um die verbleibenden Blutplättchen zu entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.5, zentrieren Sie aber das Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.
- Bereiten Sie Kulturmedium (R10) durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% Hitze inaktiviert FBS, 2 mM L-Glutamin, und die Antibiotikum-Lösung (100 U/ml Penicillium und 100 g/ml Streptomycin).
- Setzen Sie die TMCs in 10 ml R10 wieder aus und zählen Sie die Zellen. Im Durchschnitt ergibt diese Technik 5 x 108-2 x 109 TMCs pro Paar Mandeln. Die Zellen können nun für Untersuchungen wie PBMCs aus Vollblut (z.B. Reinigung bestimmter Zelltypen, Zellkultur, Durchflusszytometrie, RT-qPCR, Gefrieren usw.) verwendet werden.
-
Einfrieren Sie die Zellen bei Bedarf für die weitere Verwendung mit Standardtechniken für das Einfrieren von Primärzellen.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen Sie den Überstand. Lösen Sie das Pellet in ausreichend 100% FBS für eine Endkonzentration von 1 x 108 Zellen/ml auf, und fügen Sie dann das gleiche Volumen einer 80% FBS + 20% DMSO-Lösung hinzu. Die Zellen werden dann bei 5 x 107 Zellen/ml sein. Dieser Schritt sollte bei 4 °C durchgeführt werden und die FBS- und DMSO-Lösung sollte vor der Verwendung bei 4 °C gehalten werden.
- 1 ml der Zelllösung in Kryoröhren verteilen und in einen langsamen Gefrierbehälter geben, der über Nacht bei 4 °C lag, um die Rate des Einfrierens von Zellen zu kontrollieren. Legen Sie es bei -80 °C.
- Um die Zellen aufzutauen, legen Sie die Kryovials in ein warmes Bad bei 37 °C für ein paar Sekunden mit ständiger Erregung. Sobald die Zellen zu tauen beginnen, übertragen Sie sie auf 49 ml R10 und Zentrifuge, um die DMSO zu entfernen. Zählen Sie die Zellen und verwenden Sie sie als PBMCs.
HINWEIS: Obwohl das Einfrieren und Auftauen der TMCs Schmutz entfernen wird, werden auch einige seltene Zelltypen beschädigt. Wenn nach dem Auftauen Klumpen oder Ablagerungen vorhanden sind, ist es am besten, die Zellsuspension durch ein steriles 70-m-Sieb zu passieren, bevor Sie es verwenden.
4. Phenotypisierung von TMCs durch Durchflusszytometrie
- Rufen Sie 5 x 106 Zellen aus der vorherigen Lösung für jedes Antikörper-Gemisch-Panel ab, das getestet werden muss, und legen Sie es in ein 5 ml Zytometrierohr. Rufen Sie 1 x 106 Zellen für die unbefleckte Steuerung ab.
- Waschen Sie die Zellen in PBS und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie sie in 500 l PBS (1 x 106 Zellen/ml) wieder auf und inkubieren Sie sie mit einem Lebensfähigkeitsfleck für 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Fügen Sie 5 l inaktiviertes menschliches AB-Serum pro 100 l Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie 15 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen in PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Waschpuffer) und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Setzen Sie die TMCs in 500 l Waschpuffer mit den Antikörpern gemäß Tabelle 1wieder aus. Inkubieren Sie die Zellen 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
- Waschen Sie die Zellen in Waschpuffer und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie die TMCs in 500 l PBS mit 0,5 % Paraformaldehyd (PFA) aus. Bei 4 °C bei 4 °C bis zur Erfassung durch Durchflusszytometrie im Dunkeln halten.
HINWEIS: PFA ist gefährlich. Verwenden Sie eine kommerzielle Gebrauchslösung, um die 0,5% PFA-Lösung vorzubereiten.
| Antikörper | Klon | Fluorochrom | Unternehmen |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Scientific | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Pacific Blue | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiowissenschaften |
Tabelle 1: Liste der Antikörper für die Zellcharakterisierung durch Durchflusszytometrie.
5. Beispiel für die Aktivierung von TMCs und Messung der Zytokinproduktion
- Verdünnen Sie die TMCs in R10 medium, um eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
- Verteilen Sie 400.000 TMCs in 200 l R10 in einer 96 gut runden Bodenplatte.
- Um die Zellen zu aktivieren, fügen Sie über Nacht 5 g/ml des TLR7/8-Agonisten-Resiquimods (R848) hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Platten und holen Sie den Überstand der TMCs ab und frieren Sie sie für weitere Analysen ein. Die Cytokinproduktion wird mit Perlen-basierten Immunoassays bewertet, um mehrere lösliche Zytokine gleichzeitig mit einem Durchflusszytometer nach dem Herstellerprotokoll zu quantifizieren.
- Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen anhand eines lumineszierenden Zelllebensfähigkeits-Assays nach dem Herstellerprotokoll. Fügen Sie kurz 60 l Zelllebensfähigkeitslösung in die Brunnen ein und messen Sie die Lumineszenz innerhalb von 10 min (Erfassung für 1 s/well).
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Representative Results
Wir charakterisierten zunächst das Immunprofil der in der Kultur vorhandenen Zellen und analysierten die Menge der TMCs. Wir phäphierten die TMCs aus Mandeln mit Durchflusszytometrie. Wie in Abbildung 1dargestellt, waren alle wichtigen Immunzelltypen, die in PBMCs aus Blut vorkommen, in den TMCs aus Mandeln dargestellt. Bei TMCs war die Häufigkeit aller Zelltypen mit Ausnahme von B-Zellen jedoch niedriger als bei PBMCs.
Abbildung 1: Phenotypisierung von TMCs in Mandeln. TMCs von gesunden Spendern wurden nach der Zerlegung des menschlichen Tonsillargewebes und der Isolierung von Zellen erhalten. (A) Zellen wurden befleckt, und Daten wurden durch Durchflusszytometrie erfasst. Daten stellen ein repräsentatives Experiment dar. (B) Die Tabelle fasst den prozentualen Anteil jedes Zelltyps in lebenden TMCs in Mandeln von sechs verschiedenen gesunden Spendern zusammen und vergleicht jeden Prozentsatz jedes Zelltyps in PBMCs aus Blut, wie in der Literatur18,19definiert. Die Daten werden als Prozentsatz der Live-Zellen SD angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Anschließend testeten wir die immunologischen Reaktionen der TMCs. Eine Möglichkeit, die Aktivierung einer Zelle gegen einen Erreger zu reproduzieren, besteht darin, die angeborenen Immunsensoren aus der Toll-Like Receptors (TLRs)-Familie zu stimulieren. TLRs sind hauptsächlich in Monozyten/Makrophagen, allen dendritischen Zellsubtypen (DC), Plasmazytoiden-dendritischen Zellen (pDCs) und auch in B-Zellen vorhanden. In diesem Beispiel haben wir TLR7 und TLR8 untersucht, weil sie sich auf antivirale Reaktionen spezialisieren und die meisten Fälle von Tonsillitis (d. h. Mandelinfektionen) durch eine Virusinfektion verursacht werden. So wurden TMCs aus Mandeln (Blaugraph) von sieben gesunden Spendern über Nacht mit dem TLR7/8 Ligand Resiquimod (R848) stimuliert. Wie bei PBMCs (Gründiagramm) löste die Aktivierung durch TLR7/8-Signalisierung die Produktion von Typ-I-Interferonen (IFN) und pro-inflammatorischen Zytokinen aus. Tatsächlich war das Zytokin, das bei der Aktivierung am höchsten in TMCs produziert wurde, IFN, ein Mitglied der Typ-I-IFN-Familie, das hauptsächlich an angeborener Immunität gegen Virusinfektionen beteiligt ist und hauptsächlich von den pDCs produziert wird. Alle getesteten Zytokine, mit Ausnahme von IFN2/3 und IL-8, wurden von TMCs hergestellt, wenn auch auf niedrigeren Niveaus als in PBMCs. Interessanterweise waren einige Zytokine (hauptsächlich IL-8, aber auch IL-6, IL-10 und TNF) in größerer Menge auf Basalniveau vorhanden. Darüber hinaus verglichen wir das Zytokin, das durch isolierte TMCs oder von Tonsillengewebeblöcken hergestellt wurde, wie zuvor beschrieben6. Wir haben alle IFN-Typen, die im Überstand beider Zellkulturen produziert wurden, mit dem STING-37-Zelllinienreporter-Assay wie zuvorbeschrieben 17 gemessen und gezeigt, dass wir den IFN-Spiegel nur in den isolierten TMCs messen konnten.
Abbildung 2: TMCs produzierten Zytokine bei Stimulation. (A) Gereinigte und isolierte MCS (blau) und PBMCs (grün) wurden über Nacht mit R848 (5 g/ml) stimuliert. Überstand wurde bis zum Gebrauch geborgen und eingefroren. Ein auf Perlen basierender Immunoassay wurde durchgeführt, um mehrere lösliche Zytokine gleichzeitig mit einem Durchflusszytometer zu quantifizieren. Die Graphen stellen die Konzentration in Piktogrammen pro Milliliter jedes gemessenen Zytokins dar. Die Faltenerhöhungen sind auf den Graphen rot kommentiert. Mann-Whitney U-Test. (B) Gereinigte und isolierte TMCs aus Mandeln (blau) und Tonsillengewebeblöcken (orange) wurden für 24 h mit dem Influenza-A-Virus (IAV) stimuliert. Ein STING-37 Reporter-Zelllinientest wurde verwendet, um die IFN-Produktion im Überstand zu messen. Box- und Schnurrhaare mit einem Mittleren bis zum Maximum. Mann-Whitney U-Test. P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = nicht stimuliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Schließlich haben wir die Lebensfähigkeit der TMCs getestet. Es stehen verschiedene Techniken zur Verfügung, um die Zelllebensfähigkeit zu messen. Hier haben wir einen lumineszierenden Zelllebensfähigkeitstest verwendet, einen einfachen und schnellen zweistufigen Assay. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben wir die zytotoxizität, die durch Verbindung 1 in TMCs induziert wurde, eindeutig festgestellt, die für PBMCs nicht toxisch war. So zeigten TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem getesteten Medikament.
Abbildung 3: Verbindung 1 war toxisch für TMCs. Gereinigte und isolierte MCS und PBMCs wurden mit Verbindung 1 (C1) in verschiedenen Konzentrationen für 1 h vorinkubiert und dann über Nacht mit R848 (5 g/ml) stimuliert. Supernativa wurden entnommen, 60 L Zelllebensfähigkeitslösung hinzugefügt und Lumineszenz gemessen. Das * stellt die statistische Analyse dar, die C1 mit NS vergleicht. Box- und Schnurrhaare mit einem Mittleren bis zum Maximum. Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Post-hoc-Korrektur. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = nicht stimuliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Menschliche Mandeln stellen ein integratives und physiologisches Ex-vivo-Modell dar, um angeborene Immunantworten an der Schleimhautschnittstelle zu untersuchen, da sie die Rolle eines sekundären Lymphorgans imitieren. Interessanterweise ist die zelluläre Zusammensetzung der TMCs den PBMCs ähnlich und umfasst alle wichtigen Zellpopulationen, obwohl ihr Prozentsatz von PBMCs aus Blut abweichen kann (Abbildung 1). Zusätzliche Populationen können auch gefunden werden, da alle Immunantworten in Geweben (Mukosa oder sekundäre lymphaide Organe) und nicht im Blut initiiert werden.
Die Verwendung von menschlichen Gewebeexplantationen sowie die Verwendung von Zellkultur oder Blutzellen haben jeweils ihre Vorteile. Für die Zytokinsekretion und Zellaktivierung waren Gewebeexplanten jedoch nicht das beste Modell. Tatsächlich konnten wir keine IFN-Produktion im Überstand von Gewebeexplanten feststellen (Abbildung 2B). Wir spekulieren, dass es direkt von den umgebenden Zellen verbraucht wird. Auf der anderen Seite kann die Stimulation von Blutzellen (PBMCs) die primäre Reaktion auf eine Infektion imitieren, aber nicht imitieren, was in den Geweben passiert, wo die meisten Zytokine produziert werden und wo sich Viren vermehren. Daher haben wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Zellen eingerichtet, die aus einem sekundären Lymphgewebe, der Mandel, entstehen. Wir reinigten TMCs aus gesunden menschlichen Mandeln, was es uns ermöglicht, die Immunzellaktivierung bei Stimulation zu untersuchen. Eine der Einschränkungen dieses Modells ist jedoch, dass TMCs nicht so viele pro-inflammatorische Zytokine produzieren wie PBMCs ex vivo bei TLR7/8 Stimulation, obwohl die Konzentrationen von IFN, dem hauptgradig antiviralen Zytokin, in beiden Kulturen ähnlich sind.
Die Untersuchung der zusammengesetzten Toxizität an TMCs im Vergleich zu PBMCs ergab, dass TMCs empfindlicher auf ein toxisches Medikament reagieren (Abbildung 3). Daher sollte die Toxizität neuer Medikamente und zukünftiger Behandlungen in Zellen aus Geweben getestet werden und nicht nur an Zelllinien, PBMCs oder Gewebeexplantationen. Daher scheint die Verwendung von TMCs für Arzneimitteltests eine zukünftige Anwendung der beschriebenen Methode zu sein.
Tonsillen von Erwachsenen oder Kindern können wie beschrieben erhalten und verarbeitet werden. Wir empfehlen jedoch, Mandeln von Kindern aus zwei Hauptgründen zu erhalten: 1) Kindertonstonieenthält enthalten mehr Zellen als die20von Erwachsenen. Tatsächlich ist die Mandelhypertrophie besonders häufig bei Kindern, weil sie mehr Kinderviren bekämpfen. So können diese großen Mandeln zu obstruktiven Mandeln werden und müssen durch eine partielle Tonsillektomie entfernt werden, um Komplikationen wie Schlafapnoe13zu vermeiden; 2) Da die Mandeln von Erwachsenen in der Regel nach mehreren Episoden von Ohr-Nasen-Hals-Infektionen (ENT) entfernt werden, sind diese Mandeln weniger naiv und enthalten weniger Zellen.
Es ist wichtig, so schnell wie möglich nach der Entfernungsoperation an den Mandeln zu arbeiten, idealerweise <3 h nach der Entnahme. Tatsächlich werden die Mandeln von beiden Seiten direkt nach dem Entfernen und bis zur Zerlegung in einer 50 ml sterilen Durchstechflasche mit etwa 20 ml PBS zusammengehalten, so dass sie vollständig unter Wasser stehen.
Interdonor Variabilität kann ein wichtiges Problem für die Reproduzierbarkeit darstellen. Tatsächlich kann die Variabilität der zellulären Zusammensetzung zwischen den Spendern signifikant sein. Unser Protokoll, das TMCs und nicht Gewebeexplante verwendet, begrenzt diese Variabilität, da die Zellen aus den ganzen Mandeln gemischt werden, bevor sie plattiert und in Kultur gesetzt werden, während Gewebeexplante intradonor Variabilität in der zellulären Zusammensetzung bringen, weil die Stücke aus verschiedenen Bereichen innerhalb derselben Probe stammen. Eine partielle Tonsillektomie kann nur an nicht entzündeten Mandeln durchgeführt werden, was die Entzündungsstatusvariabilität zwischen den Patienten begrenzt. Wir empfehlen auch das Sammeln von Mandeln, die an verschiedenen Tagen operativ entfernt werden. Wir haben deutlich festgestellt, dass interchirurgische und interday Variabilitäten höher sind als Interdonor Variabilität (Daten nicht gezeigt).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) für die Experimente und Das N.B.-Stipendium (AAP 2017 166). N.S. unterstützt das ANRS für Stipendien (AAP 2016 1), die European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), das Startup-Förderprogramm "Baustein" der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm (LSBN.0147) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
