Summary
В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток здоровых людей, проходящих частичную хирургическую тонзиллектомию, изучать врожденные иммунные реакции при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях.
Abstract
Изучение изолированных клеток из слизистой оболочки связанных лимфоидных тканей (MALT) позволяет понять иммунный ответ клеток в патологиях с участием слизистого иммунитета, потому что они могут моделировать принимающих патогенных взаимодействий в тканях. В то время как изолированные клетки, полученные из тканей, были первой моделью клеточной культуры, их использование было пренебречь, потому что ткани могут быть трудно получить. В настоящем протоколе мы объясняем, как легко обрабатывать и культура тонзиллярных моноядерных клеток (ТМК) из здоровых человеческих миндалин для изучения врожденных иммунных реакций при активации, имитируя вирусную инфекцию в слизистых тканях. Изоляция ТМК от миндалин происходит быстро, потому что миндалины едва имеют эпителия и дают до миллиардов всех основных типов иммунных клеток. Этот метод позволяет выявлять выработку цитокинов с использованием нескольких методов, в том числе иммуноанализа, кЗКР, микроскопии, цитометрии потока и т.д., подобно использованию периферических моноядерных клеток (ПМБК) из крови. Кроме того, ТМК показывают более высокую чувствительность к тестированию на наркотики, чем PBMCs, которые необходимо учитывать для будущих анализов токсичности. Таким образом, ex vivo TMCs культур легко и доступной слизистой модели.
Introduction
Исследования на человеческих органах ограничены из-за доступности, а также очевидных этических причин. Тем не менее, они имеют важное значение для полного понимания сложности человеческой биологии. Культуры изолированных клеток (первичные культуры или клеточные линии) являются стандартной системой в исследованиях клеточной биологии из-за их наличия. В то время как изолированные клеточные культуры позволили выдающиеся открытия, использование клеточных линий пришло на более пристальное внимание, потому что они не полностью имитируют биологию органов vivo. Тем не менее, культура трехмерных клеток или тканей explants является весьма сложным4,,5,6. Действительно, часть ткани или органа очень неоднородна, потому что его клеточный состав отличается в зависимости от локализации в ткани. Таким образом, использование тканевых блоков требует анализа многих технических и биологических репликаций, что приводит к необходимости большого числа доноров или пациентов.
Связанные с слизистой оболочкой лимфоидные ткани (MALT) структурно похожи на лимфатические узлы, но имеют уникальные функции, потому что их основная роль заключается в регулировании слизистого иммунитета7. В отличие от лимфатических узлов, которые обычно расположены на некотором расстоянии от тканей, MALT, как правило, расположены непосредственно под эпителием слизистой оболочки ткани. Гистологически, они в основном состоят из высоких концентраций В и Т-клеток, но и антиген-представляющих клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. MALT составляют около 50% лимфоидной ткани в организме человека. MALT подразделяются на девять групп в зависимости от их местонахождения: GALT (кишка-), BALT (бронхус-), NALT (носовой), CALT (конъюнктивальный), LALT (гортань-), SALT (кожа-), VALT (вульво-), O-MALT (организовано) и D-MALT (диффенд). O-MALT в основном состоит из миндалин тонзиллярного кольца Вальдейера и является наиболее доступным MALT8,9. Действительно, миндалины, расположенные в ротоглоте, являются основным барьером, защищающим пищеварительные и дыхательные пути от (потенциальных) инвазивных микроорганизмов10. Кроме того, миндалины покрыты тонкой стратифицированной плоскоклеточной некератинирующей эпителием, поддерживаемой капсулой соединительной ткани, содержащей кровеносные сосуды, нервы и лимфатические, обеспечивая легкий доступ к иммунным клеткам11,12. Кроме того, тонзиллектомия, хирургический акт удаления миндалин, является общей процедурой, выполняемой на детей, имеющих расстройство сна дыхание, что делает миндалины легко доступны ткани13 в физиологических условиях.
Миндалины позволяют изучать иммунный клеточный ответ при патологиях, связанных с слизистым иммунитетом. Действительно, при ВИЧ-инфекции, поскольку миндалины состоят из высокой концентрации иммунных клеток, они являются основной мишенью репликации вируса, но также производят большое количество цитокинов, которые не обнаружены в циркуляции14,15. В устойчивых состояниях редкие популяции врожденных клеток присутствуют в различных слизистых тканях, включая миндалины, но по существу отсутствуют в крови.
Таким образом, моноядерные клетки из миндалин (ТМК) являются более актуальной и сложной моделью, чем ПБМТ, и могут отвечать на более глубокие вопросы. С другой стороны, использование тканей эксплантов может быть сложным и не всегда имеет отношение к врожденным иммунным исследованиям. Таким образом, мы создали модель для изучения слизистой иммунной активации с помощью TMCs16. Здесь мы описываем метод эффективной изоляции ТМК от свежих человеческих миндалин. Этот метод позволяет восстановить большое количество иммунных клеток, сохраняя при этом их целостность для ex vivo исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы не собираются специально для исследовательских целей, и исследование не считается инвазивным. Однако сбор человеческих миндалин требует этического одобрения со стороны местных соответствующих органов. В нашем случае он был одобрен Комиссаром защиты персон (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Кроме того, требуется согласие каждого пациента или законного представителя для получения персональных данных доноров (например, пола, возраста, истории ЛОР-инфекций), которые могут помочь интерпретировать экспериментальные результаты.
1. Обработка ткани человека Tonsillar
- Положите миндалины от каждого донора в один стерильный флакон 50 мл, содержащий 25 м/с PBS 1x и транспортируют при комнатной температуре (RT) в лабораторию в соответствии с рекомендациями органа (используйте три уровня защиты: флаконы, сейф и сумку).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в лаборатории уровня биологической безопасности 2. Все человеческие образцы должны быть обработаны с осторожностью, поскольку они ранее не были квалифицированы и могут содержать инфекционные агенты. -
Очистите все инструменты между каждым использованием.
- После использования, разобрать клеточный ситечко и держать со всеми другими инструментами (например, пестик, щипцы) в ванне, содержащей моющее средство решение (1/10 объем моющего средства в H2O) на ночь.
- Кисть каждой посуды, чтобы удалить ткани и мыть чистой водой.
- Высушите все части хорошо, а затем подготовить ячейки ситечко (85 мл, 37 мм в диаметре), поместив 60 сетки стальной сетки на вершине 10 сетки стальной сетки и плотно закрыть кольцо.
- Поместите все инструменты в стерильные мешки и автоклав.
2. Рассечение ткани человека Тонзилляра и изоляция моноядерных клеток Тонзиллара (TMCs)
- Поместите клеточный ситечко на один 150 х 25 мм2 (SPL150) блюдо клеточной культуры и все инструменты в другой SPL150, чтобы держать их стерильными.
- Передача миндалин из флакона в клеточный ситечко с помощью стерильных щипцов. Также влить все PBS, который содержит некоторые клетки, которые вышли миндалин. При необходимости добавьте больше PBS, чтобы погрузить сетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна быть погружена во все времена, чтобы избежать высыхания. - Удалить прижигается, кровавые, и миомы ткани с помощью щипцов и скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Миндалины, изъятые у детей, не нуждаются в этом шаге. - Нарежьте ткани на мелкие кусочки диаметром менее 0,5 см с помощью скальпеля и изогнутого пинцета. Вырезать все ткани так, что мелкие кусочки могут быть погружены в любое время.
- Поместите несколько кусков ткани в клеточный ситечко и соскребите их на сетку со стеклянным пестиком, пока не останется только тонкий слой белой стромы. Удалите и отбросьте строму, чтобы избежать засорения сетки.
- После того, как все ткани были протиснуты через сетку, используйте 10 мл пипетки для передачи всех суспензии ячейки на сетку и царапать его в последний раз.
- Перенесите суспензию ячейки с пипеткой 10 мл в стерильный флакон. Вымойте сетку и клеточный ситечко с PBS 1x. Пусть камера подвески отдохнуть в течение 5 минут на RT на скамейке. Этот шаг позволяет высыпать и агломерации оставшейся стромы, мертвых клеток, и любой выпущенной ДНК, и будет способствовать следующему шагу.
- Поместите стерильную 70-м сито поверх нового 50 мл флакона (тщательно удалить из конверта) и аккуратно перенесите на него клеточную подвеску с помощью пипетки 10 мл. Не смешивайте подвеску, потому что гранулы часто присутствуют. Если сито засорено, используйте заднюю часть стерильной 1 mL наконечник пипетки, чтобы поцарапать клетки корыта сито. Меняйте сито так часто, как это необходимо.
- Центрифуга клетки на 250 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Откажитесь от супернатанта и повторно перенапевите гранулы, аккуратно смешивая флакон, а затем повторно восстановить клетки в 35 мл PBS.
- В новом флаконе поместите новый 70-м сито сверху и перенесите на него с помощью 10 мл пипетки. Если сито засореется, используйте технику, детализированную в шаге 2.7.
3. Изоляция ТМК по градиенту плотности клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: TMCs можно использовать после шага 2.10. Однако, чтобы получить более четкое решение клеток и удалить другие клеточные обломки и любые красные клетки, рекомендуется выполнить градиентную изоляцию плотности клеток моноядерных клеток.
- Добавьте 15 мл градиентной среды плотности (d 1,076 г/мл) в новый флакон 50 мл. Налейте решение TMCs поверх среды градиента плотности, стараясь свести к минимуму смешивание подвески со средой градиента плотности.
- Центрифуга решение на 1000 х г в течение 30 минут на RT с ускорением и перерывом.
- Удалите с помощью 10 мЛ пипетку и отбросьте верхний слой (содержащий в основном PBS 1x), не нарушая интерфейс между TMCs и градиентной средой плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: ТМК содержит небольшое количество эритроцитов, поэтому решение понятно. Таким образом, интерфейс между решением TMCs в PBS и средой градиента плотности может быть трудно визуализировать. Соответственно, клетки могут быть повторно активированы в RPMI 1640 дополнены 20 mM HEPES (без FBS) до градиента плотности выполняется. - Удалите TMCs с стерильным 1 мл пипетки наконечник и поместите в новый 50 мЛ флакон.
- Вымойте клетки, добавив 50 мл PBS, содержащий 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 2 мМ EDTA и центрифугу трубку при 250 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы удалить оставшиеся тромбоциты.
- Повторите шаг 3.5, но центрифуга трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка культуры среды (R10) путем дополнения RPMI 1640 с 10% тепла инактивированных FBS, 2 мМ L-глютамин, и антибиотик раствор (100 U/mL пенициллиум и 100 мкг / мл стрептомицин).
- Resuspend TMCs в 10 mL R10 и подсчитывают клетки. В среднем, эта техника дает 5 х 108-2 х 109 ТМК на пару миндалин. Клетки теперь могут быть использованы для исследований, как PBMCs из цельной крови (например, очистка конкретного типа клеток, культура клеток, поток цитометрии, RT-qPCR, замораживание и т.д.).
-
При необходимости заморозьте клетки для дальнейшего использования с использованием стандартных методов для замораживания первичных клеток.
- Подсчитайте количество клеток.
- Центрифуга клетки и удалить супернатант. Растворите гранулы в достаточном 100% FBS для окончательной концентрации 1 х 108 клеток/мЛ, затем добавьте тот же объем 80% FBS и 20% DMSO раствора. Клетки будут находиться на уровне 5 х 107 ячеек/мЛ. Этот шаг должен быть сделан при 4 градусах Цельсия, а решение FBS и DMSO должно быть сохранено при 4 градусах Цельсия перед использованием.
- Распределите 1 мЛ клеточного раствора в криотрубки и поместите их в медленно замораживающий контейнер, который был на 4 градуса по Цельсию в одночасье, чтобы контролировать скорость замораживания клеток. Поместите его на -80 градусов по Цельсию.
- Чтобы разморозить клетки, поместите криовиалы в теплую ванну при 37 градусах Цельсия в течение нескольких секунд с постоянным возбуждением. Как только клетки начинают оттаивать, перенесите их на 49 мл R10 и центрифугу для удаления DMSO. Подсчитайте клетки и используйте их как PBMCs.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя замораживание и оттаивание ТМК удалит мусор, это также повредит некоторые редкие типы клеток. Если сгустки или мусор присутствуют после оттаивания, лучше всего пройти суспензию клетки через стерильные 70 мкм сито, прежде чем использовать его.
4. Фенотипирование ТМК по цитометрии потока
- Извлеките 5 x 106 клеток из предыдущего раствора для каждой панели смеси антител, которая должна быть протестирована и поместить в 5-мЛ цитометрию трубки. Извлеките 1 x 106 ячеек для неокрашенного элемента управления.
- Вымойте клетки в PBS и центрифуги на 400 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Повторное их в 500 мл PBS (1 х 106 клеток/мл) и инкубировать пятном жизнеспособности в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия в темноте.
- Добавьте 5 мл тепла инактивированной человеческой сыворотки AB на 100 мл клеточной подвески и инкубировать в течение 15 мин при температуре 4 градусов по Цельсию в темноте.
- Вымойте клетки в PBS - 2% FBS и 2 мМ EDTA (Wash Buffer) и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Resuspend TMCs в 500 мл стирального буфера, содержащего антитела, описанные в таблице 1. Инкубировать клетки в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию в темноте.
- Вымойте клетки в стиральной буфер и центрифуги на 400 х г в течение 5 минут при 4 градусов по Цельсию. Resuspend TMCs в 500 МЛ PBS, содержащий 0,5% параформальдегида (PFA). Хранить в темноте при 4 градусах до приобретения цитометрией потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: PFA опасна. Используйте коммерческое готовое к использованию решение для подготовки решения PFA на 0,5%.
| Антитела | Клон | Фторхром | Компании |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Научные | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Фарминген |
| CD8 | SK1 | Амyan | BD Фарминген |
| CD8 | BW135/80 | ВиоБля | Милтеньи Биотек |
| CD4 | РПА-Т4 | PE-Cy7 | BD Фарминген |
| CD45 | HI30 | ПерКП-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Бекман Коултер |
| CD20 | 2Н7 | Алекса Флюор 700 | BD Фарминген |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Фарминген |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Фарминген |
| CD16 | 3G8 | БТР-Н7 | BD Фарминген |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Фарминген |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Фарминген |
| БДКА-1 | L161 | Тихоокеанский синий | BD Фарминген |
| БДКА-3 | AD5-14H12 | FITC | Милтеньи Биотек |
| БДКА-4 | AD5-17F6 | Apc | Милтеньи Биотек |
| ХЛА-Д.Д. | G646-6 | ПерКП-cy5.5 | BD Фарминген |
| CD11c | 3.9 | Алекса Флюор 700 | эбиоуауки |
Таблица 1: Список антител для клеточной характеристики по цитометрии потока.
5. Пример активации ТМК и измерения производства цитокинов
- Разбавить TMCs в среде R10, чтобы получить концентрацию 2 х 106 клеток / мЛ.
- Распределите 400 000 ТМК в 200 мл R10 в 96 хорошо круглой нижней пластине.
- Чтобы активировать клетки, добавьте 5 мкг/мл TLR7/8 агонист resiquimod (R848) на ночь.
- Центрифуга пластин и получить супернатант TMCs и заморозить его для дальнейшего анализа. Производство цитокинов будет оцениваться с использованием иммуноанализа на основе бисера для количественной оценки нескольких растворимых цитокинов одновременно с использованием цитометра потока в соответствии с протоколом производителя.
- Оцените жизнеспособность клеток с помощью люминесцентной клеточной жизнеспособности анализа в соответствии с протоколом производителя. Короче говоря, добавьте 60 мл раствора жизнеспособности клеток в скважины и измерьте люминесценцию в течение 10 мин (приобретение для 1 с/хорошо).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сначала мы охарактеризовали иммунный профиль клеток, присутствующих в культуре, и проанализировали количество ТМК. Мы фенотипировали ТМК из миндалин с цитометрией потока. Как показано на рисунке 1,все основные типы иммунных клеток, присутствующих в ПБМК из крови, были представлены в ТМК из миндалин. Однако в ТМК частота всех типов клеток, за исключением В-клеток, была ниже, чем в ПБМТ.
Рисунок 1: Фенотипирование ТМК в миндалинах. ТМК от здоровых доноров были получены после вскрытия ткани человека миндално-тонзиллярной ткани и изоляции клеток. (A) Клетки были окрашены, и данные были получены поток цитометрии. Данные представляют собой репрезентативный эксперимент. (B) Таблица суммирует процент каждого типа клеток в живых TMCs в миндалинах из шести различных здоровых доноров и сравнивает каждый процент каждого типа клеток в ПБМТ из крови, как определено в литературе18,19. Данные отображаются как процент живых ячеек SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Затем мы протестировали иммунологические реакции ТМК. Один из способов воспроизвести активацию клетки против патогена является стимулирование врожденных иммунных датчиков из Toll-Like Receptors (TLRs) семьи. TLRs в основном присутствуют в моноцитах /макрофагах, всех подтипах дендритных клеток (DC), плазмоцитоидных дендритных клетках (ПДК), а также в В-клетках. В этом примере мы изучили TLR7 и TLR8, потому что они специализируются на противовирусных реакций и большинство случаев тонзиллита (т.е. миндалин инфекции) вызваны вирусной инфекцией. Таким образом, TMCs из миндалин (график синим цветом) от семи здоровых доноров были стимулированы на ночь с TLR7/8 лиганд resiquimod (R848). Как и в PBMCs (график в зеленом), активация через TLR7/8 сигнализации вызвало производство интерферонов типа I (IFN) и провоспалительных цитокинов. В самом деле, цитокин наиболее высоко производится в TMCs после активации был ИФНЗ, член типа I IFN семьи, которая в основном участвует в врожденном иммунитете против вирусной инфекции и в основном производится PDCs. Все проверенные цитокины, за исключением IFN2/3 и IL-8, были произведены ТМК, хотя и на более низких уровнях, чем в ПБМС. Интересно, что некоторые цитокины (в основном ИЛ-8, но и ИЛ-6, ИЛ-10 и ТНФЗ) присутствовали в большем количестве на базальных уровнях. Кроме того, мы сравнили цитокинов, производимых изолированных TMCs или миндалин ткани блоков, подготовленных, как описано ранее6. Мы измерили все типы IFN, произведенные в супернатанте обеих клеточных культур, используя анализ линии клеток STING-37, как описано ранее17, и показали, что мы можем измерять только уровни ИФН в изолированных ТМК.
Рисунок 2: ТМК вырабатывали цитокины при стимуляции. (A) Очищенные и изолированные ТМК (синий) и PBMCs (зеленый) были стимулированы на ночь с R848 (5 мкг/мл). Супернатанты были извлечены и заморожены до использования. Иммуноанализ на основе бисера был выполнен для количественной оценки нескольких растворимых цитокинов одновременно с использованием цитометра потока. Графики представляют концентрацию в пикограммах на миллилитр каждого измеренного цитокина. Увеличение сброса аннотировано красным цветом на графиках. Тест Манн-Уитни У. (B) Очищенные и изолированные ТМК из миндалин (синий) и миндалин ткани блоков (оранжевый) были стимулированы для 24 ч с вирусом гриппа А (IAV). Анализ линии связи с корреспондентом STING-37 был использован для измерения производства ИФН в супернатанте. Коробочный и усы участки со средним и минимальным до максимума. Тест Манн-Уитни У. P ЗДТ; 0,001, П.Л.; 0,01,П.Л.; 0,05.P NS - не стимулировали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Наконец, мы проверили жизнеспособность ТМК. Для измерения жизнеспособности клеток имеется несколько методов. Здесь мы использовали люминесцентный анализ жизнеспособности клеток, легкий и быстрый двухступенчатый анализ. Как показано на рисунке 3, мы четко обнаружили цитотоксичность, индуцированной соединением 1 в ТМК, которое не было токсичным для ПБМК. Таким образом, ТМК показали более высокую чувствительность к тестируемый препарат.
Рисунок 3: Соединение 1 было токсичным для ТМК. Очищенные и изолированные ТМК и ПБМТ прединкубатировались соединением 1 (C1) в различных концентрациях в течение 1 л/с, а затем стимулировались на ночь с R848 (5 мкг/мл). Были извлечены супернацанты, добавлено 60 МЛ раствора жизнеспособности клеток и измерено свечение. В этом - представляется статистический анализ, сравнивающий C1 с NS. Коробочный и усы участки со средним и минимальным до максимума. Крускаль-Валлис тест с Данна после специальной коррекции. P й lt; 0.0001,P q lt; 0.001,P q lt; 0.01,P q lt; 0.05. NS - не стимулировали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Человеческие миндалины представляют собой интегративную и физиологическую модель ex vivo для изучения врожденных иммунных реакций в мукосальном интерфейсе, потому что они имитируют роль вторичного лимфоидного органа. Интересно, что клеточный состав ТМК похож на ПБМК и включает в себя все основные популяции клеток, хотя их процент может отличаться от ПБМК открови (рисунок 1). Дополнительные популяции также могут быть найдены, так как все иммунные реакции начаты в тканях (слизистая оболочка или вторичные лимфоидные органы), а не в крови.
Использование человеческих тканей explants, а также использование клеточной культуры или клеток крови каждый из них имеют свои преимущества. Однако для изучения секреции цитокинов и активации клеток, ткани экспланты не были лучшей моделью. В самом деле, мы не могли обнаружить каких-либо IFN производства в супернатант ткани explants (Рисунок 2B). Мы полагаем, что он непосредственно потребляется окружающими клетками. С другой стороны, стимуляция клеток крови (PBMCs) может имитировать первичную реакцию на инфекцию, но не имитировать то, что происходит в тканях, где производится большинство цитокинов и где размножаются вирусы. Поэтому мы создали протокол для изоляции и очистки клеток, возникающих из вторичной лимфоидной ткани, миндалин. Мы очистили ТМК от здоровых человеческих миндалин, что позволяет нам исследовать активацию иммунных клеток при стимуляции. Тем не менее, одним из ограничений этой модели является то, что ТМК не производят столько провоспалительных цитокинов, как PBMCs ex vivo на TLR7/8 стимуляции, хотя уровни IFN, основные противовирусные цитокины, похож в обеих культурах.
Изучение токсичности соединений на ТМК по сравнению с ПБМК показало, что ТМК более чувствительны к токсичному препарату(рисунок 3). Таким образом, токсичность новых препаратов и будущих методов лечения должна быть проверена в клетках из тканей, а не только на клеточных линиях, PBMCs, или ткани explants. Таким образом, использование ТМК для тестирования на наркотики, как представляется, в будущем применение описанного метода.
Миндалины от взрослых или детей могут быть получены и обработаны, как описано. Тем не менее, мы рекомендуем получать миндалины от детей по двум основным причинам: 1) Детские миндалины содержат больше клеток, чем взрослые' 20. Действительно, тонзиллярная гипертрофия особенно распространена у детей, потому что они борются больше детских вирусов. Таким образом, эти большие миндалины могут стать обструктивными миндалинами и должны быть удалены частичной тонзиллектомии, чтобы избежать осложнений, таких как апноэ сна13; 2) Потому что миндалины взрослых обычно извлекаются после нескольких эпизодов инфекций уха-носа-горла (ЛОР), эти миндалины менее наивны и содержат меньше клеток.
Очень важно работать на миндалине как можно скорее после операции по удалению, в идеале злт;3 ч после сбора. Действительно, сразу после удаления и до вскрытия миндалины с каждой стороны хранятся вместе в стерильном флаконе объемом 50 мЛ, содержащим около 20 мл PBS, так что они полностью погружены в воду.
Вариабельность интердонора может представлять собой серьезную проблему для воспроизводимости. Действительно, изменчивость клеточного состава между донорами может быть значительной. Наш протокол, используя TMCs и не ткани explants, ограничивает эту изменчивость, потому что клетки из целых миндалин смешиваются до того, как побочные и помещены в культуру, в то время как ткани explants принести интрадона изменчивость в клеточном составе, потому что куски приходят из разных областей в том же образце. Частичная тонзиллектомия может быть выполнена только на невоспаленных миндалинах, что ограничивает воспалительное состояние изменчивости между пациентами. Мы также рекомендуем собирать миндалины хирургическим путем удалены в разные дни. Мы ясно заметили, что межхирургическая и междневная изменчивость выше, чем изменчивость интердонора (данные не показаны).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным агентством по де ла Рехерш-сюр-ле-СИДА и ле Хепатитов ANRS (J-P. H) для экспериментов и стипендий N.B. (AAP 2017 166). N.S. признает поддержку со стороны ANRS для стипендий (AAP 2016 1), Европейской организации молекулярной биологии EMBO для стипендий (LT 834 2017), программы финансирования стартапа "Baustein" Медицинского факультета Ульмского университета (LSBN.0147) и Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
