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Immunology and Infection

एक मानव म्यूकोसल लिम्फोइड ऊतक में पूर्व वीवो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/60914
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,3,4, 4,5, *6, *2,3,4
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि सक्रियण पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आंशिक सर्जिकल टॉन्सिलेक्टॉमी से गुजर रहे स्वस्थ मनुष्यों से टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को आसानी से कैसे संसाधित और संस्कृति से जोड़ा जाए, म्यूकोसल ऊतकों में वायरल संक्रमण की नकल करें।

Abstract

म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतकों (माल्ट) से अलग कोशिकाओं का अध्ययन म्यूकोसल प्रतिरक्षा से जुड़ी विकृतियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की समझ की अनुमति देता है, क्योंकि वे ऊतक में मेजबान-रोगजनक बातचीत मॉडल कर सकते हैं। जबकि ऊतकों से प्राप्त अलग कोशिकाओं पहले सेल संस्कृति मॉडल थे, उनके उपयोग की उपेक्षा की गई है क्योंकि ऊतक प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम समझाते हैं कि स्वस्थ मानव टॉन्सिल से टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (टीएमसी) को सक्रियण पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने, म्यूकोसल ऊतकों में वायरल संक्रमण की नकल करने के लिए आसानी से कैसे संसाधित और संस्कृति का अध्ययन किया जाए। टॉन्सिल से टीएमसी का अलगाव जल्दी होता है, क्योंकि टॉन्सिल में बमुश्किल कोई एपिथेलियम होता है और सभी प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के अरबों तक उपज होती है। यह विधि रक्त से परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के उपयोग के समान इम्यूनोसे, क्यूपीसीआर, माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री आदि सहित कई तकनीकों का उपयोग करके साइटोकिन उत्पादन का पता लगाने की अनुमति देती है। इसके अलावा, टीएमसी पीबीएमसी की तुलना में दवा परीक्षण के प्रति उच्च संवेदनशीलता दिखाते हैं, जिसे भविष्य की विषाक्तता के लिए विचार करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, पूर्व वीवो टीएमसी संस्कृतियां एक आसान और सुलभ म्यूकोसल मॉडल हैं।

Introduction

मानव अंगों पर अध्ययन पहुंच के साथ-साथ स्पष्ट नैतिक कारणों के कारण प्रतिबंधित हैं । हालांकि, वे मानव जीव विज्ञान की जटिलता को पूरी तरह से समझने के लिए आवश्यक हैं। अलग कोशिकाओं की संस्कृतियों (प्राथमिक संस्कृतियों या सेल लाइनों) उनकी उपलब्धता के कारण सेल जीव विज्ञान के अध्ययन में एक मानक प्रणाली है । जबकि अलग सेल संस्कृतियों बकाया खोजों की अनुमति दी है, सेल लाइनों के उपयोग के करीब जांच पर आ गया है क्योंकि वे पूरी तरह से वीवो अंग जीव विज्ञान में नकल नहीं करते । हालांकि, त्रि-आयामी कोशिकाओं या ऊतक एक्सप्लांट की संस्कृति अत्यधिक जटिल है4,,5,,6। दरअसल, ऊतक या अंग का एक टुकड़ा अत्यधिक विषम है क्योंकि इसकी कोशिका संरचना ऊतक में स्थानीयकरण के आधार पर अलग होती है। इस प्रकार, ऊतक ब्लॉकों का उपयोग करने के लिए कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जिससे बड़ी संख्या में दानदाताओं या रोगियों की आवश्यकता होती है।

म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतक (माल्ट) संरचनात्मक रूप से लिम्फ नोड्स के समान होते हैं, लेकिन अद्वितीय कार्य होते हैं, क्योंकि उनकी मुख्य भूमिका म्यूकोसल प्रतिरक्षा7को विनियमित करना है। लिम्फ नोड्स के विपरीत, जो आमतौर पर ऊतकों से कुछ दूरी पर स्थित होते हैं, माल्ट आम तौर पर म्यूकोसल ऊतक के एपिथेलियम के तुरंत नीचे स्थित होते हैं। हिस्टोलॉजिकल रूप से, वे मुख्य रूप से बी और टी कोशिकाओं की उच्च सांद्रता से बने होते हैं, लेकिन एंटीजन-पेश कोशिकाएं जैसे मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं भी होती हैं। माल्ट मानव शरीर में लिम्फोइड ऊतक का लगभग 50% बनता है। माल्ट को उनके स्थान के आधार पर नौ समूहों में विभाजित किया जाता है: GALT (आंत-), बाल्ट (ब्रोंकस-), NALT (नाक-), CALT (कंजक्टिव), लालीटी (कंठ-), नमक (त्वचा-), VALT (vulvo-), ओ-माल्ट (संगठित), और डी-माल्ट (विसरित) । ओ-माल्ट मुख्य रूप से वाल्देयर के टॉन्सिलर रिंग के टॉन्सिल से बना है और यह सबसे सुलभ माल्ट8,,9है। दरअसल, ओरोफेरिन्स में स्थित टॉन्सिल पाचन और श्वसन तंत्र (संभावित) आक्रामक सूक्ष्मजीवों10से रक्षा करने वाली प्रमुख बाधा का गठन करते हैं । इसके अलावा, टॉन्सिल को एक महीन स्तरीकृत स्क्वैमस गैर-केराटिनाइजिंग एपिथेलियम द्वारा कवर किया जाता है, जो रक्त वाहिकाओं, नसों और लिम्फाटिक्स युक्त कनेक्टिव ऊतक के कैप्सूल द्वारा समर्थित होता है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं11,,12तक आसान पहुंच प्रदान करता है। इसके अलावा, टॉन्सिलेक्टॉमी, टॉन्सिल को हटाने का शल्य चिकित्सा कार्य, नींद से अस्त-व्यस्त श्वास लेने वाले बच्चों पर किया जाने वाला एक आम प्रक्रिया है, जिससे टॉन्सिल शारीरिक सेटिंग्स में आसानी से उपलब्ध ऊतक13 बन जाते हैं।

टॉन्सिल म्यूकोसल प्रतिरक्षा से जुड़ी विकृतियों में प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रिया के अध्ययन की अनुमति देते हैं। दरअसल, एचआईवी संक्रमण में, क्योंकि टॉन्सिल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उच्च एकाग्रता से बना होते हैं, वे वायरल प्रतिकृति का मुख्य लक्ष्य होते हैं, लेकिन संचलन14, 15,15में बड़ी मात्रा में साइटोकिन्स का उत्पादन भी करते हैं। स्थिर राज्यों में, जन्मजात कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी टॉन्सिल सहित विभिन्न म्यूकोसल ऊतकों में मौजूद होती है, लेकिन रक्त से अनिवार्य रूप से अनुपस्थित होती है।

इस प्रकार, टॉन्सिल (टीएमसी) से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं पीबीएमएमसी की तुलना में अधिक प्रासंगिक और जटिल मॉडल हैं और अधिक गहन प्रश्नों का उत्तर दे सकती हैं। दूसरी ओर, ऊतक एक्सप्लांट का उपयोग जटिल हो सकता है और हमेशा जन्मजात प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है। इस प्रकार, हमने टीएमसीएस 16 का उपयोग करके म्यूकोसल प्रतिरक्षा सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडलस्थापित किया। यहां, हम ताजा मानव टॉन्सिल से टीएमसी के कुशल अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि पूर्व वीवो अध्ययनों के लिए अपनी अखंडता रखते हुए बड़ी संख्या में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली की अनुमति देती है।

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Protocol

नमूनों को विशेष रूप से अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एकत्र नहीं किया जाता है और अध्ययन को आक्रामक नहीं माना जाता है । हालांकि, मानव टॉन्सिल संग्रह को स्थानीय संबंधित प्राधिकरणों द्वारा नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता होती है। हमारे मामले में, इसे कॉमिट डी प्रोटेक्शन डेस पर्सननेस (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इसके अलावा, प्रत्येक रोगी या कानूनी प्रतिनिधि की सहमति दानदाताओं के व्यक्तिगत डेटा (जैसे, सेक्स, आयु, ईएनटी संक्रमण के इतिहास) प्राप्त करने के लिए अनुरोध किया जाता है जो प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने में मदद कर सकता है।

1. मानव टॉन्सिलर ऊतक की हैंडलिंग

  1. प्राधिकरण की सिफारिशों के अनुसार प्रयोगशाला में 25 एमएल पीबीएस 1x और परिवहन युक्त एक बाँझ 50 एमएल शीशी में हर दाता से टॉन्सिल रखें (सुरक्षा के तीन स्तरों का उपयोग करें: शीशियों, एक सुरक्षा बॉक्स, और एक बैग)।
    नोट: पूरी प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। सभी मानव नमूनों को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए क्योंकि वे पहले योग्य नहीं थे और संक्रामक एजेंट हो सकते हैं।
  2. प्रत्येक उपयोग के बीच में सभी उपकरणों को साफ करें।
    1. उपयोग के बाद, कोशिका छलनी को अलग करें और रात भर डिटर्जेंट समाधान (एच2ओ में 1/10 वॉल्यूम डिटर्जेंट) वाले स्नान में अन्य सभी उपकरणों (जैसे मूसल, संदंश) के साथ रखें।
    2. टिश्यू को हटाने के लिए हर बर्तन को ब्रश करें और साफ पानी से धो लें।
    3. सभी हिस्सों को अच्छी तरह से सुखाएं, फिर 10 जाल स्टील ग्रिड के शीर्ष पर 60 जाल स्टील ग्रिड रखकर सेल छन्नी (85 एमएल, 37 मिमी व्यास) तैयार करें और अंगूठी को कसकर बंद करें।
    4. बाँझ बैग और ऑटोक्लेव में सभी उपकरण रखें।

2. मानव टॉन्सिलर ऊतक का विच्छेदन और टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव (टीएमसी)

  1. सेल छन्नी को एक 150 x 25 मिमी2 (SPL150) सेल कल्चर डिश और सभी उपकरणों को बाँझ रखने के लिए एक और SPL150 पर रखें।
  2. शीशी से टॉन्सिल को बाँझ संदंश का उपयोग करके कोशिका छलनी में स्थानांतरित करें। इसके अलावा पीबीएस के सभी में डालना है, जो कुछ कोशिकाओं है कि टॉन्सिल egressed है शामिल हैं । यदि आवश्यक हो, तो ग्रिड को विसर्जित करने के लिए और अधिक पीबीएस जोड़ें।
    नोट: इचाक से बचने के लिए टिश्यू को हर समय डुबोना चाहिए।
  3. संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करके कॉटराइज्ड, खूनी और फाइब्रॉइड ऊतक को हटा दें।
    नोट: बच्चों से हटाए गए टॉन्सिल को इस कदम की आवश्यकता नहीं है।
  4. ऊतकों को स्केलपेल और घुमावदार चिमटी का उपयोग करके व्यास में 0.5 सेमी से कम के छोटे टुकड़ों में काट लें। सभी टिश्यू को काट लें ताकि छोटे-छोटे टुकड़े हर समय डूब सकें।
  5. कोशिका छलनी में ऊतक के कुछ टुकड़े रखें और उन्हें एक ग्लास मूसल के साथ ग्रिड पर परिमार्जन करें जब तक कि सफेद स्ट्रोमा की वास्तव में पतली परत बनी न हो। ग्रिड को अवरुद्ध करने से बचने के लिए स्ट्रोमा को हटाएं और त्यागें।
  6. एक बार जब सभी ऊतकों को ग्रिड के माध्यम से निचोड़ा गया हो, तो ग्रिड पर सभी सेल निलंबन को स्थानांतरित करने और इसे एक आखिरी बार परिमार्जन करने के लिए 10 एमएल पिपेट का उपयोग करें।
  7. एक बाँझ शीशी में एक 10 एमएल पिपेट के साथ सेल निलंबन स्थानांतरित करें। ग्रिड और सेल छलनी को पीबीएस 1x से धोएं। बेंच पर आरटी में 5 मिनट के लिए सेल निलंबन आराम करते हैं। यह कदम बचे हुए स्ट्रोमा, मृत कोशिकाओं और किसी भी जारी डीएनए की वर्षा और समूहीकरण की अनुमति देता है, और अगले चरण को सुविधाजनक बना देगा।
  8. एक नई 50 एमएल शीशी के शीर्ष पर एक बाँझ 70 माइक्रोन छलनी रखें (लिफाफे से ध्यान से हटा दें) और धीरे-धीरे सेल निलंबन को 10 एमएल पिपेट के साथ उस पर स्थानांतरित करें। निलंबन को न मिलाएं, क्योंकि एक गोली अक्सर मौजूद होती है। यदि छलनी भरा हुआ है, तो छलनी को खरोंच करने के लिए बाँझ 1 एमएल पिपेट टिप के पीछे का उपयोग करें। जितनी बार जरूरी हो छलनी बदलें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  10. सुपरनैंट को त्यागें और धीरे-धीरे शीशी को मिलाकर गोली को फिर से व्यतीत करें, फिर पीबीएस के 35 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रखें।
  11. एक नई शीशी में, शीर्ष पर एक नया 70 माइक्रोन छलनी रखें और सेल निलंबन को 10 एमएल पिपेट के साथ उस पर स्थानांतरित करें। यदि छलनी भरा हुआ है, तो चरण 2.7 में विस्तृत तकनीक का उपयोग करें।

3. सेल घनत्व ढाल द्वारा टीएमसी का अलगाव

नोट: टीएमसी का उपयोग चरण 2.10 के बाद किया जा सकता है। हालांकि, एक स्पष्ट सेल समाधान प्राप्त करने और अन्य सेल मलबे और किसी भी लाल कोशिकाओं को हटाने के लिए, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के सेल घनत्व ढाल अलगाव करने की सलाह दी जाती है।

  1. एक नई 50 मिलील शीशी में घनत्व ढाल माध्यम (d = 1.076 g/l) के 15 एमएल जोड़ें। घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर TMCs समाधान डालो, घनत्व ढाल माध्यम के साथ निलंबन के मिश्रण को कम करने के लिए सावधान किया जा रहा है ।
  2. त्वरण के साथ आरटी में 30 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर समाधान अपकेंद्रित्र करें और टूट जाएं।
  3. 10 एमएल पिपेट के साथ निकालें और ऊपरी परत (ज्यादातर पीबीएस 1x युक्त) को टीएमसी और घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफेस को परेशान किए बिना त्याग दें।
    नोट: टीएमसी में एरिथ्रोसाइट्स की कम संख्या होती है, इसलिए समाधान स्पष्ट है। इस प्रकार, पीबीएस में टीएमसी के समाधान और घनत्व ढाल माध्यम के बीच इंटरफेस कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। तदनुसार, कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 में 20 एमएम एचईपी (एफबीएस के बिना) के साथ पूरक किया जा सकता है इससे पहले कि घनत्व ढाल किया जाता है।
  4. एक बाँझ 1 एमएल पिपेट टिप के साथ टीएमसी निकालें और एक नई 50 एमएल शीशी में रखें।
  5. शेष प्लेटलेट्स को हटाने के लिए 2 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 2 एमएम ईडीए और 2 एमएम ईडीए के 50 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 x g पर पीस लें।
  6. चरण 3.5 दोहराएं, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें।
  7. 10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 2 m L-ग्लूटामाइन, और एंटीबायोटिक समाधान (१०० यू/एमएल पेनिसिलियम और १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ RPMI १६४० के पूरक द्वारा संस्कृति माध्यम (R10) तैयार करें ।
  8. आर10 के 10 एमएल में टीएमसी को रीसुस्पेंड करें और कोशिकाओं की गिनती करें। औसतन, यह तकनीक 5 x 108-2 x 109 टीएमसी प्रति जोड़ी टॉन्सिल की पैदावार करती है। कोशिकाओं का उपयोग अब पूरे रक्त से पीबीएमसीसी (जैसे, विशिष्ट सेल प्रकार, सेल संस्कृति, प्रवाह साइटोमेट्री, आरटी-क्यूपीसीआर, फ्रीजिंग आदि की शुद्धि) जैसी जांचों के लिए किया जा सकता है।
  9. यदि आवश्यक हो, तो प्राथमिक सेल ठंड के लिए मानक तकनीकों का उपयोग करके आगे उपयोग के लिए कोशिकाओं को फ्रीज करें।
    1. कोशिकाओं की संख्या गिनें।
    2. कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटा दें। 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए पर्याप्त 100% एफबीएस में गोली को भंग करें, फिर 80% एफबीएस + 20% डीएमएसओ समाधान की समान मात्रा जोड़ें। इसके बाद कोशिकाएं 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल पर होंगी । यह कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले एफबीएस और डीएमएसओ समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
    3. सेल समाधान के 1 एमएल को क्रायोट्यूब में वितरित करें और उन्हें एक धीमी ठंड कंटेनर में डाल दें जो सेल फ्रीजिंग की दर को नियंत्रित करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रहा है। इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. कोशिकाओं को गलने के लिए, लगातार आंदोलन के साथ कुछ सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म स्नान में क्रायोवियल रखें। जैसे ही कोशिकाएं गलनी शुरू होती हैं, उन्हें डीएमएसओ को हटाने के लिए आर10 और सेंट्रलाइज के 49 एमएल में स्थानांतरित कर दें। कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें पीबीएमसी के रूप में उपयोग करें।
      नोट: हालांकि ठंड और TMCs विगलन मलबे को दूर करेगा, यह भी कुछ दुर्लभ सेल प्रकार को नुकसान होगा । यदि विगलन के बाद झुरमुट या मलबे मौजूद हैं, तो इसका उपयोग करने से पहले बाँझ 70 माइक्रोन छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को पारित करना सबसे अच्छा है।

4. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टीएमसी की फेनोटाइपिंग

  1. प्रत्येक एंटीबॉडी मिश्रण पैनल के लिए पिछले समाधान से 5 x10 6 कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करें जिन्हें परीक्षण करने और 5 एमएल साइटोमेट्री ट्यूब में रखने की आवश्यकता होती है। अन दाग नियंत्रण के लिए 1 x10 6 कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करें।
  2. पीबीएस और सेंट्रलाइज में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर धोएं। उन्हें पीबीएस (1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल) के 500माइक्रोन में फिर से खर्च करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए व्यवहार्यता दाग के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. सेल निलंबन के प्रति 100 माइक्रोन प्रति 5 μL गर्मी निष्क्रिय मानव एबी सीरम जोड़ें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. पीबीएस + 2% एफबीएस + 2 एमएम ईडीए (वॉश बफर) और सेंट्रलाइज में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्स ग्राम पर धोएं।
  5. टेबल 1में विस्तृत रूप से एंटीबॉडी युक्त वॉश बफर के 500 माइक्रोन में टीएमसी को फिर से खर्च करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. वॉश बफर और सेंट्रलाइज में कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर धोएं। पीएफबी के 500 माइक्रोन में टीएमसी को फिर से रीसेल्ब करें जिसमें पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का 0.5% होता है। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अधिग्रहण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें।
    नोट: पीएफए खतरनाक है। 0.5% पीएफए समाधान तैयार करने के लिए एक वाणिज्यिक तैयार करने के लिए उपयोग समाधान का उपयोग करें।
एंटीबॉडी क्लोन फ्लोरोक्रोम कंपनी
लाइव-डेड बीवी405 थर्मोफिशर साइंटिफिक
सीडी 3 एसपी34-2 V500 बीडी Pharmingen
सीडी 8 एसके1 अयान बीडी Pharmingen
सीडी 8 BW135/80 वायब्लू मिल्टेयी बायोटेक
सीडी 4 आरपीए-टी 4 पीई-Cy7 बीडी Pharmingen
सीडी45 HI30 PerCP-cy5.5 Bd
सीडी19 एचडी237 Ecd बेकमैन कल्टर
सीडी20 2H7 एलेक्सा फ्लोर 700 बीडी Pharmingen
सीडी14 M5E2 पीई-साइ7 बीडी Pharmingen
सीडी14 M5E2 Apc बीडी Pharmingen
सीडी16 3जी8 एपीसी-एच7 बीडी Pharmingen
सीडी56 एमईएम188 पीई बीडी Pharmingen
सीडी123 7जी3 पीई बीडी Pharmingen
बीडीसीए-1 L161 प्रशांत ब्लू बीडी Pharmingen
बीडीसीए-3 AD5-14H12 फिटसी मिल्टेयी बायोटेक
बीडीसीए-4 AD5-17F6 Apc मिल्टेयी बायोटेक
एचएलए-डीआर G646-6 PerCP-cy5.5 बीडी Pharmingen
सीडी11सी 3.9 एलेक्सा फ्लोर 700 एबियोसाइंसेज

तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सेल लक्षण वर्णन के लिए एंटीबॉडी की सूची।

5. टीएमसी की सक्रियता और साइटोकिन उत्पादन की माप का उदाहरण

  1. 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए R10 माध्यम में टीएमसी को पतला करें।
  2. 96 अच्छी तरह से गोल बॉटम प्लेट में आर10 के 200 माइक्रोन में 400,000 टीएमसी वितरित करें।
  3. कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, रात भर TLR7/8 agonist resiquimod (R848) के 5 μg/mL जोड़ें ।
  4. प्लेटों को अपकेंद्रित्र करें और टीएमसीएस के सुपरनेट को पुनः प्राप्त करें और इसे आगे के विश्लेषण के लिए फ्रीज करें। साइटोकिन उत्पादन का मूल्यांकन किया जाएगा मनका आधारित इम्यूनोसे का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके एक साथ कई घुलनशील साइटोकिन्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करने वाले ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करें। संक्षेप में, कुओं के लिए सेल व्यवहार्यता समाधान के 60 μL जोड़ें और 10 मिनट के भीतर चिकनाई उपाय (1 s/

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Representative Results

हमने सबसे पहले संस्कृति में मौजूद कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल की विशेषता बताई और टीएमसी की मात्रा का विश्लेषण किया। हमने फ्लो साइटोमेट्री के साथ टॉन्सिल से टीएमसी को फेनोटाइप किया। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, रक्त से पीबीएमसी में मौजूद सभी प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार टॉन्सिल से टीएमसी में प्रतिनिधित्व करते थे। हालांकि, टीएमसी में बी सेल को छोड़कर सभी सेल प्रकारों की आवृत्ति पीबीएमसी की तुलना में कम थी।

Figure 1
चित्रा 1: टॉन्सिल में टीएमसी की फेनोटाइपिंग। मानव टॉन्सिलर ऊतक के विच्छेदन और कोशिकाओं के अलगाव के बाद स्वस्थ दानदाताओं से टीएमसी प्राप्त किए गए थे। (A)कोशिकाओं पर दाग थे, और डेटा प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्राप्त किए गए थे । डेटा एक प्रतिनिधि प्रयोग का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख)तालिका छह अलग - अलग - अलग स्वस्थ रक्तदाताओं से टॉन्सिल में लाइव टीएमसी में प्रत्येक सेल प्रकार के प्रतिशत को संक्षेप में प्रस्तुत करती है और प्रत्येक की तुलना रक्त से पीबीएमसी में प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिशत से करती है, जैसा कि साहित्य18,,19में परिभाषित किया गया है । डेटा को लाइव कोशिकाओं के प्रतिशत एसडी के रूप में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इसके बाद हमने टीएमसी की इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं का परीक्षण किया । एक रोगजनक के खिलाफ एक सेल की सक्रियता को पुन: पेश करने का एक तरीका टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) परिवार से जन्मजात प्रतिरक्षा सेंसर को उत्तेजित करना है। टीएलआर मुख्य रूप से मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज, सभी डेंड्रिटिक सेल (डीसी) उपप्रकार, प्लाज्साइटोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं (पीडीसी) और बी कोशिकाओं में भी मौजूद होते हैं। इस उदाहरण में, हमने TLR7 और TLR8 का अध्ययन किया, क्योंकि वे एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं के विशेषज्ञ हैं और टॉन्सिलाइटिस (यानी, टॉन्सिल संक्रमण) के अधिकांश मामले वायरल संक्रमण के कारण होते हैं। इस प्रकार, सात स्वस्थ दानदाताओं से टॉन्सिल (नीले रंग में ग्राफ) से टीएमसी को टीएलआर 7/8 लिगामेंट रिसिमोड (R848) के साथ रातोंरात उत्तेजित किया गया। पीबीएमसीएस (हरे रंग में ग्राफ) के रूप में, TLR7/8 सिग्नलिंग के माध्यम से सक्रियण प्रकार मैं इंटरफेरॉन (IFN) और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन शुरू कर दिया । वास्तव में, सक्रियण पर टीएमसी में सबसे अधिक उत्पादित साइटोकिन IFNα था, जो प्रकार के एक सदस्य आई आईएफएन परिवार था जो मुख्य रूप से वायरल संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा में शामिल है और ज्यादातर पीडीसी द्वारा उत्पादित होता है। IFN2/3 और आईएल-8 को छोड़कर सभी साइटोकिन्स का परीक्षण किया गया था, हालांकि पीबीएमसी की तुलना में निचले स्तरों पर, हालांकि पीबीएमसी की तुलना में निचले स्तर पर उत्पादित किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि कुछ साइटोकिन्स (मुख्य रूप से आईएल-8, लेकिन आईएल-6, आईएल-10 और टीएनएफएα) बेसल स्तरों पर बड़ी मात्रा में मौजूद थे। इसके अलावा, हमने अलग-थलग पड़े टीएमसी द्वारा उत्पादित साइटोकिन की तुलना की या टॉन्सिलर टिश्यू ब्लॉक द्वारा तैयार किया गया जैसा कि पहले6वर्णित है। हमने स्टिंग-37 सेल लाइन रिपोर्टर परख का उपयोग करके दोनों सेल संस्कृतियों के सुपरनैंट में उत्पादित सभी प्रकार के IFN को मापा, जैसा कि पहले17 वर्णित है और पता चला है कि हम केवल अलग टीएमसी में IFN के स्तर को माप सकते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: टीएमसी ने उत्तेजना पर साइटोकिन्स का उत्पादन किया। (A)शुद्ध और अलग टीएमसीएस (नीला) और पीबीएमसीएस (ग्रीन) R848 (5 μg/mL) के साथ रातोंरात उत्तेजित हो गए । सुपरनेटैंट को उपयोग तक वापस लाया गया और जमे हुए। एक मनका आधारित इम्यूनोसे को एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके एक साथ कई घुलनशील साइटोकिन्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। रेखांकन प्रत्येक मापा साइटोकिन के मिलीलीटर प्रति पिकोग्राम में एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं। गुना बढ़ जाती है रेखांकन पर लाल रंग में एनोटेट कर रहे हैं। मान-व्हिटनी यू टेस्ट । (ख)टॉन्सिल (ब्लू) और टॉन्सिलर टिश्यू ब्लॉक (ऑरेंज) से शुद्ध और अलग-थलग पड़े टीएमसी को इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के साथ 24 घंटे के लिए उत्तेजित किया गया । एक स्टिंग-३७ रिपोर्टर सेल लाइन परख का इस्तेमाल सुपरनेट में IFN उत्पादन को मापने के लिए किया गया था । बॉक्स और मूंछ भूखंडों के साथ औसत ± न्यूनतम अधिकतम करने के लिए। मान-व्हिटनी यू टेस्ट । पी एंड एलटी; 0.001, **पी एंड एलटी; 0.01, *पी एंड एलटी; 0.05। एनएस = गैर उत्तेजित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अंत में, हमने टीएमसीएस की व्यवहार्यता का परीक्षण किया। सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए कई तकनीकें उपलब्ध हैं। यहां, हम एक ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख, एक आसान और जल्दी दो कदम परख का इस्तेमाल किया । जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, हमने स्पष्ट रूप से टीएमसी में कंपाउंड 1 द्वारा प्रेरित साइटोटॉक्सीसिटी का पता लगाया,जो पीबीएमसी के लिए विषाक्त नहीं था। इस प्रकार, टीएमसी ने परीक्षण की गई दवा के प्रति उच्च संवेदनशीलता दिखाई।

Figure 3
चित्रा 3: यौगिक 1 TMCs के लिए विषाक्त था । शुद्ध और अलग टीएमसी और पीबीएमसी को 1 घंटे के लिए विभिन्न सांद्रता पर यौगिक 1 (C1) के साथ पूर्वनियोजित किया गया था और फिर R848 (5 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ रातोंरात उत्तेजित किया गया था। सुपरनेटेंट को वापस लाया गया, सेल व्यवहार्यता समाधान के 60 माइक्रोन जोड़े गए, और ल्यूमिनेसेंस मापा गया। * C1 की तुलना एनएस से करने वाले सांख्यिकीय विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है। बॉक्स और मूंछ भूखंडों के साथ औसत ± न्यूनतम अधिकतम करने के लिए। डन के पोस्ट हॉक करेक्शन के साथ क्रुस्कल-वालिस टेस्ट । पी एंड एलटी; 0.0001, ***पी एंड एलटी; 0.001, **पी एंड एलटी; 0.01, *पी एंड एलटी; 0.05। एनएस = गैर उत्तेजित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मानव टॉन्सिल म्यूकोसल इंटरफेस पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत और शारीरिक पूर्व वीवो मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि वे एक माध्यमिक लिम्फोइड अंग की भूमिका की नकल करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि टीएमसी की सेलुलर संरचना पीबीएमसी के समान है और इसमें सभी प्रमुख सेल आबादी शामिल है, हालांकि उनका प्रतिशत रक्त(चित्रा 1)से पीबीएमसी से अलग हो सकता है। अतिरिक्त आबादी भी पाई जा सकती है, क्योंकि सभी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं ऊतकों (म्यूकोसा या माध्यमिक लिम्फाइड अंगों) में शुरू की जाती हैं न कि रक्त में।

मानव ऊतक के उपयोग के साथ-साथ सेल संस्कृति या रक्त कोशिकाओं के उपयोग के प्रत्येक के अपने फायदे हैं। हालांकि, अध्ययन साइटोकिन स्राव और सेल सक्रियण के लिए, ऊतक एक्सप्लांट सबसे अच्छा मॉडल नहीं थे। वास्तव में, हम ऊतक एक्सप्लांट(चित्रा 2बी)के सुपरनैंट में किसी भी आईएफएन उत्पादन का पता नहीं लगा सके। हम अनुमान लगाते हैं कि इसका सीधे आसपास की कोशिकाओं द्वारा सेवन किया जाता है। दूसरी ओर, रक्त कोशिकाओं की उत्तेजना (पीबीएमसी) संक्रमण के लिए प्राथमिक प्रतिक्रिया की नकल कर सकती है लेकिन ऊतकों में क्या हो रहा है, जहां अधिकांश साइटोकिन्स का उत्पादन किया जाता है और जहां वायरस दोहराते हैं, उसकी नकल नहीं करते हैं। इसलिए, हम एक माध्यमिक लिम्फोइड ऊतक, टॉन्सिल से उत्पन्न कोशिकाओं को अलग और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करते हैं। हमने स्वस्थ मानव टॉन्सिल से टीएमसी को शुद्ध किया, जो हमें उत्तेजना पर प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण की जांच करने की अनुमति देता है। हालांकि, इस मॉडल की सीमाओं में से एक यह है कि टीएमसी TLR7/8 उत्तेजना पर पीबीएमसीएस पूर्व वीवो के रूप में कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन नहीं करते हैं, हालांकि प्रमुख एंटीवायरल साइटोकिन का स्तर दोनों संस्कृतियों में समान है।

टीएमसी बनाम पीबीएमसी पर यौगिक विषाक्तता के अध्ययन से पता चला है कि टीएमसी विषाक्त दवा(चित्रा 3)के प्रति अधिक संवेदनशील हैं। इस प्रकार, नई दवाओं और भविष्य के उपचार की विषाक्तता ऊतकों से कोशिकाओं में परीक्षण किया जाना चाहिए और न केवल सेल लाइनों, पीबीएमसी, या ऊतक explants पर । इसलिए, दवा परीक्षण के लिए टीएमसी का उपयोग वर्णित विधि का भविष्य का अनुप्रयोग प्रतीत होता है।

वयस्कों या बच्चों से टॉन्सिल प्राप्त किए जा सकते हैं और वर्णित के रूप में संसाधित किए जा सकते हैं। हालांकि, हम दो मुख्य कारणों से बच्चों से टॉन्सिल प्राप्त करने की सलाह देते हैं: 1) बच्चों के टॉन्सिल में वयस्कों के20की तुलना में अधिक कोशिकाएं होती हैं। दरअसल, टॉन्सिलर हाइपरट्रॉफी बच्चों में विशेष रूप से आम है, क्योंकि वे बचपन के वायरस से लड़ते हैं। इस प्रकार, ये बड़े टॉन्सिल ऑब्सट्रक्टिव टॉन्सिल बन सकते हैं और स्लीप एपनिया13जैसी जटिलताओं से बचने के लिए आंशिक टॉन्सिलेक्टोमी द्वारा हटाने की आवश्यकता है। 2) क्योंकि वयस्कों के टॉन्सिल आमतौर पर कान-नाक-गले (ईएनटी) संक्रमण के कई एपिसोड के बाद हटा दिए जाते हैं, ये टॉन्सिल कम भोले होते हैं और इसमें कम कोशिकाएं होती हैं।

हटाने की सर्जरी के बाद जितनी जल्दी हो सके टॉन्सिल पर काम करना महत्वपूर्ण है, आदर्श रूप से और संग्रह के बाद एलटी;3 एच। दरअसल, हटाने के ठीक बाद और विच्छेदन तक, प्रत्येक पक्ष से टॉन्सिल को पीबीएस के लगभग 20 एमएल युक्त 50 एमएल बाँझ शीशी में एक साथ रखा जाता है, ताकि वे पूरी तरह से जलमग्न हो जाएं।

इंटरडोनर परिवर्तनशीलता प्रजनन क्षमता के लिए एक प्रमुख मुद्दे का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। दरअसल, दानदाताओं के बीच सेलुलर संरचना में परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण हो सकती है। हमारे प्रोटोकॉल, TMCs और नहीं ऊतक explants का उपयोग कर, इस परिवर्तनशीलता को सीमित करता है क्योंकि पूरे टॉन्सिल से कोशिकाओं को चढ़ाया जा रहा है और संस्कृति में रखा जा रहा से पहले मिलाया जाता है, जबकि ऊतक explants सेलुलर संरचना में इंट्राडोनर परिवर्तनशीलता लाने क्योंकि टुकड़े एक ही नमूने के भीतर विभिंन क्षेत्रों से आते हैं । आंशिक टॉन्सिलेक्टॉमी केवल नॉनइनफ्लेम्ड टॉन्सिल पर किया जा सकता है, जो रोगियों के बीच भड़काऊ स्थिति परिवर्तनशीलता को सीमित करता है। हम विभिन्न दिनों में शल्य चिकित्सा से निकाले गए टॉन्सिल एकत्र करने की भी सलाह देते हैं। हमने स्पष्ट रूप से देखा है कि इंटर-सर्जन और इंटर-डे वेरिबिलिटी इंटरडोनर परिवर्तनशीलता (डेटा नहीं दिखाए गए) से अधिक हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे सुर ले सिडा एट लेस हेपेटिट्स एएनआरएस (जे-पी) द्वारा समर्थित किया गया था। एच) प्रयोगों और नायब फैलोशिप (AAP २०१७ १६६) के लिए । एन. एस फैलोशिप के लिए ANRS से समर्थन स्वीकार (AAP २०१६ 1), फैलोशिप के लिए यूरोपीय आणविक जीव विज्ञान संगठन EMBO (LT ८३४ २०१७), स्टार्टअप फंडिंग प्रोग्राम "बॉस्टीन" उल्म विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय (LSBN.0147) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 meshes steel grid - 1910 µm Dutscher 198586 To put in the cell strainer Cellector
60 meshes steel grid - 230 µm Dutscher 198591 To put in the cell strainer Cellector
70 µm white ClearLine cell strainers Dutscher 141379C
Anios Excell D detergent Dutscher 59852 Detergent
Antibiotic solution, 100x Thermo Fisher 15140122 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media
BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Biosciences 352063 FACS Tubes
Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter Dutscher 198585
CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay Promega G7572 Viability assay
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Conical tubes Falcon 50 mL Dutscher 352070
Curved tweezers Dutscher 711200
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without calcium and magnesium
EnVision PerkinElmer Measures the luminescence
Fetal Bovine Serum (FBS) To add to culture media
Fluorescence labeles antibodies See Table 1
Glass Pestle Dutscher 198599
Hepes (1 M) Thermo Fisher 15630056 Use at 20 mM
Incubator
LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel BioLegend 740390 Bead-based immunoassay
Lymphoprep StemCell 7801 Density gradient medium
Mr. Frosty container Thermo Fisher 5100-0001 Slow freezing container
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Fisher 28908
Resiquimod (R848) InvivoGen tlrl-r848 TLR7/8 agonist
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) Dutscher 330009
Surgical blade sterile N°23 Dutscher 132523
UltraComp eBeads Compensation Beads Thermo Fisher 01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 To make wash buffer in PBS

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References

  1. Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
  2. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  3. Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
  4. Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
  5. Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
  6. Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
  7. Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
  8. Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
  9. Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
  10. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
  11. Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
  12. Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
  13. Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
  14. Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
  15. Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
  16. Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
  17. Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
  18. Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
  19. Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
  20. Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतक टॉन्सिल टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर सेल प्रतिरक्षा पूर्व वीवो सेल कल्चर साइटोकिन होस्ट-रोगजनक इंटरैक्शन
एक मानव म्यूकोसल लिम्फोइड ऊतक में पूर्व वीवो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव
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Smith, N., Bekaddour, N., Leboulanger, N., Richard, Y., Herbeuval, J. P. Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (160), e60914, doi:10.3791/60914 (2020).

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