Summary
We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.
Abstract
Zwermen is een vorm van oppervlakte beweeglijkheid waargenomen bij veel bacteriële soorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli. Hier, dichte populaties van bacteriën bewegen zich over grote afstanden in karakteristieke rank-vormige gemeenschappen in de loop van uren. Zwermen is gevoelig voor verschillende factoren, waaronder medium vocht, vochtigheid, en het gehalte aan voedingsstoffen. Bovendien weerhoudt de collectieve stressrespons, die wordt waargenomen in P. aeruginosa die wordt benadrukt door antibiotica of bacteriofaag (faag), zwermen van het naderen van het gebied met de stress. De hier beschreven methoden gaan over hoe de kritische factoren die van invloed zijn op de zwermen te controleren. We introduceren een eenvoudige methode om de zwermdynamiek en de collectieve stressrespons met hoge temporele resolutie te monitoren met behulp van een flatbeddocumentscanner, en beschrijven hoe u een kwantitatieve analyse van zwermen compileren en uitvoeren. Deze eenvoudige en kosteneffectieve methode zorgt voor nauwkeurige en goed gecontroleerde kwantificering van zwermen en kan worden uitgebreid tot andere soorten op platen gebaseerde groeitesten en bacteriële soorten.
Introduction
Zwermen is een collectieve vorm van gecoördineerde bacteriële beweeglijkheid die de antibioticaresistentie en de productie van virulentiefactoren in gastheer1verhoogt ,2,3. Dit meercellige gedrag vindt plaats op semi-vaste oppervlakken die lijken op die van slijmlagen die epitheelmembranen in de longen4,5. Biosurfactants worden vaak geproduceerd door zwermpopulaties om de oppervlaktespanning op oppervlakken te overwinnen en de productie hiervan wordt gereguleerd door complexe celcelsignaleringssystemen, ook wel quorumdetectie6,7,8genoemd . Veel soorten bacteriën kunnen zwermen, waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, en Escherichia coli9,10,11,12. De zwermpatronen die door bacteriën worden gecreëerd, zijn divers en worden beïnvloed door de fysische en chemische eigenschappen van de oppervlaktelaag, waaronder de samenstelling van voedingsstoffen, porositeit en vocht13,14. Naast oppervlakte-eigenschappen beïnvloeden de groeitemperatuur en de luchtvochtigheid verschillende aspecten van de zwermdynamiek, waaronder zwermsnelheid en patronen12,13,14,15. De groeivariabelen die van invloed zijn op de zwermen creëren uitdagingen die de experimentele reproduceerbaarheid en het vermogen om resultaten te interpreteren beïnvloeden. Hier beschrijven we een eenvoudige gestandaardiseerde methode om de dynamiek van bacteriële zwermen te monitoren door middel van time-lapse beeldvorming. De methode beschrijft hoe kritieke groeiomstandigheden die de progressie van zwermen aanzienlijk beïnvloeden, kunnen worden onder controle. Vergeleken met traditionele methoden van zwermanalyse, maakt deze time-lapse imaging methode het mogelijk om de beweeglijkheid van meerdere zwermen gelijktijdig te volgen tijdens langere perioden en met hoge resolutie. Deze aspecten verbeteren de diepte van de gegevens die kunnen worden verkregen uit monitoring zwermen en vergemakkelijken de identificatie van factoren die van invloed zijn zwermen.
Zwermen in P. aeruginosa wordt vergemakkelijkt door de productie en afgifte van rhamnolipiden en 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic zuren in de omgeving6,16. De introductie van stress door sub-dodelijke concentraties van antibiotica of infectie door faagvirus heeft gevolgen voor de organisatie van zwermen. In het bijzonder leiden deze spanningen ertoe dat P. aeruginosa het quorumdetectiemolecuul 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolon vrijgeeft, ook wel bekend als het Pseudomonas quinolone signaal (PQS)17,18. In zwermtesten die twee populaties zwermen bevatten, pqs geproduceerd door de stress-geïnduceerde bevolking afstoot onbehandelde zwermen van het invoeren van het gebied met de stress (Figuur 1). Deze collectieve stressrespons vormt een signaalsysteem voor gevaarcommunicatie dat P. aeruginosa waarschuwt voor bedreigingen in de buurt18,19. De effecten van stress op P. aeruginosa, de activering van de collectieve stressrespons en de afstoting van zwermen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de time-lapse beeldvormingsmethode die hier wordt beschreven. Het protocol dat hier wordt beschreven legt uit hoe: (1) agarplaten voorbereiden op zwermen, (2) cultuur P. aeruginosa voor twee soorten tests (traditionele zwermen de assays of collectieve stressresponstesten) (Figuur 1), (3) verkrijg time-lapse beelden, en (4) imagej gebruiken om de beelden samen te stellen en te analyseren.
Kortom, P. aeruginosa uit een nachtelijke cultuur wordt gespot in het midden van een zwermen agar plaat, terwijl P. aeruginosa die besmet zijn met faag of behandeld met antibiotica worden gespot op de satelliet posities. De progressie van P. aeruginosa zwermen wordt gecontroleerd op een consumentendocument flatbed scanner die wordt geplaatst in een vochtigheid geregeld37 °C incubator. De scanner wordt aangestuurd door een software die automatisch scant de platen op regelmatige tijdstippen over de zwerm groeiperiode, meestal 16-20 uur. Deze methode levert gelijktijdige time-lapse video's op van maximaal zes 10 cm zwermplaten. De beelden worden gecompileerd in films en de afstoting van zwermen door stress-geïnduceerde populaties wordt gekwantificeerd met behulp van vrij beschikbare ImageJ software. Er wordt speciale aandacht besteed aan de consistentie en reproduceerbaarheid tussen de verschillende zwermexperimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding Swarming Agar Platen voor P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Bereid 1 L van 5x M8 minimale media in een glazen fles door toevoeging van 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4,en 2,5 g NaCl in 500 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Pas het uiteindelijke volume aan op 1 L met extra ddH2O. Autoclave om vloeibare media bij kamertemperatuur te steriliseren en op te slaan.
- Bereid 100 mL van 1 M MgSO4 (magnesiumsulfaat) in een glazen fles door 24,6 g MgSO4•7H2O in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Autoclave te steriliseren. Bewaar op kamertemperatuur.
- Bereid 100 mL casaminozuren in een glazen fles door 20 g casaminozuren toe te voegen in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Autoclave om te steriliseren. Bewaar op kamertemperatuur.
- Bereid 100 mL van 20% glucose in een glazen fles door toevoeging van 20 g glucose in 50 mL ddH2O. Pas het uiteindelijke volume aan tot 100 mL met extra ddH2O. Steriliseren door filtratie met 0,22 μm filter. Bewaar op kamertemperatuur.
- Om 10 zwermen agar platen, voeg 1 g agar in 100 mL van ddH2O en het laatste volume aan te passen tot 160 mL met extra ddH2O in een 250 mL Erlenmeyer kolf. Steriliseren door autoclaven.
- Plaats onmiddellijk na autoclaven de agar-oplossing gedurende 15 min in een waterbad van 55 °C.
- Haal de agar-oplossing uit het waterbad en voeg 40 mL van 5x M8 minimummedia, 200 μL van 1 M MgSO4,2 mL van 20% glucose en 5 mL van 20% casaminozuren15toe. Ga onmiddellijk na het mengen naar stap 1.6.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zijn 0,5% agar, 1 mM MgSO4,0,2% glucose en 0,5% casaminozuren.
- Met behulp van een 25 mL pipet voor consistent volume, voeg 20 mL van de zwermen agar oplossing per 10 cm diameter Petri dish.
OPMERKING: Een vast volume van de agar-oplossing is belangrijk, omdat het volume de droogtijd en het vochtgehalte van de agar beïnvloedt. Vermijd bubbels bij het maken van de zwermen agar platen. - Laat de agar stollen door het plaatsen van de zwermen agar platen in een enkele stapel met deksels op voor 1 uur op de bank bij kamertemperatuur. Schakel de ontvochtiger in om de relatieve vochtigheid van de kamer te verlagen tot 40-50% 1 uur voor de volgende stap.
- Droog de zwermen agar platen voor een extra 30 min met de deksels af in een laminaire stroom kap op 300 ft3/ min met 40-50% relatieve vochtigheid bij kamertemperatuur. Droog het interieur van de deksels door ze gezicht omhoog in de laminaire stroomkap. Bewaar zwermen agar platen op 4 °C voor maximaal 24 uur.
- Bereid zwarte 10 cm petrischaaldeksels voor beeldvorming door de binnenkant van het deksel glad te strijken met schuurpapier. Doe de deksels in een verpakkingsdoos en leg de verpakkingsdoos onder een chemische kap. Spray in de deksels met behulp van zwarte spuitverf. Laat de deksels drogen.
LET OP: Zwarte deksels kunnen opnieuw worden gebruikt voor extra experimenten. Het is belangrijk dat de deksels zo zijn geschilderd dat ze geen licht reflecteren tijdens het scannen.
2. Groei van P. aeruginosa en Plating Conditions
- Bereid 400 mL lysogene bouillon (LB) door 10 g LB-Miller poedermix toe te voegen tot 400 mL ddH2O. Voor 2% LB-agar Petri gerechten, voeg een extra 8 g agar. Autoclave te steriliseren.
- Giet 20 mL gesmolten LB-agar medium in petrischaaltjes met een diameter van 10 cm en laat ze 's nachts bij kamertemperatuur stollen. Bewaar vloeibare media bij kamertemperatuur en agarplaten op 4 °C.
- Streep P. aeruginosa op een LB-agar Petri schaal uit een bevroren voorraad opgeslagen bij -80 °C met behulp van steriele lussen of houten stokken. Incubeer het petrischaaltje 's nachts ondersteboven bij 37 °C. Bewaar LB-agar plaat op 4 °C voor maximaal 1 week.
- Kies een enkele kolonie uit de petrischaal met een steriele lus of houten stok, inent het in 2 mL LB medium en incubeer de cultuur tot verzadiging 's nachts (16-18 uur) bij 37 °C in een roller drumset bij 100 rpm.
- Pipet 5 μL van 's nachts cultuur van stap 2.4 met behulp van een P20 pipet en ter plaatse in het midden van de zwermen agar plaat door het naderen van de pipet tip onder een hoek (10-45 °) 2,5 cm boven het spotting gebied, pipetteren naar beneden naar de eerste halte, en het aanraken van de agar met alleen de vloeibare daling (Figuur 1B).
- Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een sjabloon om de spot consistent te positioneren over verschillende zwermen agar platen (Aanvullende figuur S1).
- Voor traditionele zwermen testen, gebruik alleen het centrum plek en overslaan naar stap 2.8. Voor collectieve stressresponstesten blijven stap 2.6 (voor faaginfectie) of stap 2.7 (voor antibioticastress).
- Meng voor faaginfectie 30 μL nachtkweek van P. aeruginosa vanaf stap 2.4 met 6 μL van 1 x 1012 pfu/mL faag DMS3vir20. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
- Pipet 6 μL van de P. aeruginosa-faagmengselvanaf stap 2.6 met behulp van een P20-pipet en spot op 6 equidistant satellietposities op een concentrische cirkel van 2,8 cm straal die gecentreerd is op de petrischaal door de pipetpunt onder een hoek (10 tot 45°) 2,5 cm boven het spotting-gebied te benaderen, naar beneden te pipetteren tot de eerste stop en de agar aan te raken met alleen de vloeibare druppel (Figuur 1C).
- Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een beplatingssjabloon voor consistentie(Aanvullende figuur S1). Ga naar stap 2.8.
- Voor antibioticabehandelingen, meng 30 μL nachtcultuur P. aeruginosa vanaf stap 2.4 met 6 μL van 3 mg/mL gentamycine, 10 μL van 100 mg/mL kanamycine, of 7,5 μL van 100 mg/mL fosfomycine. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
- Pipet 6 μL van antibiotica behandeld P. aeruginosa van stap 2.7 met behulp van een P20 pipet en spot op 6 equidistant satelliet posities op een 2,8 cm straal concentrische cirkel over het midden van de schotel door het naderen van de pipet tip in een hoek (10 tot 45 °) 2,5 cm boven het gebied spotten, pipetteren naar beneden naar de eerste halte, en het aanraken van de agar met alleen de vloeibare druppel (Figuur 1D).
- Vermijd het aanraken van de agar met de pipet tip als het beschadigt de agar. Gebruik een beplatingssjabloon voor consistentie(Aanvullende figuur S1). Ga naar stap 2.8.
- Vervang de heldere petrischaaldeksels door zwarte deksels gemaakt in stap 1.9(figuur 2A).
- Plaats de zwermende agarplaten op een scanner in een couveuse op 37 °C met een waterbad van 10 L om de luchtvochtigheid op 75% te houden (Figuur 1E, figuur 2B).
LET OP: Verstoor gevlekte cellen op de zwermen de agarplaten niet. Houd platen naar boven te allen tijde.
3. Beeldverwerving met scanner
- Verlaag de sfeerverlichting van de petrischaaltjes door zwarte matte stof aan een rek te bevestigen dat 40-60 cm boven de flatbeddocumentscanner ligt. Beveilig het met behulp van zip-ties(figuur 2B).
- De scanner wordt aangestuurd met behulp van een scansoftware en een automatische scriptsoftware.
- Selecteer in de scansoftware de homemodus (figuur 3A). Maak afbeeldingen in kleur vast door Kleur te selecteren onder Afbeeldingstype. Als u de beeldkwaliteit wilt instellen, selecteert u Andere onder Bestemming en past u de resolutie aan op 300 dpi. Houd de standaardgrootte voor de afbeeldingen behouden door Origineel voor doelgrootte teselecteren. Laat alle opties onder Afbeeldingsaanpassingen onaangevinkt voor standaardbeeldkwaliteit.
OPMERKING: Doelgrootte is standaard ingesteld op Origineel. Als u andere opties voor doelgrootte wilt selecteren, klikt u eerst op Voorbeeld.
- Selecteer in de scansoftware de homemodus (figuur 3A). Maak afbeeldingen in kleur vast door Kleur te selecteren onder Afbeeldingstype. Als u de beeldkwaliteit wilt instellen, selecteert u Andere onder Bestemming en past u de resolutie aan op 300 dpi. Houd de standaardgrootte voor de afbeeldingen behouden door Origineel voor doelgrootte teselecteren. Laat alle opties onder Afbeeldingsaanpassingen onaangevinkt voor standaardbeeldkwaliteit.
- Stel het opslaande pad van afbeeldingen in door op het mappictogram rechts van Scan te klikken om Instellingen voor opslaan bestand te openen (figuur 3A).
- Selecteer de mapbestemming voor het opslaan van afbeeldingen door Andere te selecteren onder Locatie en klik op Bladeren. Kies een map om de afbeeldingen op te slaan.
- Geef de afbeeldingen een naam in het tekstvak Voorvoegsel. Stel Startnummer 001 in om de naamgevingsvolgorde voor de afbeeldingen te beginnen. Stel de bestandsindeling in op JPEG door JPEG (*.jpg) te kiezen voor Tekst onder Afbeeldingsindeling en klik op Opties om aan te passen voor details. Stel de beeldkwaliteit in door compressieniveau aan te passen op 16, Codering op Standaard en schakel ICC-profiel insluitenin. Klik op OK om het venster te sluiten(figuur 3B).
- Laat de eerste optie onaangevinkt ('Alle bestanden met dezelfde naam overschrijven') en controleer de 3 volgende opties ('Dit dialoogvenster weergeven voordat volgende scan' wordt gemaakt, 'Afbeeldingsmap openen na het scannen' en 'Pagina weergeven na het scannen'). Klik op OK om het venster te sluiten
- Controleer de beeldkwaliteit door op Voorbeeldte klikken . Het voorbeeldvenster wordt weergegeven en het pictogram Scannen wordt functioneel(figuur 3C).
- Gebruik de scriptingsoftware om de beeldacquisitie te automatiseren. Het meegeleverde script klikt op Scan in het venster Scannen en OK in het venster Instellingen voor bestandsopslag met intervallen van 30 minuten.
- Het script importeren door op Taak te klikken | Importeer en selecteer zowel Single_scan.tsk als Idle_scanning.tsk (TSK-bestanden die worden aangeboden als aanvullende bestanden 1 en 2). Zie figuur 3D.
OPMERKING: Single_scan.tsk klikt op de knop Scannen in het venster Scannen en OK in het venster Instellingen voor opslaan van bestanden. Idle_scanning.tsk activeert Single_scan.tsk om de 30 min. Men kan de scanfrequentie wijzigen door de activering van Idle_scanning.tsk tewijzigen. - Automatisch scannen inschakelen met intervallen van 30 minuten door zowel Idle scanning (geïmporteerd) als Single scan (geïmporteerd)te selecteren, met de rechtermuisknop te klikken op Idle scannen (geïmporteerd)en links te klikken op Ingeschakeld (figuur 3D, Aanvullende figuur S2).
OPMERKING: Automatisch scannen wordt uitgevoerd totdat de gebruiker het script handmatig stopt. Als u het script wilt stoppen, selecteert u Niet-actief scannen (geïmporteerd)en klikt u met de rechtermuisknop op Niet actief scannen (geïmporteerd)en klikt u links op Ingeschakeld. Het vinkje wordt verwijderd.
- Het script importeren door op Taak te klikken | Importeer en selecteer zowel Single_scan.tsk als Idle_scanning.tsk (TSK-bestanden die worden aangeboden als aanvullende bestanden 1 en 2). Zie figuur 3D.
4. Het samenstellen van time-lapse beelden en het meten van zwerm afstoting
- Filmbewerking en beeldanalyse uitvoeren met ImageJ.
- Alle gescande afbeeldingen importeren in ImageJ door op Bestand te klikken | Invoer | Afbeeldingsvolgorde en selecteer de afbeeldingen. Schakel in het venster Reeksenopties de optie Converteren naar RGB in om afbeeldingen in kleur te houden. Het aantal afbeeldingen geeft het aantal geselecteerde afbeeldingen aan.
- Houd De afbeelding starten op 1 om te beginnen vanaf de eerste afbeelding in de map en Afbeeldingen op 100% schalen om de oorspronkelijke grootte van de afbeeldingen te behouden. Laat Virtuele stapel gebruiken onaangevinkt. Klik op OK en wacht tot afbeeldingen zijn geladen(figuur 4A).
- Stel het videocompressieniveau in op 100 door op Bewerken te klikken | Opties | Invoer/uitvoer... en pas de JPEG-kwaliteit aan op 100.
- Sla het bestand op als een .avi door op Bestand te klikken | Behoudenals | AVI. Compressie aanpassen aan JPEG en framesnelheid tot 5 fps(figuur 4B). Sla de time-lapse van .avi op in de gewenste map.
- Als u de szwermafstotingsafstanden wilt kwantificeren, opent u een afbeelding aan het einde van de zwermperiode in ImageJ. Klik op Bestand | Open en selecteer de afbeelding. De schaal aanpassen door op Analyseren te klikken | Schaal instellen en Afstand instellen in pixels op 118, Bekende afstand tot 1, Pixel-beeldverhouding op 1,0 en Eenheid van lengte tot cm(figuur 4C). Laat Global ongecontroleerd. Klik op OK om het venster te sluiten.
- Klik op het rechte pictogram en meet vanaf het midden van de kolonie op de satellietpositie tot aan de rand van de zwermende populatie. Analyseren selecteren | Meten om een nieuw venster te laten verschijnen met de metingen (Lengte)(figuur 4D).
OPMERKING: Gebruik '+' om dichterbij in te zoomen en '-' om uit te zoomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stappen om P. aeruginosate kweken, benadrukken de cellen, en beeld de zwermende agar platen zijn vertegenwoordigd in figuur 1. We inenten een enkele kolonie van wild-type P. aeruginosa UCBPP-PA14 stam van een LB-agar plaat in 2 mL lb bouillon 's nachts op 37 °C en gespot 5 μL in het midden van de zwermen agar plaat. Time-lapse beeldvorming van deze plaat onthult de eerste groei in de vorm van een kolonie in het midden en vervolgens verspreiden van ranken radiaal uit de kolonie (Video 1). Voor collectieve stressresponstesten wordt naast het spotten van P. aeruginosa in het midden 30 μL van dezelfde nachtcultuur gemengd met 6 μL van 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir of 6 μL van 3 mg/mL gentamycine bij een verhouding van 5:1 en 6 μL wordt gespot op de satellietposities. Zwermen verplaatsen zich van het midden van de zwermen agar platen naar de periferie en worden afgestoten door een stress signaal uitgezonden door de bacteriën die besmet waren met fagen (Video 2,bovenste linker plaat) of behandeld met gentamycine (Video 2, rechtsboven plaat). Fagen (Video 2, linkeronder plaat) of gentamycine (Video 2, rechtsonder plaat) alleen gespot op de satelliet posities veroorzaken niet zwermen populaties om deze gebieden te vermijden.
Figuur 1: Schematisch van de P. aeruginosa zwermen assay en collectieve stress respons. (A) P. aeruginosa cellen worden 's nachts gekweekt (16-18 uur tot OD600 van ongeveer 1,5) in LB bouillon bij 37 °C en (B) gespot in het midden van de zwermen de agar plaat. 's Nachts culturen worden gemengd met (C) fagen of (D) antibiotica en gespot op de satelliet posities voor collectieve stress respons testen. (E) Tot 6 platen zijn afgebeeld op een scanner op 30 minuten intervallen voor 16-18 uur bij 37 °C. Na 18 uur vermijden P. aeruginosa zwermpopulaties (F)cellen die besmet zijn met faag of (G)cellen die met antibiotica worden behandeld (gentamycine). (H) P. aeruginosa populaties zwerm over de zwermen agar plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Scanner opstelling in de incubator. (A) Zwarte petrischaaldeksels gebouwd in punt 1. Deze deksels worden gebruikt tijdens het scannen om lichtreflecties te verminderen en te vervangen duidelijke petrischaal deksels. BB) De flatbeddocumentscanner wordt geplaatst in een couveuse van 37 °C. Op de scanner (linkerafbeelding) worden zes platen met zwarte deksels geplaatst. Zwarte matte stof is bevestigd aan het rek 60 cm boven de scanner om reflecties en strooilicht (rechter afbeelding) verder te verminderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Geautomatiseerde beeldverwerving van de flatbeddocumentscanner met behulp van de scan- en automatische scriptsoftware. (A) Screenshot van de belangrijkste scan venster. Selectie van afbeeldingstype (kleur) en resolutie (300 dpi). Het rode vierkantgeeft het mappictogram aan om het venster Instellingen voor opslaan van bestanden te openen. Let op: de knop Voorbeeld kan worden ingedrukt, maar de knop Scannen is uitgeschakeld. (B) Schermafbeelding van het venster Instellingen voor bestandsopslag om mapbestemming in te stellen voor het opslaan van afbeeldingen, het benoemen van de afbeeldingen en het kiezen van de indeling van de afbeeldingen (links). Het venster Insteekinstellingen wordt gebruikt om de beeldkwaliteit (rechts) in te stellen. (C) Schermafbeelding van het venster Scannen na het klikken op Voorbeeld. De knop Scannen is klikbaar nadat een voorbeeld is aangeschaft. Het programma kan nu worden geautomatiseerd met behulp van de scripting software (Materialen). (D) Schermafbeelding van de scriptsoftwarevensters die de knop Importeren aangeven die wordt gebruikt om de automatiseringsscripts te importeren (links). Zodra Single_scan.tsk en Idle_scanning.tsk zijn geïmporteerd, worden deze weergegeven als taken in het hoofdvenster (rechts). Nadat u beide taken hebt geselecteerd en er met de rechtermuisknop op hebt geklikt, wordt de knop Ingeschakeld weergegeven. Links klikken op Inschakelen start de scripts om automatisch te scannen met intervallen van 30 minuten (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Beeldanalyse van zwermen vermijden met behulp van ImageJ. (A) Stappen om een afbeeldingsreeks te importeren uit de tijdsverkeeringsscannerafbeeldingen. Klikken op Bestand | Invoer | Image Sequence in het hoofdimagej-venster (links) brengt het venster Vervolgopties (rechts) naar boven en opent alle gescande afbeeldingen. Het rode vierkantgeeft de aangevinkte optie aan om afbeeldingen in RGB-indeling te laden. Alle andere opties blijven als standaard. (B) Stappen om de time-lapse video op te slaan in AVI-formaat. Selecteerbestand | Behoudenals | AVI brengt het Venster Opslaan als AVI naar boven. Compressie is ingesteld op JPEG en Frame Rate op 5 fps. (C) De schaaleenheden instellen voor afbeeldingen. Analyseren selecteren | Als u Schaal instelt, wordt het venster Schaal instellen ingesteld. Voor 300 dpi-afbeeldingen is de juiste schaal 118 pixels/cm. (D) Meting van vermijding van zwermpopulaties. Een gele lijn wordt getrokken van het centrum van de beklemtoonde kolonies aan de rand van de ranken. Analyseren selecteren | Meten rapporteert de lengte van de regel in een nieuw venster met het label Resultaten. Ctrl + M is een sneltoets die de meting uitvoert zonder de menu-items te selecteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve zwermen van P. aeruginosa. P. aeruginosa zwermen populaties op zwermen agar platen die (A) droog, (B) normaal, (C) vochtig, en (D) extra vochtig. Droge zwermen agar platen remmen de zwerm snelheid van P. aeruginosa en verminderen het aantal ranken. Vochtige zwermen agar platen veroorzaken vorming van grote ranken. Onder extra vochtige omstandigheden vormen ranken zich ongelijk door de zwermende agarplaten. Droogtijden in de laminaire stroomkap en luchtvochtigheid hebben aanzienlijke effecten op het vochtgehalte van de zwermplaat. De gerechten zijn 10 cm petrischaaltjes. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: Time-lapse film van zwermen. Wild-type P. aeruginosa werden gespot in het midden van de zwermplaat en werden afgebeeld op de scanner in de loop van 22 uur. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: Time-lapse film van de collectieve stressrespons. Wild-type P. aeruginosa werden gespot in het midden van de zwermplaat. Satellietposities werden gespot met P. aeruginosa die bovendien worden gemengd met (linksboven) faag of (rechtsboven) gentamycine, of uitsluitend gespot met (linksonder) faag of (rechtsonder) gentamycine. Witte stippen geven het midden van de vlekken aan. Platen werden afgebeeld in de loop van 16 uur. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende figuur S1: Plating sjabloon voor het spotten van P. aeruginosa cellen. De middelste zwarte stip vertegenwoordigt het spotting area van 5 μL 's nachts P. aeruginosa cultuur. De straal van de binnenste cirkel bevindt zich op 2,8 cm afstand van het midden van de plaat. Het snijpunt tussen de binnenste cirkel en de rechte lijnen over de buitenste cirkel geeft het spotting area van 6 μL van gestreste P. aeruginosa,faag besmet of antibiotica behandelde cellen. De buitenste cirkel vertegenwoordigt de omtrek van 10 cm petrischaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur S2: Macroopdrachten om periodiek te beginnen met scannen met behulp van een scriptsoftware. (A) De macroopdrachten in Single_scan.tsk verplaatst de cursor naar Scan in het scanvenster, klikt op Scannen, gaat naar OK in het venster Instellingen voor bestandsopslag en klikt op OK. (B) Opdrachten om intervallen van 30 minuten te scannen. De taak Idle_scanning.tsk begint Single_scan.tsk en is ingesteld om te activeren in intervallen van 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol richt zich op het minimaliseren van de variabiliteit in zwermen agar platen en het verstrekken van een eenvoudige en low-cost methode om time-lapse beelden van P. aeruginosa zwermen en reageren op stress te verwerven. Deze procedure kan worden uitgebreid tot het beeld van andere bacteriële systemen door het aanpassen van de media samenstelling en groeivoorwaarden. Voor P. aeruginosa, hoewel M9 of FAB minimaal medium kan worden gebruikt om zwermen te induceren16,21, het protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van M8 medium met casaminozuren, glucose, en magnesiumsulfaat6. P. aeruginosa zwermen is gevoelig voor gemiddelde samenstelling, zoals ijzer beschikbaarheid en voedingsstoffen bronnen met inbegrip van aminozuren22,23,24. Daarom illustreert de selectie van media voor zwermen agarplaten een belangrijk aspect van de assaying zwermbeweeglijkheid.
Controle voor de vochtigheid en temperatuur in een open laboratoriumgebied vormt een van de grootste uitdagingen voor de consistentie van zwermtesten. Seizoensgebonden veranderingen dragen bij aan variabiliteit in de zwermen agar platen vocht, die aanzienlijk kan invloed hebben zwermpatronen. Daarom is constante controle van de relatieve vochtigheid vereist om een optimale plaatkwaliteit te garanderen. Het starten van de ontvochtiger 1 uur voor het drogen van de zwermen agar platen onder de laminaire stroomkap zal de relatieve vochtigheid tot een constante 45%, houden droogtijd tot 30 min. Als omgevingsvocht niet kan worden gecontroleerd, is het verhogen van de droogtijd een potentiële eenvoudige oplossing om vochtige omgevingen te compenseren. Tijdens het zwermen moet de relatieve vochtigheid op 70% blijven in de 37 °C incubator om te voorkomen dat de agarplaten uitdrogen. Een onafgetopte bak water in de couveuse kan dienen als een waterreservoir. Droge zwermen agar platen vertragen de progressie van zwermen populaties en verminderen het aantal ranken, terwijl vochtige platen veroorzaken brede rank structuur(figuur 5A–C). Extra vochtige zwermen agar platen voorkomen duidelijke rank vorming en veroorzaken de ranken te verspreiden in een ongelijk patroon (Fig 5D). De hier beschreven methode kan worden gebruikt om een constante vochtige omgeving te behouden die de consistentie van zwermen op platen zal garanderen(figuur 5B, Video 1). Daarnaast spelen de plaatgrootte en de agardikte een rol bij het vasthouden van vocht in de plaat. We hebben petrischaaltjes met een diameter van 10 cm gebruikt en 20 mL zwermagar-oplossing per plaat toegevoegd om consistentie te garanderen. Gietplaten zonder volume te meten wordt afgeraden. Vanwege de vele variabelen die de zwermen deas beïnvloeden, raden we aan om de test te optimaliseren voor lokale laboratoriumomstandigheden en benadrukken we het belang van het uitvoeren van meerdere biologische replicaties op afzonderlijke batches van platen om consistente en vergelijkbare zwermpatronen te observeren.
Het voordeel van de time-lapse imaging methode om zwermen beweeglijkheid op te nemen is de mogelijkheid om de progressie van de beweeglijkheid te observeren zonder de noodzaak om de zwermen te verstoren. Onze methode creëert gemakkelijk time-lapses van 6 platen tegelijk onder dezelfde omstandigheden, die zowel een gecontroleerde omgeving biedt voor de gelijktijdige beoordeling van meerdere stammen, meerdere experimentele omstandigheden, of biologische repliceert. Het gebruik van zes satellietposities op elke plaat vergemakkelijkt bovendien de statistische analyse en het gebruik van ImageJ maakt de kwantificering van zwermen afstoting mogelijk.
De hier beschreven procedure is een eenvoudige methode om de interactie tussen subpopulaties van P. aeruginosate bestuderen: een gezonde zwermende populatie en gestreste cellen. Naast DMS3vir en gentamycine kunnen extra soorten fagen, antibiotica en concurrerende bacteriën of schimmels worden gebruikt om stresssignalen te bestuderen. Hoewel deze methode zich richt op P. aeruginosa zwermen beweeglijkheid, andere bacteriële soorten zoals S. aureus en E. coli vertonen ook zwermpatronen, maar ze vereisen aangepaste media omzwerm 10,11. Door het optimaliseren van de media samenstellingen en plaat voorwaarden, deze methode kan worden toegepast om zwermen, zwermen interacties tussen bacteriële stammen, en stress reacties te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., en N.M.H-K. schreef en herzag het manuscript. Alle auteurs ontwierpen de experimenten. J.-L.B. voerde de experimenten en analyses uit. Dit werk werd ondersteund door de NIH award K22AI112816 en R21AI139968 subsidie aan A.S. en door de Universiteit van Californië. N.M.H-K. werd ondersteund door Lundbeck Fellowships R220-2016-860 en R251-2017-1070. De financiers hadden geen rol in het besluit om het werk voor publicatie in te dienen. We hebben geen concurrerende belangen te verklaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
