Summary
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים באופן ברור מבני אדם בריאים שעברו ניתוח שקדים ניתוחים חלקיים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית.
Abstract
לימוד תאים בודדים מרקמות הלימפה הקשורות רירית (מאלט) מאפשר הבנה של תגובת תאים חיסוניים בפתווגיות מעורבים חסינות רירית, כי הם יכולים לדגמן אינטראקציות מארח הפתוגן ברקמה. בעוד תאים מבודדים נגזר מרקמות היו המודל הראשון של תרבות התא, השימוש שלהם הוזנח כי רקמות יכול להיות קשה להשיג. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מסבירים כיצד בקלות לעבד ולהתרבות התאים המוננוציליים של האדם (tmcs) מפני השקדים האנושיים בריאים כדי לחקור את התגובות החיסונית מולדים על ההפעלה, מחקה זיהום נגיפי ברקמות רירית. בידוד של TMCs מן השקדים הוא מהיר, כי השקדים בקושי יש אפיתל כל התשואה עד מיליארדי כל סוגי התא החיסונית העיקריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי של הייצור cy, באמצעות מספר טכניקות, כולל חיסוני, qPCR, מיקרוסקופ, זרימה cy, ועוד., בדומה לשימוש בתאים היקפיים ברורים (PBMCs) מהדם. יתרה מזאת, TMCs מראים רגישות גבוהה יותר לבדיקות סמים מאשר PBMCs, אשר צריך להיחשב עבור רעילות בעתיד. כך, התרבויות vivo tmcs לשעבר הם מודל רירית קלה ונגישה.
Introduction
מחקרים על איברי האנוש מוגבלים בשל נגישות, כמו גם סיבות אתיות ברורות. עם זאת, הם חיוניים כדי להבין באופן מלא את המורכבות של הביולוגיה האנושית. תרבויות של תאים מבודדים (התרבויות הראשיות או קווי התא) הם מערכת סטנדרטית בלימודי התא בביולוגיה בשל זמינותם. בעוד תרביות תאים מבודדים אפשרו תגליות מצטיינים, השימוש קווי התא הגיע על בדיקה מקרוב יותר כי הם לא לחקות באופן מלא vivo ביולוגיה איברים. עם זאת, התרבות של תאים תלת מימדיים או explants רקמות הוא מורכב מאוד4,5,6. אכן, פיסת רקמה או איבר הוא הטרודוגני מאוד כי הרכב התא שלה שונה בהתאם לוקליזציה ברקמה. לפיכך, שימוש בקוביות רקמה דורש ניתוח של משכפל טכני וביולוגי רבים, המוביל לצורך של מספר רב של תורמים או חולים.
רירית הקשורים רקמות הלימפה (מאלט) דומים מבחינה מבנית לבלוטות הלימפה אבל יש פונקציות ייחודיות, כי התפקיד העיקרי שלהם היא להסדיר חסינות רירית7. בניגוד לבלוטות הלימפה, אשר ממוקמות בדרך כלל במרחק מסוים מן הרקמות, מאלט ממוקמים בדרך כלל מיד מתחת האפיתל של רקמת רירית. באופן היסטולוגית, הם מורכבים בעיקר של ריכוזים גבוהים של B ו-T תאים, אבל גם אנטיגן הצגת תאים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטים. מאלט מהווה כ 50% של רקמת הלימפה בגוף האדם. מאלט מחולקת לתשע קבוצות בהתאם למיקומם: גולט (בטן-), BALT (ברונזה-), NALT (אפי), CALT (לחפון), LALT (גרון), מלח (עור-), VALT (vulvo-), O-בירה (מאורגן), ו D-בירה (מתפזרת) O-מאלט מורכב בעיקר של השקדים של הטבעת הטונשית של וואלדאייר והוא מאלט הנגיש ביותר8,9. אכן, השקדים הממוקמים בoropharynx מהווים את המכשול העיקרי המגן על העיכול והדרכי הנשימה (פוטנציאל) פולשנית מיקרואורגניזמים10. בנוסף, השקדים מכוסים על ידי קשקש משובח שאינו keratinizing אפיתל, נתמך על ידי כמוסה של רקמת חיבור המכיל כלי דם, עצבים, ו lymphatics, מתן גישה קלה לתאים החיסוניים11,12. יתר על כן, ניתוח שקדים, הפעולה הכירורגית של הסרת השקדים, הוא הליך נפוץ ביצוע על ילדים לאחר נשימה שינה מחוסר סדר, הפיכת שקדים רקמות זמין בקלות13 בהגדרות פיסיולוגיים.
שקדים לאפשר את המחקר של תגובת התא החיסונית בפתווגיות מעורבים חסינות רירית. אכן, ב-hiv זיהום, כי השקדים מורכבים ריכוז גבוה של תאים חיסוניים, הם היעד העיקרי של שכפול נגיפי, אך גם לייצר כמות גדולה של ציטוקינים שאינם מזוהים במחזור14,15. במדינות קבועות, אוכלוסיות נדירות של תאים מולדים כמו נמצאים ברקמות רירית שונים, כולל השקדים, אבל הם למעשה נעדרים מדם.
לפיכך, תאים מונוליטיים משקדים (TMCs) הם מודל רלוונטי ומורכב יותר מאשר PBMCs והוא יכול לענות על שאלות עמוקות יותר. מצד שני, השימוש הרחבות רקמות יכול להיות מורכב ולא תמיד רלוונטי למחקרים חיסוניים מולדים. כך, הקמנו מודל לחקור הפעלה חיסונית רירית באמצעות tmcs16. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד יעיל של TMCs מן השקדים האנושיים הטריים. שיטה זו מאפשרת התאוששות של מספר רב של תאים חיסוניים תוך שמירה על היושרה שלהם למחקרים vivo ex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הדגימות לא נאספו במיוחד למטרות מחקר והמחקר אינו נחשב פולשני. עם זאת, איסוף השקדים האנושיים דורש אישור מוסרי של הרשויות הרלוונטיות המקומיות. במקרה שלנו, היא אושרה על ידי הגנת האגודה דה אישית (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). יתרה מזאת, הסכמה של כל מטופל או נציג משפטי מתבקשים להשיג נתונים אישיים של תורמים (למשל, מין, גיל, היסטוריה של דלקות ENT) שיכולות לסייע בפענוח תוצאות נסיוניות.
1. טיפול ברקמת המין האנושי
- שים שקדים מכל תורם בבקבוקון 50 mL סטרילי אחד המכיל 25 מ"ל PBS 1x ותחבורה בטמפרטורת החדר (RT) למעבדה על פי המלצות הרשות (להשתמש בשלוש רמות של הגנה: בבקבוקונים, תיבת בטיחות, ושקית).
הערה: ההליך כולו צריך להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. יש לטפל בכל היצורים האנושיים בזהירות כאשר הם לא היו מוסמכים בעבר ועשויים להכיל סוכנים מדבקים. -
נקה את כל הכלים בין כל שימוש.
- לאחר השימוש, לפרק את מסננת התא ולשמור עם כל המכשירים האחרים (למשל, pestle מלקחיים) באמבטיה המכילה פתרון חומרי ניקוי (1/10 אבקת נפח ב H2O) לילה.
- מצחצח כל כלי כדי להסיר את הרקמה ולשטוף עם מים צלולים.
- יבש כל החלקים היטב, ולאחר מכן להכין את מסננת התא (85 mL, 37 מ"מ בקוטר) על ידי הצבת רשת שינוי 60 פלדה על גבי רשת של 10 רשת שינוי פלדה ולסגור היטב את הטבעת.
- מניחים את כל הכלים בשקיות סטרילי וחיטוי.
2. חיתוך רקמת המין האנושי ובידוד התאים המונציריים (TMCs)
- מניחים את התא מסננת על 1 150 x 25 מ"מ2 (SPL150) מאכל תרבות התא ואת כל המכשירים ב SPL150 אחר כדי לשמור אותם סטרילי.
- להעביר את השקדים מן הבקבוקון לתוך מסננת התא באמצעות מלקחיים סטרילי. גם לשפוך את כל ה-PBS, אשר מכיל כמה תאים שגרזו את השקדים. במקרה הצורך, להוסיף יותר PBS לטבול את הרשת.
הערה: הרקמה צריכה להיות שקועה כל הזמן. כדי להימנע מייבוש - מסירים רקמה מדממת, עקובה מדם ופיברואיד בעזרת מלקחיים ואזמל.
הערה: שקדים הוסרו מילדים אינם זקוקים לשלב זה. - חותכים את הרקמות לחתיכות קטנות של פחות מ 0.5 ס מ בקוטר באמצעות האזמל ואת הפינצטה מעוקל. חותכים את כל הרקמה כך חתיכות קטנות יכול להיות שקוע כל הזמן.
- מניחים כמה חתיכות של רקמה בתוך מסננת התא ומגרדים אותם על הרשת עם מברשת זכוכית עד שרק שכבה דקה באמת של משתית לבן שרידים. להסיר ולמחוק את הסטרומה כדי למנוע סתימת הרשת.
- לאחר כל הרקמות כבר סחוט דרך הרשת, להשתמש בצינורות 10 מ"ל כדי להעביר את כל ההשעיה התא על הרשת ולגרד אותו פעם אחת האחרונה.
- העבר את המתלה לתא עם מתלה 10 מ ל לתוך בקבוקון סטרילי. שטוף את הרשת ואת מסננת התא עם PBS 1x. תן השעיה התא מנוחה 5 דקות ב RT על הספסל. שלב זה מאפשר את המשקעים ואת הזרע של שאריות משתית, תאים מתים, וכל דנ א שוחרר, ויהיה להקל על השלב הבא.
- מניחים הנפה סטרילית 70 יקרומטר על גבי בקבוקון חדש 50 mL (להסיר בזהירות מן המעטפה) ובעדינות להעביר את התא הבולם על זה עם מעטפת 10 mL. אין לערבב את ההשעיה, כי גלולה היא לעתים קרובות נוכח. אם המכתש הוא סתום, השתמש בגב של קצה סטרילי 1 mL לשרוט את התאים שוקת המסננת. שנה את הסננת בתדירות הנדרשת.
- צנטריפוגה את התאים ב 250 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה על ידי ערבוב בעדינות את הבקבוקון, ואז להשעות מחדש את התאים ב 35 mL של PBS.
- במבחנה חדשה, מקום חדש 70 יקרומטר הנפה על גבי ולהעביר את ההשעיה התא על זה עם פיפטה 10 mL. אם המכתש סתום, השתמש בטכניקה המפורטת בשלב 2.7.
3. בידוד של ה-TMCs באמצעות הדרגה של צפיפות התא
הערה: ניתן להשתמש ב-TMCs לאחר שלב 2.10. עם זאת, כדי לקבל פתרון תא ברור יותר להסיר פסולת תא אחרים כל התאים האדומים, מומלץ לבצע צפיפות תא הדרגתי בידוד של תאים mon, ברור.
- הוסף 15 מ ל של הצפיפות מעבר הצבע בינונית (d = 1.076 g/mL) בבקבוקון חדש 50 mL. יוצקים את הפתרון TMCs על גבי בינוני מעבר הצבע, להיות זהיר כדי למזער את ערבוב של ההשעיה עם המדיום מעבר הדרגתי צפיפות.
- צנטריפוגה את הפתרון ב 1,000 x g עבור 30 דקות ב-RT עם האצת ולנתק.
- להסיר עם הצינורות 10 מ ל ולמחוק את השכבה העליונה (מכיל בעיקר PBS 1x) מבלי להפריע את הממשק בין TMCs לבין המדיום הצפיפות מעבר הצבע.
הערה: TMCs מכיל מספר נמוך של אריתרופוציטים, ולכן הפתרון ברור. כך, הממשק בין הפתרון של TMCs ב-PBS ואת מעבר הצבע הבינוני בצפיפות יכול להיות קשה לדמיין. לפיכך, תאים ניתן להשעות מחדש ב-RPMI 1640 שיושלם עם 20 מ"מ HEPES (ללא FBS) לפני מעבר הדרגתי צפיפות מבוצע. - הסר את TMCs עם עצה סטרילית 1 mL ומקום בבקבוקון 50 mL חדש.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 50 mL של PBS המכיל 2% סרום העוברי (FBS) ו 2 מ"מ EDTA ו צנטריפוגה את הצינור ב 250 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר את טסיות הנותרים.
- חזור על שלב 3.5, אבל לצנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- הכנת התרבות בינונית (R10) על ידי להשלים את RPMI 1640 עם 10% חום מופעל FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, ואת פתרון אנטיביוטי (100 U/mL penicליום ו 100 μg/mL סטרפטומיצין).
- השהה מחדש את ה-TMCs ב-10 מ ל של R10 וספור את התאים. בממוצע, טכניקה זו תשואות 5 x 108-2 x 109 tmcs לכל זוג של שקדים. התאים יכולים לשמש כעת עבור חקירות כמו PBMCs מכל הדם (למשל, טיהור של סוג תא ספציפי, התרבות התא, cy, זרם הציטוזה, RT-qPCR, קופא, וכו ').
-
במקרה הצורך, הקפא את התאים לשימוש נוסף באמצעות טכניקות סטנדרטיות להקפאה של התא הראשי.
- ספור את מספר התאים.
- צנטריפוגה את התאים. ותסיר את הסופרנטאנט מפזר את הגלולה במספיק 100% FBS עבור ריכוז סופי של 1 x 108 תאים/mL, ולאחר מכן להוסיף את אותו כמות של 80% fbs + 20% dmso פתרון. התאים יהיו לאחר מכן ב 5 x 107 תאים/mL. שלב זה צריך להתבצע ב-4 ° c והפתרון FBS ו-DMSO צריך להישמר ב -4 ° c לפני השימוש.
- פזר 1 מ ל של פתרון התא לתוך קריוצינורות ולשים אותם במיכל קפוא איטי שהיה ב 4 ° c לילה כדי לשלוט על קצב הקיפאון של התא. מניחים אותו ב-80 ° c.
- כדי להפשיר את התאים, הניחו את הקריובקבוקונים באמבט חם ב-37 ° c לכמה שניות עם עצבנות מתמדת. ברגע התאים מתחילים להפשיר, להעביר אותם 49 mL של R10 וצנטריפוגה להסיר DMSO. ספור את התאים והשתמש בהם כ-PBMCs.
הערה: למרות הקפאת והפשרה TMCs יסיר פסולת, זה גם יפגע כמה סוגי תאים נדירים. אם הגושים או פסולת נוכחים לאחר הפשרה, עדיף לעבור את ההשעיה התא באמצעות מסננת 70 יקרומטר סטרילי לפני השימוש בו.
4. פנוטיפים לגבי מחשבי TMCs מאת זרם הציטוטרי
- לאחזר 5 x 106 תאים מהפתרון הקודם עבור כל התערובת נוגדן פאנל כי צריך להיבדק ומקום בצינור 5 מ ל cy, לנסות. אחזר 1 x 106 תאים עבור הפקד הבלתי מוכתם.
- לשטוף את התאים PBS ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה אותם מחדש ב-500 μL של PBS (1 x 106 תאים/mL) ו דגירה עם כתם הכדאיות עבור 30 דקות ב 4 ° c בחושך.
- הוסף 5 μL חום האדם המופעל בסרום AB לכל 100 μL של ההשעיה של התא ו מודטה עבור 15 דקות ב 4 ° c בחושך.
- שטוף את התאים ב-PBS + 2% FBS + 2 מ"מ EDTA (לשטוף מאגר) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- השהה מחדש את ה-TMCs ב-500 μL של מאגר הכביסה המכיל את הנוגדנים כמפורט בטבלה 1. ממחקון את התאים במשך 30 דקות ב -4 ° c בחשכה.
- שטוף את התאים בתוך שטיפת מאגר וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. השהה מחדש את מחשבי ה-TMCs ב-500 μL של PBS המכיל 0.5% מהפאראפורמלדהיד. המשיכו בחשכה ב -4 ° c עד הרכישה באמצעות הזרימה של הציטומה.
הערה: . מסוכן ביותר השתמש בפתרון מסחרי מוכן לשימוש כדי להכין את הפתרון של 0.5% בחצי הכיוון החצי.
| נוגדן | שיבוט | פלואורוכרום | חברה |
| חי מת | BV405 | תרמופישר מדעי | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | מיניגן |
| CD8 | SK1 | אמציאן | מיניגן |
| CD8 | BW135/80 | ויאובה | מילטניי ביוטק |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | מיניגן |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy 5.5 | BD |
| CD19 | HD237 | ECD | בקמן קולטר |
| CD20 | מיכל בן-עמי | אלקסה פלואור 700 | מיניגן |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | מיניגן |
| CD14 | M5E2 | APC | מיניגן |
| CD16 | שלמה כהן | APC-H7 | מיניגן |
| CD56 | MEM188 | PE | מיניגן |
| CD123 | מיכל כהן | PE | מיניגן |
| BDCA-1 | L161 | פסיפיק כחול | מיניגן |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | מיכל הג | מילטניי ביוטק |
| BDCA-4 | AD5-17 F6 | APC | מילטניי ביוטק |
| א. ל. ד | G646-6 | PerCP-cy 5.5 | מיניגן |
| CD11c | 3.9 | אלקסה פלואור 700 | מדעי הביולוגיה |
שולחן 1: רשימת נוגדנים לאפיון תאים על ידי שטהזרימה.
5. דוגמה להפעלת TMCs ומדידה של הפקת ציטוקין
- לדלל את TMCs ב R10 בינונית כדי לקבל ריכוז של 2 x 106 תאים/mL.
- הפץ 400,000 TMCs ב 200 μL של R10 בלוח 96 התחתון עגול היטב.
- כדי להפעיל את התאים, להוסיף 5 μg/mL של הTLR7/8 אגוניסט (R848) בלילה.
- לצנטריפוגה את הצלחות ולאחזר את TMCs ' supernatant ולהקפיא אותו לניתוח נוסף. הייצור cytokine יהיה מוערך באמצעות חרוז מבוססי החיסונית אומר לכמת ציטוקינים מסיסים מרובים בו באמצעות cytokine זרימה בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- העריכו את יכולת הכדאיות של התאים באמצעות שיטת הכדאיות של התא הזורח בעקבות פרוטוקול היצרן. בקצרה, להוסיף 60 μL של פתרון הכדאיות של התא לבארות ולמדוד האור בתוך 10 דקות (הרכישה עבור 1 s/טוב).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לראשונה אפיינו את הפרופיל החיסוני של תאים נוכח בתרבות וניתח את כמות TMCs. . בעזרת השקדים והטטוטונסות כפי שמוצג באיור 1, כל סוגי התא החיסונית העיקריים הקיימים pbmcs מהדם היו מייצגים tmcs מן השקדים. עם זאת, ב-TMCs התדירות של כל סוגי התאים, למעט תאים B, היו נמוכים מ-PBMCs.
איור 1: פנוטיפים של TMCs בשקדים. TMCs מתורמים בריאים הושגו לאחר הניתוח של רקמת המין האנושי ובידוד של תאים. (א) תאים היו ויטראז ', והנתונים נרכשו על ידי שטהזרימה. נתונים מייצגים ניסוי מייצג. (ב) הטבלה מסכמת את אחוז כל סוג תא ב-tmcs חי בשקדים משישה תורמים בריאים שונים ומשווה כל אחד לאחוז של כל סוג תא ב pbmcs מן הדם, כפי שהוגדר בספרות18,19. נתונים מוצגים כאחוז של תאים חיים SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
לאחר מכן בדקנו את התגובות האימונולוגיים של ה-TMCs. אחת הדרכים לשכפל הפעלה של תא נגד פתוגן היא לעורר את החיישנים החיסונית מולדים ממשפחת קולטנים כמו (TLRs) משפחה. TLRs נמצאים בעיקר ב מונוציטים/מקרופאגים, כל תא דנדריטי (DC) תת תאים דנדריטים (pDCs), וגם בתאי B. בדוגמה זו, למדנו TLR7 ו-TLR8, כיוון שהם מתמחים בתגובות אנטי-ויראליות וברוב המקרים של דלקת שקדים (כלומר, דלקות טונסיל) נגרמות על ידי זיהום נגיפי. כך, tmcs מן השקדים (גרף בכחול) מתוך שבעה תורמים בריאים היו לילה עם TLR7/8 ליגנד הרסימmod (R848). כמו PBMCs (גרף בירוק), הפעלה באמצעות TLR7/8 איתות מופעל הייצור של סוג I הפרעות (IFN) ו ציטוקינים pro-דלקתיות. למעשה, ציטוקינים המיוצר ביותר ב tmcs בעת ההפעלה היה ifnα, חבר משפחת הסוג אני ifn כי הוא מעורב בעיקר חסינות מולדים נגד זיהום נגיפי מופק בעיקר על ידי pdcs. כל ציטוקינים נבדק, למעט IFN2/3 ו-IL-8, יוצרו על ידי TMCs, למרות ברמות נמוכות יותר ב PBMCs. מעניין, כמה ציטוקינים (בעיקר IL-8, אבל גם IL-6, IL-10, ו-TNFα) היו בכמות גדולה יותר ברמות בסיס. יתר על כן, השוונו את ציטוקינים המיוצר על ידי tmcs מבודדים או על ידי בלוק רקמות toncs הכין כמתואר בעבר6. מדדנו את כל סוגי IFN המיוצר על הסופר של שתי תרבויות תאים באמצעות עוקץ-37 העיתונאי קו הכתב כמתואר לפני17 והראה כי יכולנו רק למדוד את רמות ifn ב-TMCs מבודדים.
איור 2: TMCs המיוצר ציטוקינים על גירוי. (א) מטוהרים ומבודדים TMCs (כחול) ו pbmcs (ירוק) היו מגורה לילה עם R848 (5 μg/mL). הסופרנטנים אוחזרו והוקפאו עד שימוש. שיטת החיסונית מבוססת חרוז בוצעה כדי לכמת ציטוקינים מסיסים מרובים בו באמצעות cytometer זרימה. הגרפים מייצגים את הריכוז בפיקגרם למילי-ליטר של כל ציטוקין שנמדד. עליות הקיפול מבוארות באדום על הגרפים. . מבחן מאן-ויטני-יו (ב) מטוהרים ומבודדים tmcs מ שקדים (כחול) ומבודד רקמות בצבע (כתום) היו מגורה עבור 24 h עם שפעת A וירוס (iav). שימש כעיתונאי עוקץ-37 כתבת למדוד את הייצור IFN ב-supernatant. תיבת מתווה הקצקר עם חציון ± מינימום למקסימום. . מבחן מאן-ויטני-יו P < 0.001, * *P ≪ 0.01, *p < 0.05. NS = לא מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בסופו של דבר, בדקנו את הכדאיות של מחשבי ה-TMCs. טכניקות מסוימות זמינות כדי למדוד את הכדאיות של התא. כאן, השתמשנו ביכולת הכדאיות של התאים הזורח, שיטת פעולה קלה ומהירה של שני צעדים. כפי שמוצג באיור 3, גילינו בבירור את הרעילות הציטומה שנגרמה על-ידי תרכובת 1 ב tmcs, שאינה רעילה ל-PBMCs. לכן, TMCs הראה רגישות גבוהה יותר התרופה נבדק.
איור 3: מתחם 1 היה רעיל TMCs. מטוהרים ומבודדים TMCs ו PBMCs היו preדגירה עם תרכובת 1 (C1) בריכוזים שונים עבור 1 h ולאחר מכן מגורה לילה עם R848 (5 μg/mL). על-ידי מכשיר ההאחורים אוחזרו, 60 μL של פתרון הכדאיות של התא נוסף, ולאור נמדד. The * מייצג את הניתוח הסטטיסטי השוואת C1 ל-NS. תיבת מתווה הקצקר עם חציון ± מינימום למקסימום. מבחן קרוקל-ווליס. עם תיקון ההודעה של דאן-הוק P < 0.0001, * * *p < 0.001, * *p < 0.01, *P < 0.05. NS = לא מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השקדים האנושיים מייצגים מודל אינטגרטיבי ופיזיולוגי ex vivo ללמוד תגובות החיסונית מולדת בממשק רירית, משום שהם לחקות את התפקיד של איבר הלימפה המשני. מעניין, הרכב הסלולר של TMCs דומה ל-PBMCs וכולל את כל אוכלוסיות התאים הגדולות, למרות שהאחוז שלהם יכול להיות שונה מ-PBMCs מדם (איור 1). אוכלוסיות נוספות ניתן למצוא גם, כמו כל התגובות החיסונית מבוצעים ברקמות (רירית או איברי הלימפה משני) ולא בדם.
השימוש ברקמות הגוף האנושי כמו גם בשימוש בתרבית תאים או בתאי דם לכל אחד מהם יש את היתרונות שלהם. עם זאת, עבור הפרשה ציטוקין לימוד הפעלת התא, explants רקמות לא היו המודל הטוב ביותר. למעשה, לא יכולנו לזהות כל הפקה של IFN ב-supernatant של explants רקמות (איור 2ב). אנו משערים כי הוא נצרך ישירות על ידי התאים המקיפים. מצד שני, גירוי של כדוריות הדם (PBMCs) יכול לחקות את התגובה הראשונית לזיהום אבל לא לחקות את מה קורה ברקמות, שם רוב ציטוקינים מיוצרים והיכן וירוסים לשכפל. לכן, אנו מגדיר פרוטוקול לבידוד וטיהור תאים הנובעים מרקמת הלימפה המשנית, הטונסיל. טיהרתי TMCs משקדים אנושיים בריאים, אשר מאפשר לנו לחקור את הפעלת התא החיסונית על גירוי. עם זאת, אחת המגבלות של מודל זה היא TMCs לא לייצר כמו ציטוקינים פרו דלקתיים רבים כמו PBMCs ex vivo על TLR7/8 גירוי, למרות רמות של IFNα, cy, הנגיפים העיקריים, דומה בשתי התרבויות.
המחקר של רעילות מורכבת על TMCs לעומת PBMCs חשף כי TMCs רגישים יותר לסם רעיל (איור 3). לכן, יש לבדוק את הרעילות של תרופות חדשות וטיפולים עתידיים בתאים מרקמות ולא רק על קווי התאים, PBMCs, או מתקני רקמות. לכן, השימוש ב-TMCs עבור בדיקות סמים נראה כיישום עתידי של השיטה המתוארת.
שקדים של מבוגרים או ילדים ניתן להשיג ולעבד כמתואר. עם זאת, אנו ממליצים להשיג שקדים מילדים משתי סיבות עיקריות: 1. השקדים של ילדים מכילים יותר תאים מאשר הבוגרים20. בהחלט, היפראמפרס הוא נפוץ במיוחד אצל ילדים, כי הם נלחמים יותר וירוסים ילדות. כך, אלה השקדים גדול יכול להפוך השקדים חסימתית צריך להיות מוסר על ידי ניתוח שקדים חלקיים כדי למנוע סיבוכים כמו דום נשימה בשינה13; 2) מכיוון ששקדים של מבוגרים מוסרים בדרך כלל לאחר כמה פרקים של דלקות האוזן-גרון (ENT), השקדים האלה הם פחות תמימים ומכילים פחות תאים.
זה קריטי לעבוד על השקדים בהקדם האפשרי לאחר ניתוח ההסרה, באופן אידיאלי < 3 h לאחר האיסוף. אכן, מיד לאחר ההסרה עד לניתוח, השקדים מכל צד נשמרים יחד בבקבוקון 50 mL סטרילי המכיל סביב 20 מ ל של PBS, כך שהם לגמרי שקוע.
ההבדלים בין תורמים יכולים לייצג בעיה מרכזית לצורך התוכסות. ואכן, השונות בקומפוזיציה התאית בין התורמים יכולה להיות משמעותית. הפרוטוקול שלנו, באמצעות TMCs ולא explants רקמות, מגביל את השונות כי התאים מתוך השקדים כולו מעורבים לפני להיות מצופה והציב בתרבות, בעוד רקמות explants להביא השתנות התורם בהרכב הסלולר כי החלקים מגיעים מאזורים שונים בתוך אותו הדגימה. ניתוח שקדים חלקי יכול להתבצע רק על השקדים שאינם מודלקים, המגבילים את השונות הסטטוס הדלקתי בין המטופלים. אנו ממליצים גם על איסוף שקדים שהוסרו בניתוח בימים שונים. הבחנו בבירור שיכולות בין-מנתחים והשונות הבין-יומית גבוהות יותר מהבדלים בין תורמים (הנתונים אינם מוצגים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
העבודה הזאת נתמכת על ידי הסוכנות הלאומית למחקר הלאומי של הסוכנות למען הפרקליט המחוזי (J-P. ח) לניסויים ומלגת N.B. (AAP 2017 166). נ מאשר תמיכה של anrs עבור ההתחברות (aap 2016 1), הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית embo עבור ההתחברות (LT 834 2017), תוכנית מימון ההפעלה "באושטיין" של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Ulm (lsbn. 0147) ו הגרמני forschans544/1 1 gealllllllllllll
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
