Summary
우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.
Abstract
떼는 녹농균과 대장균을포함한 많은 Pseudomonas aeruginosa 세균종에서 관찰되는 표면 운동성의 한 형태이다. 여기에서, 박테리아의 조밀한 인구는 시간의 과정을 통해 특징적인 tendril 모양 지역 사회에 있는 먼 거리에 이동합니다. 떼는 중간 수분, 습도 및 영양소 함량을 포함한 여러 가지 요인에 민감합니다. 또한, 항생제 또는 박테리오파지 (파지)에 의해 스트레스를 받는 P. aeruginosa에서 관찰되는 집단 스트레스 반응은 스트레스가 함유 된 영역에 접근하는 무리를 격퇴합니다. 여기에 설명된 방법은 떼에 영향을 미치는 중요한 요소를 제어하는 방법을 설명합니다. 평판 문서 스캐너를 사용하여 높은 시간적 해상도로 군단역학 및 집단 응력 반응을 모니터링하는 간단한 방법을 소개하고 군단의 정량적 분석을 컴파일하고 수행하는 방법을 설명합니다. 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 무리의 정확하고 잘 제어 된 정량화를 제공하고 플레이트 기반 성장 측정 및 세균 종의 다른 유형으로 확장 될 수있다.
Introduction
떼는 숙주1,,2,,3에서항생제 내성 및 독성 인자의 생산을 증가시키는 조정된 세균 운동성의 집단 형태이다. 이 다세포 행동은 폐에 있는 상피 막을 덮는 점액 층의 그것과 유사한 반 고체 표면에서 생깁니다4,,5. 생체 계면 활성제는 일반적으로 표면의 표면 장력을 극복하기 위해 무리를 지어 생성되며 이들의 생산은 복잡한 세포 세포 신호 시스템, 일컬어 쿼럼 센싱6,,7,,8에의해 조절된다. 많은 종의 박테리아는 녹농균, 황색포도상구균, 대장균9,,10,,11,,12를포함하여 무리를 지을 수 있다. 세균에 의해 생성된 무리 패턴은 다양하고 영양 성분, 다공성 및 수분13,,14를포함하는 표면층의 물리적 및 화학적 특성에 의해 영향을 받습니다. 표면 특성 이외에, 성장 온도 및 주변 습도는 떼지어 속도 및 패턴12,,13,,14,,15를포함하여 무리 역학의 몇몇 양상에 영향을 미칩니다. 무리에 영향을 미치는 성장 변수는 실험 재현성과 결과를 해석하는 능력에 영향을 미치는 문제를 만듭니다. 여기에서는 시간 경과 이미징을 통해 세균 군단의 역학을 모니터링하는 간단한 표준화 방법을 설명합니다. 이 방법은 떼의 진행에 큰 영향을 미치는 중요한 성장 조건을 제어하는 방법을 설명합니다. 전통적인 군단 분석 방법에 비해 이 타임랩스 이미징 방법을 사용하면 오랜 시간 동안 고해상도로 동시에 여러 군단의 운동성을 추적할 수 있습니다. 이러한 측면은 군단 모니터링을 통해 얻을 수 있는 데이터의 깊이를 향상시키고 떼에 영향을 미치는 요인을 쉽게 식별할 수 있습니다.
P. aeruginosa에서 떼이는 주변 지역으로 의 rhamnolipids 및 3-(3-hydroxyalkanoyloxy) 알카노산의 생산 및 방출을 통해 촉진된다6,,16. 파지 바이러스에 의한 항생제 또는 감염의 하위 치명적인 농도에서 스트레스의 도입은 무리의 조직에 영향을 미칩니다. 특히, 이러한 응력은 P. aeruginosa가 쿼럼 감지 분자 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone을 방출하도록 유도하며, 또한 슈도모나스 퀴놀론 신호(PQS)로 알려져있다 17,,18. 두 마리의 무리 집단을 포함하는 군단 의 에서, 응력 유도 인구에 의해 생성된 PQS는 응력포함 지역을 입력하는 처리되지 않은 떼를 격퇴합니다(그림 1). 이 집단 스트레스 대응은 주변 위협에 대해 P. aeruginosa에게 경고하는 위험 통신 신호 시스템을구성18,,19. P. aeruginosa에대한 스트레스의 영향, 집단 스트레스 반응의 활성화 및 군단의 반발은 여기에 설명된 시간 경과 이미징 방법을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 (1) 무리를 위한 한천 플레이트를 준비하고, (2) 배양 P. aeruginosa 두 가지 유형의 분석(전통적인 무리 분석 또는 집단 스트레스 반응 분석)에대해(그림 1), (그림 1),(3) 시간 경과 이미지를 획득하고, (4) ImageJ를 사용하여 이미지를 컴파일하고 분석하는 방법을 설명합니다.
간략하게, P. aeruginosa 하룻밤 문화에서 파지에 감염 되거나 항생제로 치료 하는 P. aeruginosa 위성 위치에서 발견 하는 동안 무리 한천 접시의 중간에 발견 된다. P. aeruginosa 떼의 진행은 습도 조절 37°C 인큐베이터에 배치되는 소비자 문서 평판 스캐너상에서 모니터링됩니다. 스캐너는 일반적으로 16-20 시간 동안 정기적으로 플레이트를 자동으로 스캔하는 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 이 방법은 최대 6 개의 10cm 떼지어 플레이트의 동시 타임 랩스 비디오를 생성합니다. 이미지는 영화로 컴파일되고 스트레스로 인한 모집단에 의한 무리의 반발은 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다. 서로 다른 무리 실험 간의 일관성과 재현성을 보장하기 위해 특별한 고려 사항이 주어집니다.
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Protocol
1. P. aeruginosa 떼기 시간 경과 이미징을 위한 떼지어 한천 접시 준비
- Na2HPO4•7H2O, KH2PO415 g, NaCl 2.5 g를 500 mL 이중 증류수(ddH2O)에 추가하여 유리 병에 5x M8 최소 용지 1L을 준비합니다. 액체 매체를 살균하고 실온에서 보관하기 위해 추가 ddH2O. Autoclave로 최종 부피를 1L로 조정합니다.
- 100 mL의 1M MgSO4 (황산 마그네슘)를 MgSO4•7H2O 50 mL ddH2O에 24.6 g을 추가하여 유리 병에 추가하여 최종 부피를 100 mL로 조정하여 ddH2O. 오토클레이브를 살균합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 50 mL ddH2O. 추가 ddH 2 O. 멸균에 추가 ddH2O. 오토 클레이브와 100 mL에 카사 미노 산 20g을 추가하여 유리 병에 20 % 카사 미노 산의 100 mL을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 50 mL ddH2O. 추가 ddH 2 O. 0.22 μm 필터로 여과에 의해 살균 추가 ddH2O. 최종 볼륨을 100 mL로 조정하여 유리 병에 20 % 포도당의 100 mL을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 10개의 떼를 지어 한천 접시를 만들려면, ddH2O의 100 mL에 한천 1g을 추가하고 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 ddH2O를 추가하여 최종 볼륨을 160 mL로 조정합니다. 오토클레이브에 의한 살균.
- 오토클레이브 직후, 한천 용액을 55°C 수조에 15분 동안 놓습니다.
- 수조에서 한천 용액을 제거하고 5x M8 최소 매제 40 mL, 1 M MgSO4의200 μL, 20 % 포도당의 2mL, 5 mL의 20 % 카사 미노 산15를추가합니다. 혼합 직후 1.6단계로 진행한다.
참고 : 최종 농도는 0.5 % 한천, 1 mM MgSO4,0.2 % 포도당 및 0.5 % 카자미노 산입니다.
- 일관된 부피를 위해 25mL 파이펫을 사용하여 직경 10cm 페트리 접시당 20mL의 한천 용액을 추가합니다.
참고: 한천의 건조 시간과 수분 함량에 영향을 미치기 때문에 한천 용액의 고정 부피가 중요합니다. 떼지어 다니는 한천 판을 만들 때 거품을 피하십시오. - 한천이 한천을 실온에서 벤치에 1시간 동안 뚜껑이 있는 단일 스택에 놓아 굳어지도록 합니다. 다음 단계 이전에 실내의 상대 습도를 40-50% 1h로 줄이려면 제습기를 켭니다.
- 300 ft3/min에서 라미나 흐름 후드에서 뚜껑을 끄고 실온에서 40-50 % 상대 습도로 떼지어 다니는 한천 접시를 추가로 건조시십시오. 뚜껑내부를 층류 후드에 올려 놓아 건조시면 말립니다. 최대 24시간 동안 4°C에서 한천 접시를 보관하십시오.
- 사포로 뚜껑 안쪽을 부드럽게 하여 이미징을 위해 검은 색 10cm 페트리 접시 뚜껑을 준비하십시오. 뚜껑을 포장 상자 안에 넣고 포장 상자를 화학 후드 아래에 놓습니다. 검은 색 스프레이 페인트를 사용하여 뚜껑 내부에 스프레이하십시오. 뚜껑을 말리십시오.
참고: 추가 실험을 위해 검은색 뚜껑을 다시 사용할 수 있습니다. 스캔 하는 동안 빛을 반사 하지 않도록 뚜껑을 칠 하는 것이 중요 하다.
2. P. aeruginosa 및 도금 조건의 성장
- 400 mL ddH2O에 LB-Miller 파우더 믹스 10 g을 추가하여 400 mL의 리소제니 국물 (LB)을 준비하십시오. 2% LB-한천 페트리 요리의 경우, 한천 8g을 추가로 추가하십시오. 소독할 오토클레이브.
- 용융 LB-한천 배지 20 mL를 직경 10cm의 페트리 접시에 붓고 밤새 실온에서 굳힙하게 만듭니다. 액체 매질을 실온에서 보관하고 한천 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.
- Lb-agar 페트리 접시에 줄무늬 P. aeruginosa 멸균 루프 또는 나무 막대기를 사용하여 -80 °C에 저장 냉동 주식에서. 페트리 접시를 37°C에서 하룻밤 동안 거꾸로 인큐베이션합니다. LB-한천 플레이트를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
- 멸균 루프 또는 나무 막대기로 페트리 접시에서 단일 콜로니를 선택하고 2 mL LB 배지로 접종하고 100 rpm으로 설정된 롤러 드럼에서 37 °C에서 밤새 포화 (16-18 h)로 배양을 배양합니다.
- 피펫 5 μL의 야간 배양단계 2.4에서 P20 파이펫을 이용하여 한천판의 중심에 있는 한천판의 중심에 있는 배펫 팁을 비스듬히(10-45°) 위 각도로 2.5cm, 제1 정거장까지 파이펫팅하고, 액체 방울만으로 한천을 만진다(도1B).
- 한천이 손상될 때 파이펫 팁으로 한천을 만지지 마십시오. 템플릿을 사용하여 다른 떼가 많은 한천 플레이트에 걸쳐 지속적으로 자리를 배치하십시오(보조 그림 S1).
- 전통적인 무리의 검정검의 경우, 중심 지점만 사용하고 2.8단계로 건너뜁니다. 집단 스트레스 반응 분석의 경우 2.6단계(파지 감염) 또는 2.7단계(항생제 스트레스)를 계속한다.
- 파지 감염의 경우, 2.4단계에서 P. aeruginosa의 야간 배양물 30 μL을 1 x 1010 pfu/mL 파지 DMS3vir20의6 μL로 혼합한다. 다음 단계로 즉시 진행합니다.
- P의 파이펫 6 μL. aeruginosa-phage혼합물 단계 2.6에서 P20 파이펫을 사용하여 6 개의 등거리 위성 위치에서 페트리 접시를 중심으로 하는 2.8 cm 반경 동심 원에서 피펫 팁을 비스듬히 (10~ 45°) 위에 2.5 cm 로 접근하여 스포팅 영역 위로 2.5 cm, 첫 번째 정류장으로 파이프팅하고 액체 1도만으로 한천을 만지십시오.Figure 1C
- 한천이 손상될 때 파이펫 팁으로 한천을 만지지 마십시오. 일관성을 위해 도금 템플릿을사용합니다(보조 그림 S1). 2.8단계로 진행합니다.
- 항생제 치료의 경우, 30 μL 하룻밤 배양 P. aeruginosa를 2.4 단계에서 3 mg/mL 젠타마이신 6 μL, 100 mg/mL 카나마이신 100 mg/mL 카나마이신 의 10μL, 또는 7.5 μL의 100 mg/mL 포스마이신과 혼합합니다. 다음 단계로 즉시 진행합니다.
- 파이펫 6 μL의 항생제 처리 P. aeruginosa 단계 2.7에서 P20 파이펫을 사용하여 2.8 cm 반경 동심원에 6 개의 등거리 위성 위치에서 반점 (10~ 45°) 각도로 파이펫 팁에 접근하여 2.5 cm 위에 스포팅 영역, 및 액체를 1개만 떨어뜨리고, 액체를 1개만 떨어뜨리고, 만지는 다.Figure 1D
- 한천이 손상될 때 파이펫 팁으로 한천을 만지지 마십시오. 일관성을 위해 도금 템플릿을사용합니다(보조 그림 S1). 2.8단계로 진행합니다.
- 투명한 페트리 접시 뚜껑을 1.9단계(그림2A)에서만든 검은색 뚜껑으로 교체합니다.
- 37°C에 설정된 인큐베이터에 10L 수조로 설정된 인큐베이터에 떼지어 다니는 한천 판을 75%의 습도를 유지합니다(그림1E, 그림 2B).
주의: 떼지어 다니는 한천 접시에 있는 점박이 세포를 방해하지 마십시오. 플레이트를 항상 위로 향하게 유지하십시오.
3. 스캐너로 이미지 수집
- 평판 문서 스캐너 위의 랙 40-60cm에 검은색 무광택 패브릭을 부착하여 페트리 접시의 주변 조명을 줄입니다. 지퍼 타이를 사용하여 고정하십시오(그림 2B).
- 스캐너는 스캔 소프트웨어와 자동 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다.
- 스캔 소프트웨어에서 홈 모드(그림 3A)를선택합니다.Figure 3 이미지 유형아래에서 색상을 선택하여 이미지를 색상으로 캡처합니다. 이미지 품질을 설정하려면 대상 아래에서 기타를 선택하고 해상도를 300dpi로 조정합니다. 대상 크기에 대한 원본을 선택하여 이미지의 표준 크기를 유지합니다. 표준 이미지 품질을 위해 이미지 조정 아래에 있는 모든 옵션을 선택하지 않은 상태로 둡니다.
참고: 대상 크기는 기본적으로 원래로 설정됩니다. 대상 크기에 대한 다른 옵션을 선택하려면 먼저 미리 보기를 클릭합니다.
- 스캔 소프트웨어에서 홈 모드(그림 3A)를선택합니다.Figure 3 이미지 유형아래에서 색상을 선택하여 이미지를 색상으로 캡처합니다. 이미지 품질을 설정하려면 대상 아래에서 기타를 선택하고 해상도를 300dpi로 조정합니다. 대상 크기에 대한 원본을 선택하여 이미지의 표준 크기를 유지합니다. 표준 이미지 품질을 위해 이미지 조정 아래에 있는 모든 옵션을 선택하지 않은 상태로 둡니다.
- 스캔 오른쪽에 있는 폴더 아이콘을 클릭하여 이미지 저장 경로를 설정하여 파일 저장설정(그림 3A)을엽니다.
- 위치 에서 다른 를 선택 하 여 이미지를 저장 하기 위해 폴더 대상을 선택 하 고 찾아보기를클릭 합니다. 이미지를 저장할 폴더를 선택합니다.
- 접두사 텍스트 상자의 이미지 이름을 지정합니다. 시작 번호 001을 설정하여 이미지의 이름 지정 시퀀스를 시작합니다. JPEG (*.jpg)를 선택하여 JPEG로 파일 형식을 설정하고 이미지 Options 형식 에서 입력하고 옵션을 클릭하여 세부 정보를조정합니다. 압축 수준을 16으로 조정하고 표준으로 인코딩하고 ICC 프로필 포함을확인하여 이미지 형식 품질을 설정합니다. 확인을 클릭하여 창을닫습니다(그림 3B).
- 첫 번째 옵션을 선택취소한 상태로 두고("같은 이름의 파일 덮어쓰기") 다음 옵션 3개("다음 스캔 전에 이 대화 상자 표시", "스캔 후 이미지 폴더 열기", "스캔 후 페이지 추가 대화 상자 표시")를 선택합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 미리 보기를클릭하여 이미지 품질을 확인합니다. 미리 보기 창이 나타나고 스캔 아이콘이 작동하게 됩니다(그림3C).Figure 3
- 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집을 자동화합니다. 제공된 스크립트는 스캔 창에서 스캔을 클릭하고 파일 저장 설정 창에서 30분 간격으로 확인을 클릭합니다.
- 작업을 클릭하여 스크립트 가져오기 | Single_scan.tsk 와 Idle_scanning.tsk (보충 파일 1 및 2로제공되는 TSK 파일)를 모두 가져오고 선택합니다. 그림 3D를참조하십시오.
참고: Single_scan.tsk는 스캔 창의 스캔 버튼을 클릭하고 파일 저장 설정 창에서 확인합니다. Idle_scanning.tsk는 30분마다 Single_scan.tsk를 활성화합니다. 하나는 Idle_scanning.tsk의활성화를 변경하여 스캔 주파수를 변경할 수 있습니다. - 유휴 스캔(가져오기)과 단일 스캔(가져오기)을모두 선택하고 유휴 스캔(가져오기)을마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 왼쪽을 클릭하여 활성화(그림 3D, 보조 그림 S2)를클릭하여 30분 간격으로 자동 스캔을 활성화합니다.Figure 3
참고: 사용자가 스크립트를 수동으로 중지할 때까지 자동 검색이 실행됩니다. 스크립트를 중지하려면 유휴 스캔(가져오기)을선택하고 마우스 오른쪽 단추를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고(가져온)및 왼쪽 을 클릭하여 Enabled를 클릭합니다. 확인 표시가 제거됩니다.
- 작업을 클릭하여 스크립트 가져오기 | Single_scan.tsk 와 Idle_scanning.tsk (보충 파일 1 및 2로제공되는 TSK 파일)를 모두 가져오고 선택합니다. 그림 3D를참조하십시오.
4. 시간 경과 이미지 편집 및 군단 반발 력 측정
- ImageJ를 사용하여 동영상 편집 및 이미지 분석을 수행합니다.
- 파일을 클릭하여 모든 스캔 한 이미지를 ImageJ로 가져옵니다 | 수입 | 이미지 시퀀스를 선택하고 이미지를 선택합니다. 시퀀스 옵션 창에서 RGB로 변환을 선택하여 이미지를 색상으로 유지합니다. 이미지 수는 선택한 이미지 수를 나타냅니다.
- 시작 이미지를 1로 유지하여 폴더의 첫 번째 그림에서 시작하여 이미지의 원래 크기를 100%로 조정합니다. 가상 스택 사용을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 확인을 클릭하고 이미지가 로드될 때까지기다립니다(그림 4A).
- 편집을 클릭하여 비디오 압축 수준을 100으로 설정 | 옵션 | 입력/출력... JPEG 품질을 100으로 조정합니다.
- FILE | 을 클릭하여 파일을 .avi로 저장 로 저장 | AVI. 압축을 JPEG로 조정하고 프레임 속도를 5fps로 조정합니다(그림4B). 원하는 폴더에 .avi 시간 경과를 저장합니다.
- 군단 반발 거리를 정량화하려면 ImageJ에서 떼가 많은 기간이 끝날 때 가까운 이미지를 엽니다. 파일 | 클릭 이미지를 열고 선택합니다. 분석 | 클릭하여 배율 조정 픽셀 단위로 배율 및 설정 거리를 118로 설정하고, 알려진 거리를 1로, 픽셀 종횡비를 1.0으로, 길이 단위에서 cm(그림4C)로설정합니다.Figure 4 전역을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 직선 아이콘을 클릭하고 위성 위치에서 식민지의 중심에서 떼지어 인구의 가장자리까지 측정합니다. 분석 선택 | 측정값(길이)(그림Figure 44D)과함께 새 창이 표시되도록 하는 측정값입니다.
참고: "+"를 사용하여 더 가깝게 확대하고 "-"를 확대하여 축소합니다.
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Representative Results
P. aeruginosa를성장시키는 단계는 세포를 강조하고, 떼지어 한천 판을 이미지화하는 단계는 그림 1에나타낸다. 우리는 37 °C에서 LB 국물의 2 mL에서 LB-한천 플레이트에서 야생 형 P. aeruginosa UCBPP-PA14 균주의 단일 콜로니를 접종하고 떼지어 한천 판의 중앙에서 5 μL을 발견했습니다. 이 판의 시간 경과 화상 진찰은 중앙에 있는 식민지의 양식에 있는 초기 성장을 제시하고 그 때 식민지에서 근사상으로 tendrils의 퍼지는(비디오 1). 집단 스트레스 반응 분석의 경우, 중앙에서 P. aeruginosa를 발견하는 것 외에도, 동일한 야간 배양의 30 μL은 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir의 6 μL 또는 3 mg/mL 의 6 μL의 5:1 및 6 μL의 비율로 위성 위치에서 발견된다. 떼는 떼가 많은 한천판의 중심에서 주변으로 이동하며 파지에 감염된 박테리아에 의해 방출되는 스트레스 신호에 의해 격퇴된다(영상2,왼쪽 상단 플레이트) 또는 젠타마이신(영상2, 우판 상단)으로 처리하였다.Video 2 파지스(영상2,왼쪽 아래 판) 또는 젠타마이신(영상2, 오른쪽 아래 판)은 위성 위치에서 단독으로 발견되어 이 지역을 피하기 위해 무리를 지어 무리를 일으키지 않는다.Video 2
그림 1: P. aeruginosa 의 회로도는 분석 및 집단 스트레스 반응. (A) A. aeruginosa 세포는 밤새 재배 (16-18 h 에 OD600 의 약 1.5) LB 국물에서 37 °C 및(B)떼가 한천 판의 중간에 발견. 하룻밤 배양물(C)파지 또는(D)항생제와 혼합되고 집단 스트레스 반응 분석에 대한 위성 위치에서 발견된다. (e)37°C에서 16-18시간 동안 30분 간격으로 스캐너에 최대 6개의 플레이트가 이미지화됩니다. 18시간 후, P. aeruginosa 무리집단은파지에 감염된 세포 또는(G)항생제(gentamycin)로 치료된 세포를 피한다. (H) P. aeruginosa 인구는 떼지어 한천 접시를 가로 질러 무리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인큐베이터 내부의 스캐너 설정. (A)섹션 1에 지어진 검은 페트리 접시 뚜껑. 이 뚜껑은 빛의 반사를 줄이고 투명한 페트리 접시 뚜껑을 대체하기 위해 스캔 중에 사용됩니다. (B)평판 문서 스캐너는 37°C에 설정된 인큐베이터에 놓습니다. 스캐너에 검은색 뚜껑이 있는 6개의 플레이트가 배치됩니다(왼쪽 이미지). 블랙 무광택 패브릭은 스캐너 위의 랙에 60cm를 부착하여 반사와 미광을 더욱 줄입니다(오른쪽 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스캐닝 및 자동 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 평판 문서 스캐너에서 자동 이미지 수집. (A)주 스캔 창의 스크린샷입니다. 이미지 유형(색상) 및 해상도(300dpi) 선택. 빨간색 사각형은 파일 저장 설정 창을 여는 폴더 아이콘을 나타냅니다. 미리 보기 버튼을 누를 수 있지만 스캔 버튼은 비활성화되어 있습니다. (B)파일 저장 설정 창의 스크린샷은 이미지를 저장하고, 이미지의 이름을 지정하고, 이미지의 형식(왼쪽)을 선택하기 위한 폴더 대상을 설정합니다. 플러그인 설정 창은 이미지 형식 품질(오른쪽)을 설정하는 데 사용됩니다. (C)미리 보기를 클릭한 후 스캔 창의 스크린샷. 미리 보기를 획득한 후 스캔 버튼을 클릭할 수 있습니다. 이제 스크립팅 소프트웨어(자료)를 사용하여 프로그램을 자동화할 수 있습니다. (D)자동화 스크립트를 가져오는 데 사용되는 가져오기 단추를 나타내는 스크립팅 소프트웨어 창의 스크린샷(왼쪽). Single_scan.tsk 와 Idle_scanning.tsk를 가져오면 기본 창(오른쪽)에 작업으로 표시됩니다. 두 작업을 모두 선택하고 마우스 오른쪽 단추를 클릭하면 사용 버튼이 나타납니다. 왼쪽 클릭 활성화를 클릭하면 스크립트가 30분 간격으로 자동으로 검색됩니다(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ImageJ를 사용하여 떼지어 피하기의 이미지 분석. (A)타임랩스 스캐너 이미지에서 이미지 시퀀스를 가져오는 단계입니다. 파일 클릭 | 수입 | 기본 ImageJ 창의 이미지 시퀀스(왼쪽)가 시퀀스 옵션 창(오른쪽)을 표시하고 스캔한 모든 이미지를 엽니다. 빨간색 사각형은 RGB 형식으로 이미지를 로드하는 선택된 옵션을 나타냅니다. 다른 모든 옵션은 기본값으로 남아 있습니다. (B)시간 경과 비디오를 AVI 형식으로 저장하는 단계입니다. 파일 선택 | 로 저장 | AVI는 AVI 창으로 저장을 가져옵니다. 압축은 JPEG 및 프레임 속도를 5fps로 설정합니다. (C)이미지의 배율 단위를 설정합니다. 분석 선택 | 축척 설정은 축척 설정 창을 가져옵니다. 300dpi 이미지의 경우 적절한 눈금은 118픽셀/cm입니다.D 노란색 선은 응력 콜로니의 중심에서 텐드릴의 가장자리까지 그려집니다. 분석 선택 | 측정값은 결과에 레이블이 지정된 새 창에서 선의 길이를 보고합니다. Ctrl + M은 메뉴 항목을 선택하지 않고 측정을 수행하는 키보드 단축키입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: P. aeruginosa의대표 군단. P. aeruginosa 떼지어 한천 접시에 무리를 지어(A)건조,(B)보통,(C)촉촉한 , 그리고(D)여분의 촉촉한. 건조 한천 플레이트는 P. aeruginosa의 무리 속도를 억제하고 텐드릴의 수를 감소시다. 촉촉한 떼지어 한천 판은 큰 텐드릴의 형성을 일으킵니다. 여분의 습한 조건에서, tendrils는 떼지어 한천 접시에 걸쳐 고르지 않게 형성됩니다. 층류 후드및 주변 습도의 건조 시간은 무리 판 수분 함량에 큰 영향을 미친다. 요리는 10cm 페트리 요리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 무리의 타임랩스 영화. 야생형 P. aeruginosa는 무리 판의 중앙에서 발견되었고 22 시간 동안 스캐너에 이미지화되었습니다. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 2: 집단 스트레스 반응의 타임랩스 동영상. 야생형 P. Aeruginosa는 무리 판의 중앙에서 발견되었습니다. 위성 위치는 P. aeruginosa와 함께 발견 되었다 (왼쪽 위) 파지 또는 (오른쪽 상단) gentamycin, 또는 전적으로 발견 (왼쪽 아래) 파지 또는 (아래 오른쪽) gentamycin. 흰색 점은 점의 중심을 나타냅니다. 플레이트는 16 시간 동안 이미지화되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
보충 그림 S1: P. aeruginosa 세포를 발견 하기 위한 도금 템플릿. 중간 검은 점은 5 μL 하룻밤 P. aeruginosa 배양물의 스포팅 영역을 나타낸다. 내부 원의 반지름은 플레이트 중심에서 2.8cm 떨어져 있습니다. 외부 원을 가로 지르는 내부 원과 직선 사이의 교차는 스트레스P. aeruginosa,파지 감염 또는 항생제 치료 세포의 6 μL의 스포팅 영역을 나타냅니다. 바깥쪽 원은 10cm 페트리 접시의 둘레를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 S2: 매크로 명령은 주기적으로 스크립팅 소프트웨어를 사용하여 스캔을 시작합니다. (A)Single_scan.tsk의 매크로 명령은 커서를 스캔 창에서 스캔으로 이동하고, 스캔을 클릭하고, 파일 저장 설정 창에서 확인으로 이동하고, 확인을 클릭합니다. (B)30분 간격으로 스캔하도록 명령합니다. Idle_scanning.tsk 작업은 Single_scan.tsk에서 시작되며 30분 간격으로 활성화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 한천 판의 가변성을 최소화하고 P. aeruginosa 떼지어 스트레스에 대응하는 시간 경과 이미지를 획득하는 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 이 절차는 매체 조성 및 성장 조건을 적응시킴으로써 다른 세균 시스템을 이미지화할 수 있다. P. aeruginosa의경우, M9 또는 FAB 최소 배지가 떼지어16,21을유도하는데 사용될 수있지만,여기에 제시된 프로토콜은 카자미노산, 포도당 및 황산 마그네슘6과M8 배지를 사용한다. P. aeruginosa 떼는 아미노산22,,23,,24를포함하는 철 가용성 및 영양 공급원과 같은 중간 조성물에 민감하다. 따라서, 한천플레이트를 가득 메우는 매체의 선택은 떼지어 다니는 운동성을 말하는 중요한 측면을 보여준다.
개방형 실험실 영역에서 습도와 온도를 제어하는 것은 군단 검사의 일관성에 대한 가장 큰 과제 중 하나입니다. 계절적 변화는 떼지어 다니는 한천 판의 수분 변화에 기여하며, 이는 무리 패턴에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 최적의 플레이트 품질을 보장하기 위해 상대 습도를 일정하게 제어해야 합니다. 제습기를 시작하기 전에 1시간 동안 층상 유동 후드 하에서 떼지어 한천 판을 건조시면 상대 습도를 일정 45%로 제어하여 건조 시간을 30분으로 유지한다. 주변 수분을 제어할 수 없는 경우 건조 시간을 늘리는 것은 습한 환경을 보완할 수 있는 잠재적인 간단한 솔루션입니다. 떼를 지어 드는 동안, 상대 습도는 한천 판이 건조되는 것을 방지하기 위해 37 °C 인큐베이터에서 70 %로 유지되어야합니다. 인큐베이터에 있는 물의 뚜껑이 없는 쓰레기통은 물 저수지역할을 할 수 있다. 건조한 떼를 지어 한천 판은 무리 의 인구 진행을 늦추고 촉촉한 판이 넓은 텐드릴 구조를 일으키는 동안 텐드릴의 수를 줄입니다(그림 5A-C). 여분의 촉촉한 떼이 한천 플레이트는 명확한 tendril 형성을 방지하고 고르지 않은 패턴으로 확산 tendrils을 일으킬(그림 5D). 여기서 설명한 방법은 플레이트상에서 무리의 일관성을 보장하는 일정한 습한 환경을 유지하는 데 사용될 수있다(도 5B, 비디오 1). 또한 플레이트 크기와 한천 두께는 플레이트의 수분을 유지하는 데 역할을 합니다. 우리는 10cm 직경의 페트리 접시를 사용하고 일관성을 보장하기 위해 접시 당 20 mL의 떼지어 한천 용액을 추가했습니다. 부피를 측정하지 않고 플레이트를 붓는 것은 권장되지 않습니다. 무리 분석에 영향을 미치는 많은 변수로 인해, 우리는 지역 실험실 조건에 대한 분석기를 최적화하는 것이 좋습니다 우리는 일관되고 유사한 무리 패턴을 관찰하기 위해 플레이트의 별도의 배치에 여러 생물학적 복제를 수행의 중요성을 강조.
시간 경과 이미징 방법의 장점은 무리를 방해할 필요 없이 운동성의 진행을 관찰할 수 있는 능력입니다. 우리의 방법은 여러 균주, 다중 실험 조건 또는 생물학적 복제의 동시 평가를위한 제어 환경을 모두 제공하는 동일한 조건에서 동시에 6 플레이트의 시간 경과를 편리하게 생성합니다. 각 플레이트에 6개의 위성 위치를 사용하면 통계 분석이 용이하며 ImageJ를 사용하면 군중 반발을 정량화할 수 있습니다.
여기에 설명된 절차는 P. aeruginosa의하위 인구 사이의 상호 작용을 연구하는 간단한 방법입니다 : 건강한 무리 인구와 스트레스 세포. DMS3vir와 gentamycin 을 넘어, 파지의 추가 유형, 항생제, 경쟁 박테리아 또는 곰 팡이 스트레스 신호를 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 P. aeruginosa 떼지어 운동성에 초점을 맞추고 있지만, S. 아우레우스 와 대장균과 같은 다른 세균성 종은 또한 무리 패턴을 전시하지만, 그들은 무리10,,11에적응 매체를 필요로한다. 미디어 조성및 플레이트 조건을 최적화하여 이 방법을 적용하여 떼를 분석하고, 세균 균주 간의 상호 작용과 응력 반응을 분석할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., 그리고 N.M.H-K. 원고를 작성하고 수정했습니다. 모든 저자는 실험을 설계했다. J.-L.B.는 실험 및 분석을 수행하였다. 이 작품은 NIH 상 K22AI112816 및 R21AI139968 A.S. 및 캘리포니아 대학에 의해 지원되었다. N.M.H-K. Lundbeck 펠로우십 R220-2016-860 및 R251-2017-1070의 지원을 받았습니다. 기금 모금자는 출판을 위해 작품을 제출하기로 결정하는 데 아무런 역할이 없었습니다. 우리는 선언할 경쟁적인 이해관계가 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
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