Summary
Bu protokolde, kısmi cerrahi tonsillektomi uygulanan sağlıklı insanlardan bademcikler mononükleer hücrelerin invazyon asyonunu inceleyip mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebileceğimizi açıklıyoruz.
Abstract
Mukoza ile ilişkili lenfoid dokulardan izole hücrelerin incelenmesi (MALT) mukozal bağışıklığı içeren patolojilerde bağışıklık hücrelerinin yanıtının anlaşılmasını sağlar, çünkü dokudaki konak-patojen etkileşimleri modelleyebilirler. Dokulardan elde edilen izole hücreler ilk hücre kültürü modeli iken, doku elde etmek zor olabilir, çünkü bunların kullanımı ihmal edilmiştir. Bu protokolde, sağlıklı insan bademciklerinden bademcikteknükleer hücrelerinin (TMC) aktivasyon üzerine doğuştan gelen immün yanıtları incelemek ve mukozal dokularda viral enfeksiyonu taklit etmek için nasıl kolayca işleyip kültürlendirilebildiğini açıklıyoruz. Bademciklerden TMC'lerin izolasyonu hızlıdır, çünkü bademciklerde ancak epitel vardır ve milyarlarca büyük bağışıklık hücresi tipine kadar verim verir. Bu yöntem, kandan periferik mononükleer hücrelerin (PBMCs) kullanımına benzer immünoassays, qPCR, mikroskopi, akış sitometrisi, vb. gibi çeşitli teknikler kullanılarak sitokin üretiminin saptanmasını sağlar. Ayrıca, TMC'ler uyuşturucu testine, gelecekteki toksisite testleri için dikkate alınması gereken PBMC'lere göre daha yüksek bir duyarlılık göstermektedir. Böylece ex vivo TMC kültürleri kolay ve erişilebilir bir mukozal modeldir.
Introduction
İnsan organları üzerinde yapılan çalışmalar erişilebilirliğin yanı sıra bariz etik nedenlerle de kısıtlanmıştır. Ancak, insan biyolojisinin karmaşıklığını tam olarak anlamak için gereklidirler. İzole hücrelerin kültürleri (birincil kültürler veya hücre çizgileri) hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılabilirlikleri nedeniyle standart bir sistemdir. İzole hücre kültürleri olağanüstü keşifler izin vermiş olsa da, onlar tam in vivo organ biyolojisi taklit etmez çünkü hücre hatlarının kullanımı daha yakından inceleme üzerine geldi. Ancak, üç boyutlu hücre veya doku eksbitki kültürü son derece karmaşık4,5,6. Gerçekten de, doku veya organ parçası son derece heterojendir çünkü hücre bileşimi dokudaki lokalizasyona bağlı olarak farklılık gösterir. Böylece, doku blokları kullanarak birçok teknik ve biyolojik çoğaltmalar analizi gerektirir, donör veya hastaların çok sayıda ihtiyaç yol açan.
Mukoza ile ilişkili lenfoid dokular (MALT) yapısal lenf düğümleri benzer ama benzersiz işlevleri var, ana rolü mukozal bağışıklık düzenlemek için çünkü7. Genellikle dokulardan bazı mesafelerde bulunan lenf düğümleri aksine, MALT genellikle mukozal doku epitel hemen altında yer almaktadır. Histolojik olarak, çoğunlukla B ve T hücrelerinin yüksek konsantrasyonlarda oluşur, ama aynı zamanda makrofajlar ve dendritik hücreler gibi antijen sunan hücreler. MALT insan vücudundaki lenfoid dokunun yaklaşık% 50'sini oluşturmaktadır. MALT konumlarına bağlı olarak dokuz gruba ayrılır: GALT (gut-), BALT (bronş-), NALT (nazal-), CALT (konjonktiva), LALT (gırtlak-), SALT (cilt-), VALT (vulvo-), O-MALT (organize) ve D-MALT (diffüz). O-MALT esas olarak Waldeyer bademcikhalka bademcikoluşur ve en erişilebilir MALT8,9. Nitekim, orofarenks bulunan bademcikler (potansiyel) invaziv mikroorganizmalar10 sindirim ve solunum10yollarını koruyan önemli bir bariyer oluşturmaktadır. Buna ek olarak, bademcikler ince tabakalı skuamöz olmayan keratinizing epitel ile kaplıdır, kan damarları içeren bağ dokusu bir kapsül tarafından desteklenen, sinirler, ve lenfatikler, bağışıklık hücrelerine kolay erişim sağlayan11,12. Ayrıca bademciklerin giderilmesinde yapılan cerrahi işlem olan tonsillektomi, uyku bozukluğu olan çocuklarda yapılan ve bademciklerin fizyolojik ortamlarda kolayca bulunabilen doku13'ü haline getiren yaygın bir işlemdir.
Bademcikler mukozal bağışıklık içeren patolojilerde immün hücre yanıtının incelenmesine olanak sağlar. Gerçekten de, HIV enfeksiyonu, bademcikler bağışıklık hücrelerinin yüksek konsantrasyonoluşur çünkü, onlar viral çoğaltma ana hedefi ama aynı zamanda dolaşımda tespit edilmez sitokinler büyük miktarda üretmek14,15. Sabit hallerde, doğuştan benzeri hücrelerin nadir popülasyonları bademcikler de dahil olmak üzere çeşitli mukozal dokularda mevcuttur, ancak aslında kan yok.
Bu nedenle bademciklerden (TMC) gelen mononükleer hücreler PBMC'lere göre daha alakalı ve karmaşık bir modeldir ve daha derin sorulara cevap verebilir. Öte yandan, doku eksbitkilerinin kullanımı karmaşık olabilir ve her zaman doğuştan gelen bağışıklık çalışmaları ile ilgili değildir. Böylece, TMCs16kullanarak mukozal immün aktivasyon çalışması için bir model oluşturdu. Burada TMC'lerin taze insan bademciklerinden verimli bir şekilde izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ex vivo çalışmalar için bütünlüğünü koruyarak bağışıklık hücrelerinin çok sayıda kurtarma sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Örnekler özellikle araştırma amacıyla toplanmaz ve çalışma invaziv olarak kabul edilmez. Ancak, insan bademcikleri toplama yerel ilgili makamlar tarafından etik onayı gerektirir. Bizim durumumuzda Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, her hastanın veya yasal temsilcinin rızası, deneysel sonuçların yorumlanmasına yardımcı olabilecek bağışçıların kişisel verilerini (örn. cinsiyet, yaş, KT enfeksiyonlarının öyküsü) elde etmek için istenir.
1. İnsan Bademcik Dokusunun Kullanımı
- Her donörden alınan bademcikleri bir steril 50 mL şişeye koyun ve 25 mL PBS 1x içeren ve oda sıcaklığında (RT) kurumun tavsiyelerine göre laboratuvara götürün (şişeler, güvenlik kutusu ve bir çanta olmak üzere üç koruma düzeyi kullanın).
NOT: Tüm prosedür biyolojik güvenlik seviyesi 2 laboratuarında yapılmalıdır. Daha önce kalifiye olmadıkları ve bulaşıcı ajanlar içermedikleri için tüm insan örnekleri özenle ele alınmalıdır. -
Her kullanım arasındaki tüm araçları temizleyin.
- Kullanımdan sonra, hücre süzgecinin sökülmesi ve bir gecede deterjan solüsyonu (H2O'da 1/10 hacim deterjan) içeren bir banyoda diğer tüm aletlerle (örn. havaneli, forseps) saklayın.
- Fırça doku kaldırmak ve temiz su ile yıkamak için her mutfak eşyaları.
- Tüm parçaları iyice kurutun, ardından 10 mesh çelik ızgaranın üzerine 60 örgü çelik ızgara yerleştirerek hücre süzgecini (85 mL, 37 mm çapında) hazırlayın ve halkayı sıkıca kapatın.
- Steril çanta ve otoklav tüm araçları yerleştirin.
2. İnsan Bademcik dokusunun diseksiyonu ve Bademciklerin Mononükleer Hücrelerinin İzolasyon (TMCs)
- Hücre süzgecini bir 150 x 25 mm2 (SPL150) hücre kültür çanağı ve tüm aletleri steril tutmak için başka bir SPL150'ye yerleştirin.
- Steril forceps kullanarak hücre süzgeci içine şişe den bademcikler aktarın. Ayrıca bademcikler çıkış var bazı hücreler içeren PBS, tüm dökün. Gerekirse, ızgarayı batırmak için daha fazla PBS ekleyin.
NOT: Doku kurutma önlemek için her zaman batırılmalıdır. - Forceps ve neşter kullanarak küretkar, kanlı ve fibroid doku çıkarın.
NOT: Çocuklardan çıkarılan bademciklerin bu adıma ihtiyacı yoktur. - Neşter ve kavisli cımbız kullanarak 0,5 cm çapında küçük parçalar halinde dokular kesin. Küçük parçalar her zaman batırılmış olabilir, böylece tüm doku kesin.
- Hücre süzgeci doku birkaç parça yerleştirin ve beyaz stroma sadece gerçekten ince bir tabaka kalana kadar bir cam haşere ile ızgara üzerine kazıyın. Izgarayı tıkamamak için stroma'yı çıkarın ve atın.
- Tüm dokular ızgaradan sıkıştıktan sonra, tüm hücre süspansiyonuna aktarmak için 10 mL'lik bir pipet kullanın ve son bir kez kazıyın.
- Hücre süspansiyonuna 10 mL'lik pipetle steril bir şişeye aktarın. Izgarayı ve hücre süzgecini PBS 1x ile yıkayın. Hücre süspansiyon bankta RT 5 dakika dinlenme sağlar. Bu adım, kalan stromanın, ölü hücrelerin ve serbest bırakılan DNA'nın yağış ve aglomerasyonuna izin verir ve bir sonraki adımı kolaylaştırır.
- Yeni bir 50 mL şişenin üzerine steril 70 m elek yerleştirin (zarftan dikkatlice çıkarın) ve hücre süspansiyonuna 10 mL'lik pipetle yavaşça aktarın. Bir pelet sık sık mevcut olduğu için süspansiyonu karıştırmayın. Elek tıkanmışsa, elekteki hücreleri kazımak için steril 1 mL pipet ucunun arkasını kullanın. Elek gerektiği sıklıkta değiştirin.
- 4 °C'de 10 dk için 250 x g'de hücreleri santrifüj edin.
- Süpernatant atın ve yavaşça şişe karıştırarak pelet resuspend, sonra PBS 35 mL hücreleri yeniden askıya.
- Yeni bir şişede, üzerine 70 m'lik yeni bir elek yerleştirin ve hücre süspansiyonuna 10 mL'lik pipetle aktarın. Elek tıkanmışsa, adım 2.7'de ayrıntılı olarak kullanılan tekniği kullanın.
3. TMC'lerin Hücre Yoğunluğu Gradyan Tarafından İzolasyon
NOT: TMC'ler adım 2.10'dan sonra kullanılabilir. Ancak, daha net bir hücre çözeltisi elde etmek ve diğer hücre enkaz ve herhangi bir kırmızı hücreleri kaldırmak için, mononükleer hücrelerin bir hücre yoğunluğu gradyan izolasyon gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
- Yeni bir 50 mL şişeye yoğunluk gradyan ortamının (d = 1,076 g/mL) 15 mL'sini ekleyin. TMCs çözeltisini yoğunluk gradyan ortamının üzerine dökün ve süspansiyonun yoğunluk gradyan ortamıyla karıştırılmasını en aza indirmeye dikkat edin.
- Çözeltiyi 1.000 x g'de 30 dk'da RT'de ivmelenme ve kopuşla santrifüj edin.
- 10 mL'lik bir pipetle çıkarın ve TMC'ler ile yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimi bozmadan üst katmanı (çoğunlukla PBS 1x içeren) atın.
NOT: TMCs eritrositsayısı düşük türde içerir, bu nedenle çözüm açıktır. Bu nedenle, PBS'deki TMC'lerin çözümü ile yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arabirimi görselleştirmek zor olabilir. Buna göre, yoğunluk gradyanı yapılmadan önce 20 mM HEPES (FBS olmadan) ile takviye edilen RPMI 1640'ta hücreler yeniden askıya alınabilir. - Steril 1 mL pipet ucu ile TMC'leri çıkarın ve yeni bir 50 mL şişeyerleştirin.
- Fetal büyükbaş hayvan serumunun (FBS) %2'sini içeren 50 mL PBS ve 2 mM EDTA ekleyerek hücreleri yıkayın ve kalan trombositleri çıkarmak için 250 x g'de 10 dakika 4 °C'de tüpü santrifüj edin.
- Adımı 3,5 tekrarlayın, ancak tüpü 4 °C'de 10 dk boyunca 400 x g'de santrifüj edin.
- RPMI 1640'ı %10 ısı inaktive FBS, 2 mM L-glutamin ve antibiyotik çözeltisi (100 U/mL penicillium ve 100 μg/mL streptomisin) ile tamamlayarak kültür ortamını (R10) hazırlayın.
- TMC'leri 10 mL R10'da yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. Bu teknik ortalama olarak bademcik çifti başına 5 x 108-2 x 109 TMC verir. Hücreler artık tam kandaki PcBMC'ler (örn. belirli hücre tipinin saflaştırılması, hücre kültürü, akış sitometrisi, RT-qPCR, donma, vb.) gibi araştırmalar için kullanılabilir.
-
Gerekirse, birincil hücre dondurma için standart teknikleri kullanarak daha fazla kullanmak için hücreleri dondurun.
- Hücre sayısını say.
- Hücreleri santrifüj ve supernatant kaldırın. Peleti 1 x 108 hücre/mL nihai konsantrasyon için yeterli %100 FBS'de çözün, ardından %80 FBS + %20 DMSO çözeltisinin aynı hacmini ekleyin. Hücreler daha sonra 5 x 107 hücre/mL olacaktır. Bu adım 4 °C'de yapılmalı ve FBS ve DMSO çözeltisi kullanmadan önce 4 °C'de tutulmalıdır.
- Hücre çözeltisinin 1 mL'sini kriyotüplere dağıtın ve hücre dondurma oranını kontrol etmek için bir gecede 4 °C'de olan yavaş bir dondurucu kabına koyun. -80 °C'ye yerleştirin.
- Hücreleri eritmek için cryovials'ı 37 °C'de ılık bir banyoya yerleştirin. Hücreler erimeye başlar başlamaz, DMSO'yu çıkarmak için 49 mL R10 ve santrifüje aktarın. Hücreleri sayın ve Bunları PBMC olarak kullanın.
NOT: TMC'lerin dondurulması ve çözülmesi enkazı ortadan kaldırsa da, bazı nadir hücre tiplerine de zarar verecektir. Kümeler veya döküntüler eritme sonra varsa, kullanmadan önce steril bir 70 μm elek ile hücre süspansiyon geçmek en iyisidir.
4. TMC'lerin Akış Sitometrisine Göre Fenotiliği
- Test edilmesi gereken her antikor karışım paneli için önceki çözeltiden 5 x 106 hücre alın ve 5 mL sitometri tüpüne yerleştirin. Lekesiz kontrol için 1 x 106 hücre alın.
- PBS ve santrifüjdeki hücreleri 4 °C'de 5 dk boyunca 400 x g'da yıkayın. 500 μL PBS (1 x 106 hücre/mL) ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika boyunca canlılık lekesi ile kuluçkaya yatırın.
- 100 μL hücre süspansiyonu başına 5 μL ısı inaktive edilmiş insan AB serumu ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- PBS + %2 FBS + 2 mM EDTA (Yıkama Tamponu) ve santrifüjdeki hücreleri 4 °C'de 5 dk için 400 x g'da yıkayın.
- Tablo 1'deayrıntılı olarak antikorları içeren 500 μL Yıkama Tampon'undaki TMC'leri yeniden askıya alın. Hücreleri karanlıkta 4 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 5 dk için 400 x g'de Yıkama Tamponu ve santrifüjdeki hücreleri yıkayın. Paraformaldehitin (PFA) %0.5'ini içeren 500 μL PBS'deki TMC'leri yeniden askıya alın. Akış sitometritarafından elde edilene kadar 4 °C'de karanlıkta tutun.
NOT: PfA tehlikelidir. %0,5 PFA çözümünü hazırlamak için kullanıma hazır ticari bir çözüm kullanın.
| Antikor | Klon | Florokrom | Şirket |
| Canlı Ölü | BV405 | ThermoFisher Bilimsel | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 | SK1 | Amcyan | BD Pharmingen |
| CD8 | BW135/80 | VioBlue | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 | HI30 | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 | Eçg | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 | Alexa Flor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 | Pasifik Mavisi | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | FITC | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c | 3.9 | Alexa Flor 700 | ebiyobilim |
Tablo 1: Akış sitometrisi ile hücre karakterizasyonu için antikorlistesi.
5. TMC'lerin Aktivasyonu ve Sitokin Üretiminin Ölçülmesi Örneği
- 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonelde etmek için R10 orta TMCs seyreltin.
- 400.000 TMC'yi 200 μL R10'da 96 yuvarlak alt plakaya dağıtın.
- Hücreleri etkinleştirmek için bir gecede TLR7/8 agonist resiquimod'un (R848) 5 μg/mL'sini ekleyin.
- Plakaları santrifüj edin ve TMC'lerin süpernatantını alın ve daha fazla analiz için dondurun. Sitokin üretimi, üreticinin protokolünü takiben bir akış sitometresi kullanılarak aynı anda birden fazla çözünen sitokinleri ölçmek için boncuk bazlı immünoaslar kullanılarak değerlendirilecektir.
- Üreticinin protokolünden sonra Parlak bir hücre canlılığı testini kullanarak hücrelerin canlılığını değerlendirin. Kısaca, kuyulara 60 μL hücre canlılığı çözeltisi ekleyin ve 10 dakika içinde parlaklığı ölçün (1 s/well için edinim).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak kültürde bulunan hücrelerin bağışıklık profilini karakterize ettik ve TMC miktarını analiz ettik. TMC'leri bademciklerden akış sitometrisi ile fenotiple ettik. Şekil 1'degösterildiği gibi, Kandan Gelen PBMCs mevcut tüm büyük bağışıklık hücresi tipleri bademcikler TMCs temsil edildi. Ancak, TMCs b hücreleri hariç tüm hücre türlerinin sıklığı, PBMCs daha düşüktü.
Şekil 1: Bademciklerde TMK'ların fenotiplemesi. Sağlıklı donörlerden TMC'ler, insan bademcik dokusunun diseksiyonu ve hücrelerin izolasyonu sonrasında elde edildi. (A) Hücreler lekelendi ve veriler akış sitometrisi tarafından elde edildi. Veriler temsili bir denemeyi temsil eder. (B) Tablo, altı farklı sağlıklı donörden bademcikler içinde canlı TMC'lerde her hücre tipinin yüzdesini özetler ve literatürde tanımlandığı gibi, kandan Her hücre tipiyüzdesi karşılaştırır18,19. Veriler canlı hücrelerin yüzdesi olarak gösterilir SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Daha sonra TMC'lerin immünolojik yanıtlarını test ettik. Bir hücrenin aktivasyonunu bir patojene karşı yeniden oluşturmanın bir yolu, Toll-Like Reseptörleri (TLR) ailesinden doğuştan gelen bağışıklık sensörlerini uyarmaktır. TLR'ler esas olarak monosit/makrofajlarda, tüm dendritik hücre (DC) alt tiplerinde, plazmasitoid dendritik hücrelerde (pDC) ve ayrıca B hücrelerinde mevcuttur. Bu örnekte, tlr7 ve TLR8'i inceledik, çünkü antiviral yanıtlar da uzmanlaşmıştır ve bademcik iltihabı vakalarının çoğu viral enfeksiyondan kaynaklanmaktadır. Böylece, yedi sağlıklı donörden bademciklerden (mavi grafik) tmc'ler bir gecede TLR7/8 ligand resiquimod (R848) ile uyarıldı. PBMCs (yeşil grafik) olduğu gibi, TLR7 / 8 sinyalleme yoluyla aktivasyon tip I interferonlar (IFN) ve pro-inflamatuar sitokinler üretimini tetikledi. Aslında, aktivasyon üzerine TMCs en yüksek üretilen sitokin IFNα, esas olarak viral enfeksiyona karşı doğuştan gelen bağışıklık dahil ve çoğunlukla pDC'ler tarafından üretilen tip I IFN ailesinin bir üyesi oldu. IFN2/3 ve IL-8 hariç test edilen tüm sitokinler TMK'lar tarafından üretildi, ancak PBMC'lerde daha düşük seviyelerde ydiler. Ayrıca, izole TMCs veya bademcik doku blokları tarafından daha önce açıklandığı gibi hazırlanan tarafından üretilen sitokin karşılaştırıldı6. Daha önce17 olarak tanımlanan STING-37 hücre hattı muhabiri tsay ını kullanarak her iki hücre kültürünün süpernatantında üretilen her türlü IFN türünü ölçtük ve sadece izole TMC'lerdeki IFN düzeylerini ölçebildiğimizi gösterdik.
Şekil 2: TMC'ler stimülasyon üzerine sitokinler üretti. (A)Saflaştırılmış ve izole TMCs (mavi) ve PBMCs (yeşil) R848 (5 μg/ mL) ile gecede uyarıldı. Supernatants alınır ve kullanıma kadar dondurulmuş. Bir boncuk bazlı immünoassay aynı anda bir akış sitometresi kullanılarak birden fazla çözünür sitokinler ölçmek için yapıldı. Grafikler ölçülen her sitokin in mililitre başına pikogramkonsantrasyonu temsil eder. Kat artışları grafiklerde kırmızı ile anons edilir. Mann-Whitney U testi. (B) Bademciklerden (mavi) ve bademcik doku bloklarından (turuncu) saflaştırılmış ve izole edilmiş TMK'ler Influenza A virüsü (IAV) ile 24 saat süreyle uyarıldı. Bir STING-37 muhabir hücre hattı teşrisi supernatant IFN üretimini ölçmek için kullanıldı. Kutu ve bıyık, ortalama ± minimum dan maksimuma kadar olan çizimler. Mann-Whitney U testi. P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = uyarılmayan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Son olarak, TMC'lerin uygulanabilirliğini test ettik. Hücre canlılığını ölçmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Burada, ışıldayan bir hücre canlılığı titreci, kolay ve hızlı iki adımlı bir titreşme kullandık. Şekil 3'tegösterildiği gibi, TBMC'lerde bileşim 1'in indüklediği sitotoksisiteyi açıkça tespit ettik, bu da PBMC'ler için toksik değildi. Böylece, TMCs test edilen ilaca karşı daha yüksek bir duyarlılık gösterdi.
Şekil 3: Bileşik 1 TMC'ler için toksikti. Saflaştırılmış ve izole TMC'ler ve PBMC'ler 1 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda bileşik 1 (C1) ile preincubated ve daha sonra R848 (5 μg/mL) ile bir gecede uyarıldı. Süpernatantlar alındı, 60 μL hücre canlılığı çözeltisi eklendi ve lüminesans ölçüldü. *, C1 ile NS karşılaştırmaistatistiksel analizi temsil eder. Kutu ve bıyık, ortalama ± minimum dan maksimuma kadar olan çizimler. Kruskal-Wallis, Dunn'ın sonrası hoc düzeltmesi ile test edildi. P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = uyarılmayan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan bademcikleri mukozal arayüzde doğuştan gelen immün yanıtları incelemek için bütünleştirici ve fizyolojik ex vivo modeli temsil eder, çünkü ikincil lenfoid organın rolünü taklit ederler. İlginçtir ki, TMCs hücresel bileşimi PBMCs benzer ve tüm büyük hücre popülasyonları içerir, onların yüzdesi kandan PBMCs farklı olabilir rağmen(Şekil 1). Ek popülasyonlar da bulunabilir, tüm bağışıklık yanıtları dokularda başlatılır gibi (mukoza veya sekonder lenfoid organlar) değil, kanda.
İnsan doku ekstremitelerinin kullanımının yanı sıra hücre kültürünün veya kan hücrelerinin kullanımının her birinin avantajları vardır. Ancak, çalışma sitokin salgısı ve hücre aktivasyonu için, doku eksültasyonları en iyi model değildi. Aslında, doku ekstrelerinin süpernatantında herhangi bir IFN üretimi tespit edilemedik (Şekil 2B). Doğrudan çevredeki hücreler tarafından tüketildiğini tahmin ediyoruz. Öte yandan, kan hücrelerinin uyarılması (PBMCs) enfeksiyona birincil yanıtı taklit edebilir ama dokularda neler olup bittiğini taklit etmez, sitokinlerin çoğu üretilen ve virüsler çoğalmak nerede. Bu nedenle, ikincil lenfoid doku, bademcik kaynaklanan hücreleri izole etmek ve arındırmak için bir protokol kurmak. TMC'leri sağlıklı insan bademciklerinden arındırdık, bu da bağışıklık hücresi aktivasyonunu stimülasyon üzerine araştırmamızı sağlıyor. Ancak, bu modelin sınırlamalarından biri, TMC'lerin TLR7/8 stimülasyon üzerine PBMCs ex vivo kadar pro-inflamatuar sitokin üretmemesidir, ancak önemli antiviral sitokin düzeyleri her iki kültürde de benzerdir.
TMC'ler ve PBMC'ler üzerinde bileşik toksisite çalışması, TMC'lerin toksik bir ilaca karşı daha duyarlı olduğunu ortaya koymuştur(Şekil 3). Bu nedenle, yeni ilaçların toksisitesi ve gelecekteki tedaviler dokulardan hücrelerde test edilmelidir ve sadece hücre hatları, PBMCs, veya doku eksplors. Bu nedenle, uyuşturucu testi için TMCs kullanımı açıklanan yöntemin gelecekteki bir uygulama gibi görünüyor.
Yetişkinlerden veya çocuklardan bademcikler açıklandığı şekilde elde edilebilir ve işlenebilir. Ancak, iki ana nedenden dolayı çocuklardan bademcik almanızı öneririz: 1) Çocuk bademcikleri yetişkinlerin20daha fazla hücre içerir. Gerçekten de, bademcik hipertrofisi özellikle çocuklarda yaygındır, çünkü daha fazla çocukluk virüsleri mücadele. Böylece, bu büyük bademcikler obstrüktif bademcikler haline gelebilir ve uyku apnesi gibi komplikasyonları önlemek için kısmi tonsillektomi ile kaldırılması gerekir13; 2) Yetişkinlerin bademcikleri genellikle kulak-burun-boğaz (KT) enfeksiyonları birkaç atak sonra kaldırılır çünkü, bu bademcikler daha az naif ve daha az hücre içerir.
Bademciklerin alınmasından sonra ideal olarak <3 saat sonra, bir an önce bademcikler üzerinde çalışmak önemlidir. Nitekim, çıkarıldıktan hemen sonra ve diseksiyona kadar, her iki taraftan bademcikler yaklaşık 20 mL PBS içeren 50 mL steril şişede bir arada tutulur, böylece tamamen batırılırlar.
Interdonör değişkenliği tekrarlanabilirlik için önemli bir sorun temsil edebilir. Gerçekten de, donörler arasında hücresel kompozisyon değişkenlik önemli olabilir. Protokolümüz, doku eksplorleri değil, TMC'ler kullanarak, tüm bademciklerden gelen hücreler kaplanıp kültüre yerleştirilmeden önce karıştırıldığı için bu değişkenliği sınırlar, doku eksplorleri ise hücresel bileşimde intradonör değişkenlik getirir, çünkü parçalar aynı numune nin farklı bölgelerinden gelir. Parsiyel tonsillektomi sadece noninflamed tonsils yapılabilir, hangi hastalar arasında inflamatuar durum değişkenliği sınırlar. Ayrıca farklı günlerde cerrahi olarak çıkarılan bademciklerin toplansAnızı öneririz. Cerrahlar arası ve gün ler arası variyetlerin interdonör değişkenliğinden daha yüksek olduğunu açıkça fark ettik (veriler gösterilmedi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P) tarafından desteklendi. H) deneyler ve N.B. bursu için (AAP 2017 166). N.S., ANRS'den burs (AAP 2016 1), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü EMBO for Fellowship (LT 834 2017), Ulm Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıp Fakültesi 'Baustein" ve Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1 1) için ANRS'den destek kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
