Summary

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

Published: May 23, 2020
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Summary

Wir beschreiben eine einfache Methode, um hochauflösende Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren, die mit einem Flachbett-Dokumentenscanner auf Bakteriophage (Phagen) und Antibiotikastress reagieren. Dieses Verfahren ist eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Schwärmedynamik und kann angepasst werden, um die Beweglichkeit und das Wachstum anderer Bakterienarten zu untersuchen.

Abstract

Schwärmen ist eine Form der Oberflächenbeweglichkeit, die bei vielen Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia colibeobachtet wird. Hier bewegen sich dichte Bakterienpopulationen im Laufe der Stunden über große Entfernungen in charakteristischen rankenförmigen Gemeinschaften. Das Schwärmen ist empfindlich gegenüber mehreren Faktoren, einschließlich mittlerer Feuchtigkeit, Feuchtigkeit und Nährstoffgehalt. Darüber hinaus wehrt die kollektive Stressreaktion, die bei P. aeruginosa beobachtet wird, die durch Antibiotika oder Bakteriophagen (Phagen) gestresst sind, Schwärme ab, sich dem Bereich zu nähern, der den Stress enthält. Die hier beschriebenen Methoden befassen sich mit der Kontrolle der kritischen Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen. Wir führen eine einfache Methode ein, um die Schwärmedynamik und die kollektive Stressreaktion mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Flachbett-Dokumentenscanner zu überwachen und zu beschreiben, wie eine quantitative Analyse von Schwärmen kompiliert und durchgeführt wird. Diese einfache und kostengünstige Methode ermöglicht eine präzise und gut kontrollierte Quantifizierung des Schwarms und kann auf andere Arten von plattenbasierten Wachstumstests und Bakterienarten ausgedehnt werden.

Introduction

Schwärmen ist eine kollektive Form der koordinierten bakteriellen Beweglichkeit, die Antibiotikaresistenz und Produktion von Virulenzfaktoren im Wirt1,2,3erhöht. Dieses multizelluläre Verhalten tritt auf halbfesten Oberflächen auf, die denen von Schleimschichten ähneln, die Epithelmembranen in der Lungeabdecken 4,5. Biosurfactants werden üblicherweise von Schwärmepopulationen produziert, um die Oberflächenspannung auf Oberflächen zu überwinden, und die Produktion dieser stoffe wird durch komplexe Zell-Zell-Signalsysteme reguliert, auch bekannt als Quorum-Sensing6,7,8. Viele Arten von Bakterien sind in der Lage zu schwärmen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, und Escherichia coli9,10,11,12. Die von Bakterien erzeugten Schwarmmuster sind vielfältig und werden durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberflächenschicht beeinflusst, einschließlich Nährstoffzusammensetzung, Porosität und Feuchtigkeit13,14. Neben den Oberflächeneigenschaften beeinflussen Wachstumstemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit verschiedene Aspekte der Schwärmedynamik, einschließlich Schwarmrate und Muster12,13,14,15. Die Wachstumsvariablen, die das Schwärmen beeinflussen, schaffen Herausforderungen, die sich auf die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit zur Interpretation von Ergebnissen auswirken. Hier beschreiben wir eine einfache standardisierte Methode, um die Dynamik von Bakterienschwärmen durch Zeitraffer-Bildgebung zu überwachen. Die Methode beschreibt, wie kritische Wachstumsbedingungen gesteuert werden können, die das Fortschreiten des Schwärmens erheblich beeinflussen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Schwarmanalyse ermöglicht diese Zeitraffer-Bildgebungsmethode die gleichzeitige Verfolgung der Beweglichkeit mehrerer Schwärme während längerer Zeiträume und mit hoher Auflösung. Diese Aspekte verbessern die Tiefe der Daten, die durch die Überwachung von Schwärmen gewonnen werden können, und erleichtern die Identifizierung von Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen.

Das Schwärmen in P. aeruginosa wird durch die Herstellung und Freisetzung von Rhamnolipiden und 3-(3-Hydroxyalkanoyloxy)alkanoic Säuren in die Umgebung 66,16erleichtert. Die Einführung von Stress aus subtödlichen Konzentrationen von Antibiotika oder Infektionen durch Phagenviren wirkt sich auf die Organisation von Schwärmen aus. Insbesondere veranlassen diese Spannungen P. aeruginosa, das Quorum-Sensing-Molekül 2-Heptyl-3-hydroxy-4-chinolon, auch bekannt als Pseudomonas-Chinolonsignal (PQS)17,18,freizusetzen. In Schwarm-Assays, die zwei Populationen von Schwärmen enthalten, wehrt PQS, die von der stressinduzierten Population produziert werden, unbehandelte Schwärme ab, die in das Gebiet eindringen, das den Stress enthält (Abbildung 1). Diese kollektive Stressreaktion stellt ein Gefahrenkommunikationssignalsystem dar, das P. aeruginosa vor nahegelegenen Bedrohungen warnt18,19. Die Auswirkungen von Stress auf P. aeruginosa, die Aktivierung der kollektiven Stressreaktion und die Abstoßung von Schwärmen können mit der hier beschriebenen Zeitraffer-Bildgebungsmethode visualisiert werden. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie: (1) Agarplatten für schwärmen, (2) Kultur P. aeruginosa für zwei Arten von Assays (traditionelle Schwarm-Assays oder kollektive Stressreaktions-Assays) (Abbildung 1), (3) Zeitrafferbilder erfassen und (4) ImageJ zum Kompilieren und Analysieren der Bilder verwenden.

Kurz gesagt, P. aeruginosa aus einer Nachtkultur wird in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet, während P. aeruginosa, die mit Phagen infiziert oder mit Antibiotika behandelt werden, an den Satellitenpositionen gesichtet werden. Das Fortschreiten des P. aeruginosa-Schwarms wird auf einem Verbraucherdokument-Flachbettscanner überwacht, der in einem feuchtigkeitsregulierten 37 °C-Inkubator platziert wird. Der Scanner wird von einer Software gesteuert, die die Platten in regelmäßigen Abständen über die Schwarmwachstumsphase, in der Regel 16 bis 20 H, automatisch scannt. Diese Methode liefert gleichzeitige Zeitraffervideos von bis zu sechs 10 cm Schwarmplatten. Die Bilder werden in Filmen zusammengestellt und die Abstoßung von Schwärmen durch stressinduzierte Populationen wird mit frei verfügbarer ImageJ-Software quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wird der Gewährleistung der Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Schwarmexperimenten gewidmet.

Protocol

1. Vorbereitung Schwärmender Agarplatten für P. aeruginosa Schwärmen Zeitraffer-Imaging Bereiten Sie 1 L 5x M8 Mindestmedium in einer Glasflasche vor, indem Sie 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4und 2,5 g NaCl in 500 ml doppeldestilliertem Wasser (ddH2O) hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen auf 1 L mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav ein, um flüssige Medien bei Raumtemperatur zu sterilisieren und zu lagern. Bereit…

Representative Results

Die Schritte zum Wachstum von P. aeruginosa, Stress die Zellen, und Bild die Schwarm Agar Platten sind in Abbildung 1dargestellt . Wir haben eine einzige Kolonie von Wild-Typ P. aeruginosa UCBPP-PA14-Stamm von einer LB-Agar-Platte in 2 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 °C geimpft und 5 l in der Mitte der schwärmenden Agarplatte gesichtet. Die Zeitraffer-Bildgebung dieser Platte zeigt das anfängliche Wachstum in Form einer Kolonie in der Mitte und dann die Ausbreitung der Ranken radial …

Discussion

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Minimierung der Variabilität in Schwärmen von Agarplatten und die Bereitstellung einer einfachen und kostengünstigen Methode, um Zeitrafferbilder von P. aeruginosa zu erfassen, die schwärmen und auf Stress reagieren. Dieses Verfahren kann durch Anpassung der Medienzusammensetzung und der Wachstumsbedingungen auf andere Bakterielle Systeme erweitert werden. Für P. aeruginosa, obwohl M9 oder FAB minimales Medium verwendet werden kann, um Schwärme<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.-L.B., A.S., und N.M.H-K. das Manuskript geschrieben und überarbeitet. Alle Autoren haben die Experimente entworfen. J.-L.B. führte die Experimente und Analysen durch. Diese Arbeit wurde durch den NIH Award K22AI112816 und R21AI139968 Stipendium an A.S. und die University of California unterstützt. N.M.H-K. wurde unterstützt von den Lundbeck Fellowships R220-2016-860 und R251-2017-1070. Die Geldgeber spielten bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen, keine Rolle. Wir haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Materials

Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010 For LB-agar plate and swarming agar plate
Casamino acids BD Difco 223050 For swarming media
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose. For swarming media
Fosfomycin disodium salt Tokyo Chemical Industry F0889 Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O
Gentamycin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O
LB-Miller BD Difco 244620 For LB broth and LB-agar plates
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391 For swarming media
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 For 5X M8 media
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 For 5X M8 media
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373 For 5X M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab AFS27E.118 PA14 strain
DMS3vir O'Toole lab DMS3vir20 Bacteriophage
Supplies
Aluminium oxide sandpaper 3M 150 Fine For black lids
Black fabric Joann PRD7089 Black fabric
Black spray paint Krylon 5592 Matte Black For black lids
Erlenmeyer flask Kimax 26500 250 mL
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1000 mL
8 inches zip ties Gardner Bender E173770 For attaching black matte fabric
Petri dishes (100 mm x 15 mm) Fisher FB0875712 100 x 15 mm polystyrene plates
Wooden sticks Fisher 23-400-102 For streaking and inoculating bacteria
Equipment
Autoclave Market Forge Industries STM-E For sterilizing reagents
25 mL pipette USA Scientific, Inc. 1072-5410 To pipet 20 mL for swarming agar plates
Dehumidifier Frigidaire FAD704DWD 70-pint For maintaing room relative humidity at about 45%
ImageJ NIH v1.52a Software for image analysis
Incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Isotemp waterbath Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C
Laminar flow hood The Baker Company SG603A For drying plates
P-20 pipet Gilson F123601 Spotting on swarming agar plates
Pipette Controller BrandTech accu-jet To pipet 20 mL for swarming agar plates
Roller Drum New Brunswick TC-7 For growth of bacteria at 100 rpm
Scanner Epson Epson Perfection V370 Photo Scanner for imaging plates
Scanner automation software RoboTask Lite v7.0.1.932 For 30-min internals imaging
Scanner image acquisition software Epson v9.9.2.5US Software for imaging plates

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Cite This Article
Bru, J., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (159), e60915, doi:10.3791/60915 (2020).

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