Summary
No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares de humanos saudáveis submetidos a amidaltomia cirúrgica parcial para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas.
Abstract
Estudar células isoladas de tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) permite a compreensão da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa, pois podem modelar interações hospedeira-patógeno no tecido. Embora as células isoladas derivadas dos tecidos tenham sido o primeiro modelo de cultura celular, seu uso foi negligenciado porque o tecido pode ser difícil de obter. No presente protocolo, explicamos como processar e cultivar facilmente células mononucleares tonsilares (TMCs) a partir de amígdalas humanas saudáveis para estudar respostas imunes inatas após a ativação, imitando infecção viral em tecidos mucosas. O isolamento das TMCs das amígdalas é rápido, porque as amígdalas mal têm epitélio e produzem até bilhões de todos os principais tipos de células imunes. Este método permite a detecção da produção de citocinas utilizando várias técnicas, incluindo imunoensaio, qPCR, microscopia, citometria de fluxo, etc., semelhante ao uso de células mononucleares periféricas (PBMCs) a partir do sangue. Além disso, os TMCs mostram maior sensibilidade aos testes de drogas do que os PBMCs, que precisam ser considerados para futuros ensaios de toxicidade. Assim, as culturas ex vivo TMCs são um modelo mucosa fácil e acessível.
Introduction
Os estudos sobre órgãos humanos são restritos devido à acessibilidade, bem como razões éticas óbvias. No entanto, eles são essenciais para entender completamente a complexidade da biologia humana. Culturas de células isoladas (culturas primárias ou linhas celulares) são um sistema padrão em estudos de biologia celular devido à sua disponibilidade. Embora culturas celulares isoladas tenham permitido descobertas extraordinárias, o uso de linhas celulares tem se tornado um escrutínio mais aprofundado porque elas não imitam totalmente a biologia de órgãos in vivo. No entanto, a cultura de células tridimensionais ou explantas teciduais é altamente complexa4,,5,6. De fato, um pedaço de tecido ou órgão é altamente heterogênios porque sua composição celular difere dependendo da localização no tecido. Assim, o uso de blocos teciduais requer a análise de muitas réplicas técnicas e biológicas, levando à necessidade de um grande número de doadores ou pacientes.
Os tecidos linfoides associados à mucosa (MALT) são estruturalmente semelhantes aos linfonodos, mas têm funções únicas, pois seu principal papel é regular a imunidade mucosa7. Ao contrário dos linfonodos, que geralmente estão localizados a alguma distância dos tecidos, o MALT geralmente está localizado imediatamente abaixo do epitélio do tecido mucosal. Histologicamente, eles são compostos principalmente de altas concentrações de células B e T, mas também células que apresentam antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Malt constituem cerca de 50% do tecido linfoide no corpo humano. Malt são subdivididos em nove grupos, dependendo de sua localização: GALT (intestino),BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntivista), LALT (laringe-), SALT (pele-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) e D-MALT (difundido). O O-MALT é composto principalmente pelas amígdalas do anel de amígdalas de Waldeyer e é o MALT8,,9. De fato, as amígdalas localizadas na orofaringe constituem a principal barreira que protege os tratos digestivos e respiratórios dos (potenciais) microrganismos invasivos10. Além disso, as amígdalas são cobertas por um epitélio escânio estratificado estratificado, apoiado por uma cápsula de tecido conjuntivo contendo vasos sanguíneos, nervos e linfáticos, proporcionando fácil acesso às células imunes11,,12. Além disso, a amigdaxia, o ato cirúrgico de remoção de amígdalas, é um procedimento comum realizado em crianças com respiração desordenada do sono, tornando as amígdalas um tecido facilmente disponível13 em ambientes fisiológicos.
As amígdalas permitem o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. De fato, na infecção pelo HIV, como as amígdalas são compostas por uma alta concentração de células imunes, elas são o principal alvo da replicação viral, mas também produzem uma grande quantidade de citocinas que não são detectadas na circulação14,15. Em estados estáveis, populações raras de células inatas estão presentes em vários tecidos mucosas, incluindo as amígdalas, mas estão essencialmente ausentes do sangue.
Assim, as células mononucleares de amígdalas (TMCs) são um modelo mais relevante e complexo do que os PBMCs e podem responder a perguntas mais profundas. Por outro lado, o uso de explants teciduais pode ser complexo e nem sempre relevante para estudos imunológicos inatas. Assim, estabelecemos um modelo para estudar a ativação imunológica mucosa utilizando TMCs16. Aqui, descrevemos um método para o isolamento eficiente dos TMCs de amígdalas humanas frescas. Este método permite a recuperação de um grande número de células imunes, mantendo sua integridade para estudos ex vivo.
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Protocol
Os espécimes não são coletados especificamente para fins de pesquisa e o estudo não é considerado invasivo. No entanto, a coleta de amígdalas humanas requer aprovação ética das autoridades locais relevantes. No nosso caso, foi aprovado pelo Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Além disso, solicita-se o consentimento de cada paciente ou representante legal para obter dados pessoais dos doadores (por exemplo, sexo, idade, histórico de infecções por ENT) que possam ajudar a interpretar resultados experimentais.
1. Manuseio do tecido tonsilar humano
- Coloque amígdalas de cada doador em um frasco estéril de 50 mL contendo 25 mL PBS 1x e transporte à temperatura ambiente (RT) para o laboratório de acordo com as recomendações da autoridade (use três níveis de proteção: frascos, uma caixa de segurança e um saco).
NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado em laboratório de segurança biológica nível 2. Todos os espécimes humanos devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos. -
Limpe todas as ferramentas entre cada uso.
- Após o uso, desmonte o coador celular e mantenha com todos os outros instrumentos (por exemplo, pilão, fórceps) em um banho contendo uma solução de detergente (1/10 detergente de volume em H2O) durante a noite.
- Escove cada utensílio para remover o tecido e lave com água limpa.
- Seque bem todas as peças, depois prepare o coador de células (85 mL, 37 mm de diâmetro) colocando uma grade de aço de 60 malha em cima de uma grade de aço de 10 malha e feche firmemente o anel.
- Coloque todas as ferramentas em sacos estéreis e autoclave.
2. Dissecção do Tecido Tonsilár humano e Isolamento das Células Mononucleares Tonsilares (TMCs)
- Coloque o coador de células em um prato de cultura celular de 150 x25 mm 2 (SPL150) e todos os instrumentos em outro SPL150 para mantê-los estéreis.
- Transfira as amígdalas do frasco para o coador celular usando fórceps estéreis. Despeje também toda a PBS, que contém algumas células que egressaram as amígdalas. Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade.
NOTA: O tecido deve ser imerso o tempo todo para evitar a proficação. - Remova tecido cauterizado, ensanguentado e miomado usando fórceps e um bisturi.
NOTA: Amígdalas retiradas de crianças não precisam dessa etapa. - Corte os tecidos em pequenos pedaços de menos de 0,5 cm de diâmetro usando o bisturi e a pinça curva. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.
- Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular e raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.
- Uma vez que todos os tecidos tenham sido espremidos através da grade, use uma pipeta de 10 mL para transferir toda a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez.
- Transfira a suspensão celular com uma pipeta de 10 mL para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS 1x. Deixe a suspensão da cela descansar por 5 minutos no RT no banco. Esta etapa permite a precipitação e aglomeração do estroma restante, células mortas e qualquer DNA liberado, e facilitará o próximo passo.
- Coloque uma peneira estéril de 70 μm em cima de um novo frasco de 50 mL (retire cuidadosamente do envelope) e transfira suavemente a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Não misture a suspensão, pois uma pelota está frequentemente presente. Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta estéril de 1 mL para arranhar as células da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário.
- Centrifugar as células a 250 x g por 10 min a 4 °C.
- Descarte o supernaspe e resuspenque a pelota misturando suavemente o frasco, em seguida, resuspend as células em 35 mL de PBS.
- Em um novo frasco, coloque uma nova peneira de 70 μm por cima e transfira a suspensão da célula para ele com uma pipeta de 10 mL. Se a peneira estiver entupida, utilize a técnica detalhada na etapa 2.7.
3. Isolamento dos TMCs por Gradiente de Densidade Celular
NOTA: Os TMCs podem ser usados após a etapa 2.10. No entanto, para obter uma solução celular mais clara e remover outros detritos celulares e quaisquer células vermelhas, é aconselhável realizar um isolamento gradiente de densidade celular das células mononucleares.
- Adicione 15 mL do meio gradiente de densidade (d = 1,076 g/mL) em um novo frasco de 50 mL. Despeje a solução TMCs em cima do meio gradiente de densidade, tendo o cuidado de minimizar a mistura da suspensão com o meio gradiente de densidade.
- Centrifugar a solução a 1.000 x g por 30 min no RT com aceleração e quebra.
- Remova com uma pipeta de 10 mL e descarte a camada superior (contendo principalmente PBS 1x) sem perturbar a interface entre os TMCs e o meio de gradiente de densidade.
NOTA: Os TMCs contêm um baixo número de eritrócitos, portanto a solução é clara. Assim, a interface entre a solução de TMCs em PBS e o meio gradiente de densidade pode ser difícil de visualizar. Assim, as células podem ser resuspended em RPMI 1640 suplementado com 20 mM HEPES (sem FBS) antes que o gradiente de densidade seja realizado. - Remova os TMCs com uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e coloque em um novo frasco de 50 mL.
- Lave as células adicionando 50 mL de PBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 2 mM EDTA e centrífugas do tubo a 250 x g por 10 min a 4 °C para remover as plaquetas restantes.
- Repita o passo 3.5, mas centrífugue o tubo a 400 x g por 10 min a 4 °C.
- Prepare o meio cultura (R10) suplementando rpmi 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 mM L-glutamina e a solução antibiótica (penicillium de 100 U/mL e 100 μg/mL estreptomicina).
- Resuspenque os TMCs em 10 mL de R10 e conte as células. Em média, esta técnica rende 5 x 108-2 x 109 TMCs por par de amígdalas. As células agora podem ser usadas para investigações como PBMCs de sangue inteiro (por exemplo, purificação de tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo, RT-qPCR, congelamento, etc.).
-
Se necessário, congele as células para uso adicional usando técnicas padrão para congelamento celular primário.
- Conte o número de células.
- Centrifugar as células e remover o supernante. Dissolva a pelota em 100% FBS suficientes para uma concentração final de 1 x 108 células/mL, em seguida, adicione o mesmo volume de uma solução de 80% FBS + 20% DMSO. As células estarão em 57 x 107 células/mL. Esta etapa deve ser feita a 4 °C e a solução FBS e DMSO deve ser mantida a 4 °C antes de usar.
- Distribua 1 mL da solução celular em criotubos e coloque-os em um recipiente de congelamento lento que esteve a 4 °C durante a noite para controlar a taxa de congelamento celular. Coloque-o a -80 °C.
- Para descongelar as células, coloque os criovias em um banho quente a 37 °C por alguns segundos com agitação constante. Assim que as células começarem a descongelar, transfira-as para 49 mL de R10 e centrífuga para remover o DMSO. Conte as células e use-as como PBMCs.
NOTA: Embora o congelamento e o descongelamento dos TMCs removam os detritos, também danificará alguns tipos de células raras. Se aglomerados ou detritos estiverem presentes após o descongelamento, é melhor passar a suspensão da célula através de uma peneira estéril de 70 μm antes de usá-la.
4. Fenotipagem de TMCs por Citometria de Fluxo
- Recupere 5 x 106 células da solução anterior para cada painel de mistura de anticorpos que precisa ser testado e coloque em um tubo de citometria de 5 mL. Recupere 1 x 106 células para o controle não manchado.
- Lave as células em PBS e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspensá-los em 500 μL de PBS (1 x 106 células/mL) e incubar com uma mancha de viabilidade por 30 min a 4 °C no escuro.
- Adicione 5 μL de calor humano inativado ab soro por 100 μL de suspensão celular e incubar por 15 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células em PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Resuspenque os TMCs em 500 μL de Wash Buffer contendo os anticorpos conforme detalhado na Tabela 1. Incubar as células por 30 min a 4 °C no escuro.
- Lave as células em Wash Buffer e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Resuspentive os TMCs em 500 μL de PBS contendo 0,5% de paraformaldeído (PFA). Mantenha-se no escuro a 4 °C até a aquisição por citometria de fluxo.
NOTA: PfA é perigoso. Use uma solução comercial pronta para uso para preparar a solução PFA de 0,5%.
| Anticorpo | Clone | Fluorochrome | Empresa |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Scientific | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Azul do Pacífico | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | FITC | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiociências |
Tabela 1: Lista de anticorpos para caracterização celular por citometria de fluxo.
5. Exemplo de Ativação de TMCs e Medição da Produção de Citocinas
- Diluir os TMCs em meio R10 para obter uma concentração de 2 x 106 células/mL.
- Distribua 400.000 TMCs em 200 μL de R10 em uma placa inferior bem redonda de 96.
- Para ativar as células, adicione 5 μg/mL do resiquimod agonista TLR7/8 (R848) durante a noite.
- Centrifugar as placas e recuperar o supernatante dos TMCs e congelá-lo para análise suplementar. A produção de citocinas será avaliada usando imunoensatórios à base de contas para quantificar várias citocinas solúveis simultaneamente usando um citômetro de fluxo seguindo o protocolo do fabricante.
- Avalie a viabilidade das células usando um ensaio de viabilidade celular luminescente seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, adicione 60 μL de solução de viabilidade celular aos poços e meça luminescência dentro de 10 min (aquisição para 1 s/well).
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Representative Results
Primeiro caracterizamos o perfil imunológico das células presentes na cultura e analisamos a quantidade de TMCs. Nós fenítipamos os TMCs de amígdalas com citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 1,todos os principais tipos de células imunes presentes em PBMCs do sangue foram representadores nos TMCs das amígdalas. No entanto, nos TMCs a frequência de todos os tipos de células, exceto as células B, foram menores do que em PBMCs.
Figura 1: Fenotipagem de TMCs em amígdalas. Os TMCs de doadores saudáveis foram obtidos após dissecção do tecido tonsilar humano e isolamento das células. (A) As células foram manchadas, e os dados foram adquiridos por citometria de fluxo. Os dados representam um experimento representativo. (B) A tabela resume a porcentagem de cada tipo de célula em TMCs vivos em amígdalas de seis doadores saudáveis diferentes e compara cada um com a porcentagem de cada tipo de célula em PBMCs de sangue, conforme definido na literatura18,19. Os dados são mostrados como a porcentagem de células vivas SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Testamos então as respostas imunológicas dos TMCs. Uma maneira de reproduzir a ativação de uma célula contra um patógeno é estimular os sensores imunológicos inatos da família Toll-Like Receptores (TLRs). Os TLRs estão presentes principalmente em monócitos/macrófagos, todos os subtipos de células dendríticas (DC), células dendríticas plasmáticas (pDCs), e também em células B. Neste exemplo, estudamos TLR7 e TLR8, pois são especializados em respostas antivirais e a maioria dos casos de amigdalite (ou seja, infecções por amígdalas) são causados por uma infecção viral. Assim, os TMCs de amígdalas (gráfico em azul) de sete doadores saudáveis foram estimulados durante a noite com o TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Como em PBMCs (gráfico em verde), a ativação através da sinalização TLR7/8 desencadeou a produção de interferons tipo I (IFN) e citocinas pró-inflamatórias. Na verdade, a citocina mais produzida em TMCs após a ativação foi ifnα, um membro da família ifn tipo I que está principalmente envolvido na imunidade inata contra infecção viral e é produzido principalmente pelos pDCs. Todas as citocinas testadas, exceto IFN2/3 e IL-8, foram produzidas por TMCs, embora em níveis mais baixos do que em PBMCs. Curiosamente, algumas citocinas (principalmente IL-8, mas também IL-6, IL-10 e TNFα) estavam presentes em maior quantidade em níveis basais. Além disso, comparamos a citocina produzida por TMCs isolados ou por blocos de tecido ambíluo preparados como descrito anteriormente6. Medimos todos os tipos de IFN produzidos no supernasciente de ambas as culturas celulares usando o ensaio do repórter de linha celular STING-37, descrito anteriormente17 e mostramos que só poderíamos medir os níveis de IFN nos TMCs isolados.
Figura 2: Os TMCs produziram citocinas após a estimulação. (A) TMCs purificados e isolados (azul) e PBMCs (verde) foram estimulados durante a noite com R848 (5 μg/mL). Os supernantes foram recuperados e congelados até o uso. Um imunoensaio à base de contas foi realizado para quantificar várias citocinas solúveis simultaneamente usando um citômetro de fluxo. Os gráficos representam a concentração em picogramas por mililitro de cada citocina medida. Os aumentos da dobra estão anotados em vermelho nos gráficos. Teste de Mann-Whitney U. (B) Os TMCs purificados e isolados dos blocos de amígdalas (azul) e tonsilar (laranja) foram estimulados por 24 h com o vírus influenza A (IAV). Um ensaio da linha celular repórter STING-37 foi usado para medir a produção de IFN no supernante. Parcelas de caixa e bigode com média ± mínima ao máximo. Teste de Mann-Whitney U. P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = não estimulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, testamos a viabilidade dos TMCs. Várias técnicas estão disponíveis para medir a viabilidade celular. Aqui, usamos um ensaio de viabilidade celular luminescente, um ensaio fácil e rápido de duas etapas. Como mostrado na Figura 3,detectamos claramente a citotoxicidade induzida pelo composto 1 em TMCs, que não era tóxica para os PBMCs. Assim, os TMCs apresentaram maior sensibilidade à droga testada.
Figura 3: O composto 1 era tóxico para os TMCs. TMCs purificados e isolados e PBMCs foram pré-insubados com composto 1 (C1) em várias concentrações por 1 h e depois estimulados durante a noite com R848 (5 μg/mL). Os supernantes foram recuperados, 60 μL de solução de viabilidade celular foram adicionados, e a luminescência foi medida. O * representa a análise estatística comparando C1 com NS. Parcelas de caixa e bigode com média ± mínima ao máximo. Teste de Kruskal-Wallis com a correção pós-hoc de Dunn. P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05. NS = não estimulado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As amígdalas humanas representam um modelo ex vivo integrativo e fisiológico para estudar respostas imunes inatas na interface mucosa, pois imitam o papel de um órgão linfoide secundário. Curiosamente, a composição celular dos TMCs é semelhante aos PBMCs e inclui todas as populações de células principais, embora sua porcentagem possa ser diferente das PBMCs do sangue(Figura 1). Populações adicionais também podem ser encontradas, pois todas as respostas imunológicas são iniciadas em tecidos (mucosa ou órgãos linfoides secundários) e não no sangue.
O uso de explantas de tecido humano, bem como o uso da cultura celular ou células sanguíneas cada um tem suas vantagens. No entanto, para o estudo da secreção de citocinas e ativação celular, as explantas teciduais não foram o melhor modelo. Na verdade, não foi possível detectar qualquer produção de IFN no sobrenasce de plantas teciduais(Figura 2B). Especulamos que ele é diretamente consumido pelas células circundantes. Por outro lado, a estimulação de células sanguíneas (PBMCs) pode imitar a resposta primária à infecção, mas não imita o que está acontecendo nos tecidos, onde a maioria das citocinas são produzidas e onde os vírus se replicam. Por isso, estabelecemos um protocolo para isolar e purificar células decorrentes de um tecido linfoide secundário, a amígdala. Purificamos TMCs de amígdalas humanas saudáveis, o que nos permite investigar a ativação de células imunes após a estimulação. No entanto, uma das limitações deste modelo é que os TMCs não produzem tantas citocinas pró-inflamatórias quanto os PBMCs ex vivo sobre a estimulação TLR7/8, embora os níveis de IFNα, a principal citocina antiviral, seja semelhante em ambas as culturas.
O estudo da toxicidade composta em TMCs versus PBMCs revelou que os TMCs são mais sensíveis a uma droga tóxica(Figura 3). Assim, a toxicidade de novas drogas e tratamentos futuros deve ser testada em células de tecidos e não apenas em linhas celulares, PBMCs ou explants teciduais. Portanto, o uso de TMCs para testes de drogas parece ser uma aplicação futura do método descrito.
Amígdalas de adultos ou crianças podem ser obtidas e processadas conforme descrito. No entanto, recomendamos a obtenção de amígdalas de crianças por dois motivos principais: 1) As amígdalas infantis contêm mais células do que as20 dosadultos . De fato, a hipertrofia amíldal é particularmente comum em crianças, porque eles combatem mais vírus infantis. Assim, essas amígdalas grandes podem se tornar amígdalas obstrutivas e precisam ser removidas por uma amificóscetomia parcial para evitar complicações como a apneia do sono13; 2) Como as amígdalas dos adultos geralmente são removidas após vários episódios de infecções por nariz-nariz-nariz -nariz (ENT), essas amígdalas são menos ingênuas e contêm menos células.
É fundamental trabalhar as amígdalas o mais rápido possível após a cirurgia de remoção, idealmente <3h após a coleta. De fato, logo após a remoção e até a dissecação, as amígdalas de cada lado são mantidas juntas em um frasco estéril de 50 mL contendo cerca de 20 mL de PBS, de modo que fiquem totalmente submersas.
A variabilidade interdonor pode representar um grande problema para a reprodutibilidade. De fato, a variabilidade na composição celular entre os doadores pode ser significativa. Nosso protocolo, utilizando TMCs e não explants teciduais, limita essa variabilidade porque as células de todas as amígdalas são misturadas antes de serem emplacados e colocados na cultura, enquanto explantas teciduais trazem variabilidade intradonor na composição celular porque as peças vêm de diferentes áreas dentro do mesmo espécime. A amificilectomia parcial só pode ser realizada em amígdalas não inflamatórias, o que limita a variabilidade do estado inflamatório entre os pacientes. Também recomendamos a coleta de amígdalas removidas cirurgicamente em dias diferentes. Notamos claramente que as variabilidades inter-cirurgiões e inter-dia são maiores do que a variabilidade interdonor (dados não mostrados).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para os experimentos e bolsa n.b. (AAP 2017 166). A N.S. reconhece o apoio da ANRS para a bolsa (AAP 2016 1), da Organização Europeia de Biologia Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), do programa de financiamento de startups "Baustein" da Faculdade de Medicina da Universidade de Ulm (LSBN.0147) e do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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