Summary
En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amídricas de seres humanos sanos sometidos a amigdalectomía quirúrgica parcial para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa.
Abstract
El estudio de las células aisladas de los tejidos linfoide asociados a la mucosa (MALT) permite comprender la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa, ya que pueden modelar interacciones huésped-patógeno en el tejido. Mientras que las células aisladas derivadas de los tejidos fueron el primer modelo de cultivo celular, su uso se ha descuidado porque el tejido puede ser difícil de obtener. En el presente protocolo, explicamos cómo procesar y cultivar fácilmente células mononucleares amiglares (TMC) a partir de amígdalas humanas sanas para estudiar las respuestas inmunitarias innatas tras la activación, imitando la infección viral en los tejidos de la mucosa. El aislamiento de los TMC de las amígdalas es rápido, porque las amígdalas apenas tienen epitelio y producen hasta miles de millones de todos los principales tipos de células inmunitarias. Este método permite la detección de la producción de citoquinas utilizando varias técnicas, incluyendo inmunoensayos, qPCR, microscopía, citometría de flujo, etc., similar al uso de células mononucleares periféricas (PBMC) de la sangre. Además, los TMC muestran una mayor sensibilidad a las pruebas de drogas que los PBMC, que deben ser considerados para futuros ensayos de toxicidad. Por lo tanto, las culturas de TMCs ex vivo son un modelo mucoso fácil y accesible.
Introduction
Los estudios sobre órganos humanos están restringidos debido a la accesibilidad, así como razones éticas obvias. Sin embargo, son esenciales para comprender plenamente la complejidad de la biología humana. Los cultivos de células aisladas (cultivos primarios o líneas celulares) son un sistema estándar en los estudios de biología celular debido a su disponibilidad. Si bien los cultivos celulares aislados han permitido descubrimientos sobresalientes, el uso de líneas celulares se ha visto un mayor escrutinio porque no imitan completamente la biología de órganos in vivo. Sin embargo, el cultivo de células tridimensionales o explantes de tejidos es altamente complejo4,,5,,6. De hecho, un pedazo de tejido u órgano es altamente heterogéneo porque su composición celular difiere dependiendo de la localización en el tejido. Por lo tanto, el uso de bloques de tejido requiere el análisis de muchas réplicas técnicas y biológicas, lo que lleva a la necesidad de un gran número de donantes o pacientes.
Los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) son estructuralmente similares a los ganglios linfáticos pero tienen funciones únicas, porque su función principal es regular la inmunidad a la mucosa7. A diferencia de los ganglios linfáticos, que generalmente se encuentran a cierta distancia de los tejidos, el MALT generalmente se encuentra inmediatamente debajo del epitelio del tejido mucoso. Histológicamente, se componen principalmente de altas concentraciones de células B y T, pero también células que presentan antígenos como macrófagos y células dendríticas. MalT constituyen alrededor del 50% del tejido linfoide en el cuerpo humano. MALT se subdivide en nueve grupos dependiendo de su ubicación: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (conjuntival), LALT (laringe-), SALT (piel-), VALT (vulvo-), O-MALT (organizado) y D-MALT (difuso). El O-MALT se compone principalmente de las amígdalas del anillo amigdal de Waldeyer y es el MALT8,,9. De hecho, las amígdalas ubicadas en la orofaringe constituyen la principal barrera que protege las vías digestivas y respiratorias de los microorganismos (potenciales) invasivos10. Además, las amígdalas están cubiertas por un epítelio escamoso estratificado fino no queratinizante, apoyado por una cápsula de tejido conectivo que contiene vasos sanguíneos, nervios y linfáticos, proporcionando un fácil acceso a las células inmunitarias11,12. Además, la amigdalectomía, el acto quirúrgico de extirpar amígdalas, es un procedimiento común realizado en niños con respiración desordenada del sueño, haciendo de las amígdalas un tejido fácilmente disponible13 en entornos fisiológicos.
Las amígdalas permiten el estudio de la respuesta de las células inmunitarias en patologías que implican inmunidad a la mucosa. De hecho, en la infección por el VIH, debido a que las amígdalas se componen de una alta concentración de células inmunitarias, son el principal objetivo de replicación viral, pero también producen una gran cantidad de citoquinas que no se detectan en la circulación14,,15. En estados estables, poblaciones raras de células innatas están presentes en varios tejidos mucosos, incluyendo las amígdalas, pero están esencialmente ausentes de la sangre.
Por lo tanto, las células mononucleares de las amígdalas (TMC) son un modelo más relevante y complejo que los PBMC y pueden responder a preguntas más profundas. Por otro lado, el uso de tejidos explantes puede ser complejo y no siempre relevante para los estudios inmunes innatos. Así, establecimos un modelo para estudiar la activación inmune de la mucosa utilizando LOS TMC16. Aquí, describimos un método para el aislamiento eficiente de los TMC de las amígdalas humanas frescas. Este método permite la recuperación de un gran número de células inmunitarias manteniendo su integridad para estudios ex vivos.
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Protocol
Los especímenes no se recogen específicamente con fines de investigación y el estudio no se considera invasivo. Sin embargo, la recolección de amígdalas humanas requiere la aprobación ética de las autoridades locales pertinentes. En nuestro caso, fue aprobado por el Comité de Protección de las Personas (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Además, se solicita el consentimiento de cada paciente o representante legal para obtener los datos personales de los donantes (por ejemplo, sexo, edad, antecedentes de infecciones de oto sexual) que puedan ayudar a interpretar los resultados experimentales.
1. Manejo del tejido toniglar humano
- Poner las amígdalas de cada donante en un vial estéril de 50 ml que contenga 25 ml de PBS 1x y transportarlas a temperatura ambiente (RT) al laboratorio de acuerdo con las recomendaciones de la autoridad (utilice tres niveles de protección: viales, una caja de seguridad y una bolsa).
NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2. Todos los especímenes humanos deben manipularse con cuidado, ya que no han sido previamente calificados y pueden contener agentes infecciosos. -
Limpie todas las herramientas entre cada uso.
- Después de su uso, desmonte el colador celular y guárd europeo con todos los demás instrumentos (por ejemplo, pestle, fórceps) en un baño que contenga una solución de detergente (1/10 detergente de volumen en H2O) durante la noche.
- Cepille cada utensilio para extraer el tejido y lave con agua clara.
- Seque bien todas las piezas, luego prepare el colador celular (85 ml, 37 mm de diámetro) colocando una rejilla de acero de malla 60 en la parte superior de una rejilla de acero de malla de 10 y cierre firmemente el anillo.
- Coloque todas las herramientas en bolsas estériles y autoclave.
2. Disección del tejido toniglar humano y aislamiento de las células mononucleares tonúculas (TMC)
- Coloque el colador celular en un plato de cultivo celular de 150 x25 mm 2 (SPL150) y todos los instrumentos en otro SPL150 para mantenerlos estériles.
- Transfiera las amígdalas del vial al colador celular utilizando fórceps estériles. También verter en todo el PBS, que contiene algunas células que han salidado las amígdalas. Si es necesario, agregue más PBS para sumergir la cuadrícula.
NOTA: El tejido debe sumergirse en todo momento para evitar la desicación. - Retire el tejido cauterizado, sangriento y fibroma usando fórceps y un bisturí.
NOTA: Las amígdalas extraídas de los niños no necesitan este paso. - Cortar los tejidos en pequeños trozos de menos de 0,5 cm de diámetro utilizando el bisturí y las pinzas curvas. Corte todo el tejido para que las piezas pequeñas puedan sumergirse en todo momento.
- Coloque algunos trozos de tejido en el colador celular y rasparlos en la rejilla con un pestillo de vidrio hasta que sólo quede una capa muy delgada de estroma blanco. Retire y deseche el estroma para evitar obstruir la rejilla.
- Una vez que todos los tejidos han sido exprimidos a través de la rejilla, utilice una pipeta de 10 ml para transferir toda la suspensión celular a la rejilla y raspar una última vez.
- Transfiera la suspensión celular con una pipeta de 10 ml en un vial estéril. Lave la rejilla y el colador celular con PBS 1x. Deje reposar la suspensión de la célula durante 5 minutos en RT en el banco. Este paso permite la precipitación y la aglomeración del estroma sobrante, las células muertas y cualquier ADN liberado, y facilitará el siguiente paso.
- Coloque un tamiz estéril de 70 m encima de un nuevo vial de 50 ml (retirarlo cuidadosamente del sobre) y transferir suavemente la suspensión celular sobre él con una pipeta de 10 ml. No mezcle la suspensión, ya que con frecuencia hay un pellet presente. Si el tamiz está obstruido, utilice la parte posterior de una punta de pipeta estéril de 1 ml para rayar las células a través del tamiz. Cambie el tamiz tantas veces como sea necesario.
- Centrifugar las células a 250 x g durante 10 min a 4oC.
- Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet mezclando suavemente el vial, luego resuspender las células en 35 ml de PBS.
- En un vial nuevo, coloque un nuevo tamiz de 70 m en la parte superior y transfiera la suspensión celular sobre él con una pipeta de 10 ml. Si el tamiz está obstruido, utilice la técnica detallada en el paso 2.7.
3. Aislamiento de los TMC por Gradiente de Densidad Celular
NOTA: Los TMC se pueden utilizar después del paso 2.10. Sin embargo, para obtener una solución celular más clara y eliminar otros desechos celulares y cualquier célula roja, se recomienda realizar un aislamiento de gradiente de densidad celular de las células mononucleares.
- Añadir 15 ml del medio de gradiente de densidad (d a 1,076 g/ml) en un nuevo vial de 50 ml. Vierta la solución de TMCs en la parte superior del medio de gradiente de densidad, teniendo cuidado de minimizar la mezcla de la suspensión con el medio de gradiente de densidad.
- Centrifugar la solución a 1.000 x g durante 30 minutos en RT con aceleración y ruptura.
- Retirar con una pipeta de 10 ml y desechar la capa superior (que contiene principalmente PBS 1x) sin alterar la interfaz entre los TMC y el medio de gradiente de densidad.
NOTA: Los TMC contienen un número bajo de eritrocitos, por lo tanto, la solución es clara. Por lo tanto, la interfaz entre la solución de TMCs en PBS y el medio de gradiente de densidad puede ser difícil de visualizar. En consecuencia, las células se pueden resuspendirse en RPMI 1640 complementadas con 20 mM HEPES (sin FBS) antes de que se realice el gradiente de densidad. - Retire los TMC con una punta de pipeta estéril de 1 ml y colóquelos en un nuevo vial de 50 ml.
- Lavar las células añadiendo 50 ml de PBS que contienen 2% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM EDTA y centrifugar el tubo a 250 x g durante 10 min a 4 oC para eliminar las plaquetas restantes.
- Repita el paso 3.5, pero centrifugar el tubo a 400 x g durante 10 min a 4 oC.
- Preparar el medio de cultivo (R10) complementando la RPMI 1640 con FBS inactivado al 10% con calor, 2 mM de L-glutamina y la solución antibiótica (100 U/ml peniciillium y 100 g/mL de estreptomicina).
- Resuspender los TMC en 10 ml de R10 y contar las células. En promedio, esta técnica produce 5 x 108-2 x 109 TCC por par de amígdalas. Las células ahora se pueden utilizar para investigaciones como PBMC a partir de sangre entera (por ejemplo, purificación de tipo celular específico, cultivo celular, citometría de flujo, RT-qPCR, congelación, etc.).
-
Si es necesario, congele las células para su uso posterior utilizando técnicas estándar para la congelación de células primarias.
- Cuente el número de celdas.
- Centrifugar las células y quitar el sobrenadante. Disolver el pellet en suficiente 100% FBS para una concentración final de 1 x 108 células/ ml, a continuación, añadir el mismo volumen de una solución 80% FBS + 20% DMSO. Las celdas estarán entonces en 5 x 107 células/ml. Este paso debe realizarse a 4 oC y la solución FBS y DMSO debe mantenerse a 4 oC antes de su uso.
- Distribuya 1 ml de la solución celular en criotubos y colóquelos en un recipiente de congelación lenta que haya estado a 4 oC durante la noche para controlar la velocidad de congelación celular. Colóquelo a -80oC.
- Para descongelar las células, coloque los crioviales en un baño caliente a 37 oC durante unos segundos con agitación constante. Tan pronto como las células comiencen a descongelarse, transfiérelas a 49 ml de R10 y centrífuga para eliminar el DMSO. Cuente las células y utilícelos como PBMC.
NOTA: Aunque congelar y descongelar los TMC eliminará los desechos, también dañará algunos tipos de células raras. Si hay grumos o escombros después de la descongelación, lo mejor es pasar la suspensión celular a través de un tamiz estéril de 70 m antes de usarlo.
4. Fenotipado de TMCs por citometría de flujo
- Recuperar 5 x 106 células de la solución anterior para cada panel de mezcla de anticuerpos que necesita ser probado y colocar en un tubo de citometría de 5 ml. Recupere 1 x 106 celdas para el control no detenido.
- Lavar las células en PBS y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC. Resuspútelos en 500 oL de PBS (1 x 106 células/ml) e incubar con una mancha de viabilidad durante 30 min a 4oC en la oscuridad.
- Añadir 5 l de calor inactivado suero AB humano por 100 l de suspensión celular e incubar durante 15 min a 4 oC en la oscuridad.
- Lavar las células en PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Wash Buffer) y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC.
- Resuspender los TMC en 500 l de tampón de lavado que contenga los anticuerpos como se detalla en la Tabla 1. Incubar las células durante 30 min a 4oC en la oscuridad.
- Lavar las células en Wash Buffer y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4oC. Resuspender los TMC en 500 l de PBS que contienen 0.5% de paraformaldehído (PFA). Mantener en la oscuridad a 4 oC hasta la adquisición por citometría de flujo.
NOTA: PFA es peligroso. Utilice una solución comercial lista para usar para preparar la solución PFA del 0,5%.
| Anticuerpo | Clon | Fluorocromo | Empresa |
| Live-Dead | BV405 | ThermoFisher Scientific | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Pacific Blue | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiociencias |
Tabla 1: Lista de anticuerpos para la caracterización celular por citometría de flujo.
5. Ejemplo de activación de los TMC y medición de la producción de citoquinas
- Diluir los TMC en el medio R10 para obtener una concentración de 2 x 106 células/ml.
- Distribuya 400.000 TMC en 200 l de R10 en una placa inferior redonda de 96 pozos.
- Para activar las células, agregue 5 g/ml del resiquimod agonista TLR7/8 (R848) durante la noche.
- Centrifugar las placas y recuperar el sobrenadante de los TMC y congelarlo para su posterior análisis. La producción de citoquinas se evaluará utilizando inmunoensayos basados en cuentas para cuantificar múltiples citoquinas solubles simultáneamente utilizando un citometro de flujo siguiendo el protocolo del fabricante.
- Evaluar la viabilidad de las células utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, añada 60 l de solución de viabilidad celular a los pocillos y mida la luminiscencia en un plazo de 10 min (adquisición durante 1 s/pozo).
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Representative Results
Primero caracterizamos el perfil inmune de las células presentes en el cultivo y analizamos la cantidad de TMC. Hemos fenotipado los TMC de amígdalas con citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 1,todos los principales tipos de células inmunitarias presentes en los PBMC a partir de sangre fueron representan en los TMC de las amígdalas. Sin embargo, en los TMC la frecuencia de todos los tipos de células, excepto las células B, era menor que en los PBMC.
Figura 1: Fenotipado de TMC en amígdalas. Los TMC de donantes sanos se obtuvieron después de la disección del tejido amiglar humano y el aislamiento de las células. (A) Las células se tiñeron y los datos se adquirieron mediante citometría de flujo. Los datos representan un experimento representativo. (B) La tabla resume el porcentaje de cada tipo de célula en TMC vivos en amígdalas de seis donantes sanos diferentes y compara cada uno con el porcentaje de cada tipo de célula en PBMC de sangre, tal como se define en la literatura18,19. Los datos se muestran como el porcentaje de celdas vivas SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Luego probamos las respuestas inmunológicas de los TMC. Una forma de reproducir la activación de una célula contra un patógeno es estimular los sensores inmunes innatos de la familia de receptores similares a los peajes (TTR). Los TTR están presentes principalmente en monocitos/macrofagos, todos los subtipos de células dendríticas (DC), células dendríticas plasocitos (pDC) y también en células B. En este ejemplo, estudiamos TLR7 y TLR8, porque se especializan en respuestas antivirales y la mayoría de los casos de amigdalitis (es decir, infecciones por amígdalas) son causadas por una infección viral. Así, los TMC de amígdalas (gráfico en azul) de siete donantes sanos fueron estimulados durante la noche con el ligando TLR7/8 resiquimod (R848). Al igual que en los PBMC (gráfico en verde), la activación a través de la señalización TLR7/8 activó la producción de interferones de tipo I (IFN) y citoquinas proinflamatorias. De hecho, la citoquina más producida en los TMC tras la activación fue IFN, un miembro de la familia IFN tipo I que participa principalmente en la inmunidad innata contra la infección viral y es producida principalmente por los pcDC. Todas las citoquinas analizadas, excepto IFN2/3 e IL-8, fueron producidas por TMC, aunque en niveles más bajos que en los PBMC. Además, comparamos las citoquinas producidas por TMC aislados o por bloques de tejido tonible preparados como se describió anteriormente6. Medimos todos los tipos de IFN producidos en el sobrenadante de ambos cultivos celulares utilizando el ensayo STING-37 cell line reporter como se describió anteriormente17 y mostramos que sólo podíamos medir los niveles de IFN en los TMC aislados.
Figura 2: Los TMC producen citoquinas tras la estimulación. (A) Los TMC purificados y aislados (azul) y los PBMC (verdes) se estimularon durante la noche con R848 (5 g/ml). Los sobrenadantes fueron recuperados y congelados hasta su uso. Se realizó un inmunoensayo basado en cuentas para cuantificar múltiples citoquinas solubles simultáneamente utilizando un citometro de flujo. Los gráficos representan la concentración en picogramos por mililitro de cada citoquina medida. Los aumentos de pliegue se anotan en rojo en los gráficos. Prueba Mann-Whitney U. (B) Se estimularon los TMC purificados y aislados de las amígdalas (azul) y los bloques de tejido tonsilar (naranja) durante 24 h con el virus de la gripe A (IAV). Se utilizó un ensayo de línea celular de reportero STING-37 para medir la producción de IFN en el sobrenadante. Parcelas de caja y bigote con una mediana de mínimo a máximo. Prueba Mann-Whitney U. P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS - no estimulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Finalmente, probamos la viabilidad de los TMC. Hay varias técnicas disponibles para medir la viabilidad celular. Aquí, usamos un ensayo de viabilidad de células luminiscentes, un ensayo fácil y rápido de dos pasos. Como se muestra en la Figura 3, detectamos claramente la citotoxicidad inducida por el compuesto 1 en los TMC, que no era tóxico para los PBMC. Por lo tanto, los TMC mostraron una mayor sensibilidad a la droga probada.
Figura 3: El compuesto 1 era tóxico para los TMC. Los TMC y los PFC purificados y aislados se preincubaron con el compuesto 1 (C1) a diversas concentraciones durante 1 h y luego se estimularon durante la noche con R848 (5 g/ml). Se recuperaron los supernadantes, se añadieron 60 l de solución de viabilidad celular y se midió la luminiscencia. El * representa el análisis estadístico que compara C1 con NS. Parcelas de caja y bigote con una mediana de mínimo a máximo. Prueba Kruskal-Wallis con la corrección post hoc de Dunn. P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS - no estimulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las amígdalas humanas representan un modelo integrador y fisiológico ex vivo para estudiar las respuestas inmunitarias innatas en la interfaz mucosa, porque imitan el papel de un órgano linfoide secundario. Curiosamente, la composición celular de los TMC es similar a las PBMC e incluye todas las principales poblaciones celulares, aunque su porcentaje puede ser diferente de los PBMC de la sangre (Figura 1). También se pueden encontrar poblaciones adicionales, ya que todas las respuestas inmunitarias se inician en tejidos (mucosa u órganos linfoides secundarios) y no en la sangre.
El uso de explantes de tejido humano, así como el uso de cultivos celulares o células sanguíneas cada uno tiene sus ventajas. Sin embargo, para el estudio de la secreción de citoquinas y la activación celular, los explantes de tejido no fueron el mejor modelo. De hecho, no pudimos detectar ninguna producción de IFN en el sobrenadante de tejidos explantes (Figura 2B). Especulamos que es consumido directamente por las células circundantes. Por otro lado, la estimulación de las células sanguíneas (PBMC) puede imitar la respuesta primaria a la infección, pero no imitar lo que está sucediendo en los tejidos, donde se producen la mayoría de las citoquinas y donde se replican los virus. Por lo tanto, establecemos un protocolo para aislar y purificar las células que surgen de un tejido linfoide secundario, la amígdala. Hemos purificado los TMC de amígdalas humanas sanas, lo que nos permite investigar la activación de las células inmunitarias tras la estimulación. Sin embargo, una de las limitaciones de este modelo es que los TMC no producen tantas citoquinas proinflamatorias como las PBMC ex vivo tras la estimulación TLR7/8, aunque los niveles de IFN, la citoquina antiviral principal, son similares en ambos cultivos.
El estudio de la toxicidad compuesta en los TMC frente a los PBMC reveló que los TMC son más sensibles a un medicamento tóxico (Figura 3). Por lo tanto, la toxicidad de nuevos fármacos y tratamientos futuros debe probarse en células de tejidos y no sólo en líneas celulares, PBMC o plantas de tejidos. Por lo tanto, el uso de TMCs para pruebas de drogas parece ser una aplicación futura del método descrito.
Las amígdalas de adultos o niños se pueden obtener y procesar como se describe. Sin embargo, recomendamos obtener amígdalas de niños por dos razones principales: 1) Las amígdalas de los niños contienen más células que las20de los adultos. De hecho, la hipertrofia amigdalar es particularmente común en los niños, porque combaten más virus infantiles. Por lo tanto, estas grandes amígdalas pueden convertirse en amígdalas obstructivas y necesitan ser extirpadas por una amigdalectomía parcial para evitar complicaciones como la apnea del sueño13; 2) Debido a que las amígdalas de los adultos generalmente se extirpan después de varios episodios de infecciones de la nariz de los oídos (ENT), estas amígdalas son menos ingenuas y contienen menos células.
Es fundamental trabajar en las amígdalas tan pronto como sea posible después de la cirugía de extracción, idealmente <3 h después de la recolección. De hecho, justo después de la extracción y hasta la disección, las amígdalas de cada lado se mantienen juntas en un vial estéril de 50 ml que contiene alrededor de 20 ml de PBS, por lo que están totalmente sumergidas.
La variabilidad interdonor puede representar un problema importante para la reproducibilidad. De hecho, la variabilidad en la composición celular entre los donantes puede ser significativa. Nuestro protocolo, utilizando TMCs y no plantas de tejido, limita esta variabilidad porque las células de todas las amígdalas se mezclan antes de ser chapadas y colocadas en cultivo, mientras que los explantes de tejido aportan variabilidad intradonor en la composición celular porque las piezas provienen de diferentes áreas dentro de la misma muestra. La amigdalectomía parcial solo se puede realizar en amígdalas no inflamadas, lo que limita la variabilidad del estado inflamatorio entre los pacientes. También recomendamos recoger amígdalas extirpadas quirúrgicamente en diferentes días. Hemos notado claramente que las variabilidades intercirujanas e interani excursións son más altas que la variabilidad interdónor (no se muestran datos).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) para los experimentos y la beca N.B. (AAP 2017 166). N.S. reconoce el apoyo de la ANRS para la beca (AAP 2016 1), la Organización Europea de Biología Molecular EMBO for Fellowship (LT 834 2017), el programa de financiación de startups "Baustein" de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ulm (LSBN.0147) y el Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
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