Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد

Published: May 23, 2020 doi: 10.3791/60915
Automatic Translation
1, 1,2, 3
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

Summary

نحن بالتفصيل طريقة بسيطة لإنتاج أفلام عالية الدقة الفاصل الزمني من أسراب Pseudomonas aeruginosa التي تستجيب لbacteriophage (phage) والإجهاد المضادات الحيوية باستخدام ماسح ضوئي وثيقة مسطحة. هذا الإجراء هو طريقة سريعة وبسيطة لرصد ديناميات يحتشدون ويمكن تكييفها لدراسة حركية ونمو الأنواع البكتيرية الأخرى.

Abstract

يحتشدون هو شكل من أشكال حركية السطح لوحظ في العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa والإشريكية القولونية. هنا ، تتحرك مجموعات كثيفة من البكتيريا على مسافات كبيرة في مجتمعات مميزة على شكل وترلي على مدار ساعات. الدفء حساس لعدة عوامل بما في ذلك الرطوبة المتوسطة والرطوبة ومحتوى المغذيات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استجابة الإجهاد الجماعية ، التي لوحظت في P. aeruginosa التي يتم الضغط عليها من خلال المضادات الحيوية أو البكتيريا (phage) ، تصد أسراب من الاقتراب من المنطقة التي تحتوي على الإجهاد. وتتناول الأساليب الموصوفة هنا كيفية التحكم في العوامل الحرجة التي تؤثر على الاحترار. نقدم طريقة بسيطة لرصد الديناميكيات المحتشدة والاستجابة الجماعية للإجهاد بدقة زمنية عالية باستخدام ماسح ضوئي للمستندات المسطحة ، ووصف كيفية تجميع وإجراء تحليل كمي للأسراب. توفر هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة قياسًا كميًا دقيقًا وجيد التحكم فيه للاحترار ويمكن توسيعنطاقها لتشمل أنواعًا أخرى من المقالات النمو القائمة على الصفائح والأنواع البكتيرية.

Introduction

يحتشدون هو شكل جماعي من الحركة البكتيرية المنسقة التي تزيد من مقاومة المضادات الحيوية وإنتاج عوامل الفوعة في المضيف1،2،3. يحدث هذا السلوك متعدد الخلايا على الأسطح شبه الصلبة التي تشبه تلك الطبقات المخاطية التي تغطي الأغشية الظهارية في الرئتين4،5. يتم إنتاج المواد البيولوجية السطحية عادة من قبل السكان يحتشدون للتغلب على التوتر السطحي على الأسطح ويتم تنظيم إنتاج هذه من قبل أنظمة الإشارات الخلايا المعقدة، والمعروفة أيضا باسم استشعار النصاب6،7،8. العديد من أنواع البكتيريا قادرة على يحتشدون، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa، المكورات العنقودية أوريوس، والإشريكية القولونية9،10،11،12. الأنماط المحتشدة التي تخلقها البكتيريا متنوعة وتتأثر بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للطبقة السطحية بما في ذلك تكوين المغذيات والمسامية والرطوبة13،14. بالإضافة إلى خصائص السطح، تؤثر درجة حرارة النمو والرطوبة المحيطة على عدة جوانب من الديناميكيات الدافئة، بما في ذلك معدل الاحترار والأنماط12،13،14،15. تخلق متغيرات النمو التي تؤثر على الاحترار تحديات تؤثر على قابلية الاستنساخ التجريبي والقدرة على تفسير النتائج. هنا ، نحن نصف طريقة موحدة بسيطة لمراقبة ديناميات أسراب البكتيريا من خلال التصوير الفاصل الزمني. تصف الطريقة كيفية التحكم في ظروف النمو الحرجة التي تؤثر بشكل كبير على تطور الاحترار. بالمقارنة مع الطرق التقليدية لتحليل سرب، وهذا الأسلوب التصوير الفاصل الزمني تمكن تتبع حركية أسراب متعددة في وقت واحد خلال فترات طويلة من الزمن ومع دقة عالية. وتحسن هذه الجوانب من عمق البيانات التي يمكن الحصول عليها من أسراب الرصد وتيسر تحديد العوامل التي تؤثر على الاحترار.

يسهل الاحترار في P. aeruginosa من خلال إنتاج وإطلاق الرهامنوبيدات و3-(3-هيدروكسي الكانويللوكسي) الأحماض الهلوليك فيالمنطقةالمحيطة 6,16. إن إدخال الإجهاد الناجم عن التركيزات شبه المميتة للمضادات الحيوية أو العدوى بفيروس الفاتج يؤثر على تنظيم الأسراب. على وجه الخصوص، هذه الضغوط تحفز P. aeruginosa لإطلاق جزيء استشعار النصاب 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone، المعروف أيضا باسم إشارة الكينوالون السودوموناس (PQS)17،18. في المقايسات سرب التي تحتوي على مجموعتين من أسراب, PQS التي تنتجها السكان الناجمة عن الإجهاد يصد أسراب غير المعالجة من دخول المنطقة التي تحتوي على الإجهاد(الشكل 1). هذه الاستجابة الإجهاد الجماعي يشكل نظام إشارة الاتصالات الخطر الذي يحذر P. aeruginosa حول التهديدات القريبة18,19. آثار الإجهاد على P. aeruginosa، وتفعيل استجابة الإجهاد الجماعية ، وتنافر الأسراب يمكن تصورها باستخدام طريقة التصوير الفاصل الزمني الموصوفة هنا. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية: (1) إعداد لوحات أجار لليحتشّاب، (2) الثقافة P. aeruginosa لهذين النوعين من المقالات (المقالات التقليدية أو المقايسات الجماعية للاستجابة للإجهاد)(الشكل 1)،(3) الحصول على صور الفاصل الزمني، و(4) استخدام ImageJ لتجميع وتحليل الصور.

لفترة وجيزة، رصدت P. aeruginosa من ثقافة بين عشية وضحاها في منتصف لوحة أجار يحتشدون في حين رصدت P. aeruginosa التي يتم إصابة phage أو تعامل مع المضادات الحيوية في مواقع الأقمار الصناعية. يتم رصد تطور P. aeruginosa يحتشدون على ماسح ضوئي مسطح وثيقة المستهلك التي يتم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية تنظم الرطوبة. يتم التحكم في الماسح الضوئي من خلال برنامج يقوم تلقائيًا بمسح اللوحات على فترات منتظمة خلال فترة نمو السرب ، عادة ً ما تكون 16-20 ساعة. هذه الطريقة تسفر عن أشرطة الفيديو الفاصل الزمني المتزامنة تصل إلى ستة لوحات 10 سم يحتشدون. يتم تجميع الصور في أفلام ويتم قياس نفور الأسراب من قبل السكان الناجمعن الإجهاد باستخدام برنامج ImageJ المتاح بحرية. ويولى اهتمام خاص لضمان الاتساق والاستنساخ بين مختلف التجارب المحتشدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد ألواح أجار يحتشدون لP. aeruginosa يحتشدون الوقت الفاصل التصوير

  1. إعداد 1 L من 5x M8 الحد الأدنى وسائل الإعلام في زجاجة بإضافة 64 غرام من نا2HPO4• 7H2O، 15 غرام من KH2PO4،و 2.5 غرام من NaCl في 500 مل الماء المقطر المزدوج (ddH2O). ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 1 L مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم وتخزين الوسائط السائلة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد 100 مل من 1 M MgSO4 (كبريتات المغنيسيوم) في زجاجة بإضافة 24.6 غرام من MgSO4• 7H2O في 50 مل ddH2O. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد 100 مل من 20٪ أحماض كاسامينو في زجاجة عن طريق إضافة 20 غرام من الأحماض casamino في 50 مل ddH2O. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. أوتوكلاف لتعقيم. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد 100 مل من الجلوكوز 20٪ في زجاجة عن طريق إضافة 20 غرام من الجلوكوز في 50 مل ddH2O. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع ddHإضافية 2O. تعقيم عن طريق الترشيح مع مرشح 0.22 ميكرومتر. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  5. لجعل 10 لوحات أجار يحتشدون، إضافة 1 غرام من أجار في 100 مل من ddH2O وضبط حجم النهائي إلى 160 مل مع ddHإضافية 2O في قارورة إرلينماير 250 مل. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف.
    1. مباشرة بعد الأوتوكلاف، وضع محلول أجار في حمام مائي 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. إزالة محلول الأجار من حمام الماء وإضافة 40 مل من 5x M8 الحد الأدنى من وسائل الإعلام، 200 ميكرولتر من 1 M MgSO4،2 مل من الجلوكوز 20٪، و 5 مل من 20٪ أحماض كاسامينو15. انتقل إلى الخطوة 1.6 مباشرة بعد الاختلاط.
      ملاحظة: التركيزات النهائية هي 0.5٪ أجار، 1 mM MgSO4،0.2٪ الجلوكوز، و 0.5٪ أحماض كاسامينو.
  6. باستخدام ماصة 25 مل لحجم ثابت، إضافة 20 مل من محلول أجار يحتشدون لكل 10 سم قطرها طبق بيتري.
    ملاحظة: حجم ثابت من محلول أجار مهم، حيث يؤثر الحجم على وقت التجفيف ومحتوى الرطوبة في agar. تجنب فقاعات عند جعل لوحات أجار يحتشدون.
  7. السماح للأجار لترسيخ عن طريق وضع لوحات أجار يحتشدون في كومة واحدة مع أغطية على لمدة 1 ساعة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل مزيل الرطوبة لتقليل الرطوبة النسبية للغرفة إلى 40-50٪ 1 ساعة قبل الخطوة التالية.
  8. تجفيف لوحات الأجار يحتشدون لمدة 30 دقيقة إضافية مع الأغطية قبالة في غطاء تدفق لامي في 300 قدم3/ دقيقة مع 40-50٪ الرطوبة النسبية في درجة حرارة الغرفة. تجفيف المناطق الداخلية من الأغطية عن طريق وضعها الوجه حتى في غطاء تدفق لاميدنار. تخزين لوحات أجار يحتشدون في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
  9. إعداد أسود 10 سم أغطية طبق بيتري للتصوير عن طريق تنعيم داخل الغطاء مع الصنفرة. وضع الأغطية داخل صندوق التعبئة والتغليف ووضع مربع التعبئة والتغليف تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. رش داخل الأغطية باستخدام طلاء رذاذ أسود. السماح للأغطية لتجف.
    ملاحظة: قد يتم إعادة استخدام الأغطية السوداء لإجراء تجارب إضافية. من المهم أن يتم طلاء الأغطية بحيث لا تعكس الضوء أثناء المسح الضوئي.

2- نمو P. aeruginosa وظروف الطلاء

  1. إعداد 400 مل من مرق الليسوجيني (LB) عن طريق إضافة 10 غرام من مزيج مسحوق LB-Miller إلى 400 مل ddH2O. لأطباق LB-agar Petri 2٪، أضف 8 غرام إضافية من أجار. الأوتوكلاف للتعقيم.
  2. صب 20 مل من المتوسط LB-agar المنصهرة في أطباق بيتري قطرها 10 سم والسماح لهم لترسيخ في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. تخزين وسائل الإعلام السائلة في درجة حرارة الغرفة ولوحات أجار في 4 °C.
  3. خط P. aeruginosa على طبق LB-agar Petri من مخزون مجمد مخزنة عند -80 درجة مئوية باستخدام حلقات معقمة أو عصي خشبية. احتضان طبق بيتري رأسا على عقب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تخزين لوحة LB-agar في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  4. اختيار مستعمرة واحدة من طبق بيتري مع حلقة معقمة أو عصا خشبية، تطعيمه إلى 2 مل LB المتوسطة، واحتضان الثقافة إلى التشبع بين عشية وضحاها (16-18 ح) في 37 درجة مئوية في طبل الأسطوانة مجموعة في 100 دورة في الدقيقة.
  5. Pipet 5 μL من الثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 2.4 باستخدام أنبوب P20 وبقعة في وسط لوحة أجار يحتشدون عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10-45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة اكتشاف، pipetting وصولا الى المحطة الأولى، ولمس أغار مع قطرة السائل فقط(الشكل 1B).
    1. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب من أجل وضع بقعة باستمرار عبر لوحات أجار مختلفة(الرقم التكميلي S1).
    2. بالنسبة للمقالات التقليدية، استخدم مركز المركز فقط وانتقل إلى الخطوة 2.8. للحصول على الاستجابات الإجهاد الجماعي الأقوال الاستمرار في الخطوة 2.6 (لعدوى phage) أو الخطوة 2.7 (للإجهاد المضادات الحيوية).
  6. للعدوى phage، مزيج 30 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها من P. aeruginosa من الخطوة 2.4 مع 6 ميكرولتر من 1 × 1012 pfu/mL phage DMS3vir20. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
    1. Pipet 6 μL من P. aeruginosa-phageخليط من الخطوة 2.6 باستخدام أنبوب P20 وبقعة في 6 مواقف الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سم متحدة المركز التي تركز تتركز في طبق بيتري عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10 إلى 45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة اكتشاف، الأنابيب وصولا إلى المحطة الأولى، ولمس أجار مع قطرة السائل فقط(الشكل 1C).
    2. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب الطلاء للاتساق(الرقم التكميلي S1). انتقل إلى الخطوة 2.8.
  7. للعلاجات بالمضادات الحيوية، مزيج 30 ميكرولتر الثقافة بين عشية وضحاها P. aeruginosa من الخطوة 2.4 مع 6 ميكرولتر من 3 ملغ / مل جنتاماشين، 10 ميكرولتر من 100 ملغ / مل كاناماين، أو 7.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل fosfomycin. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
    1. Pipet 6 μL من المضادات الحيوية المعالجة P. aeruginosa من الخطوة 2.7 باستخدام ماصة P20 وبقعة في 6 مواقف الأقمار الصناعية متساوية البعد على دائرة نصف قطرها 2.8 سم متحدة المركز حول مركز الطبق عن طريق الاقتراب من طرف pipet في زاوية (10 إلى 45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة الاكتشاف ، والأنابيب وصولا إلى المحطة الأولى ، ولمس agar مع قطرة السائل فقط(الشكل 1D).
    2. تجنب لمس أجار مع طرف pipet كما أنه يضر أجار. استخدام قالب الطلاء للاتساق(الرقم التكميلي S1). انتقل إلى الخطوة 2.8.
  8. استبدال أغطية طبق بيتري واضحة مع أغطية سوداء المحرز في الخطوة 1.9(الشكل 2A).
  9. ضع لوحات أجار المحتشدة على ماسح ضوئي في حاضنة محددة عند 37 درجة مئوية مع حمام مائي سعة 10 لتر للحفاظ على الرطوبة بنسبة 75٪(الشكل 1E، الشكل 2B).
    تنبيه: لا تزعج الخلايا المرقطة على لوحات أجار المحتشدة. الحفاظ على لوحات تواجه في جميع الأوقات.

3. الحصول على صورة مع الماسح الضوئي

  1. قم بتقليل الإضاءة المحيطة لأطباق بيتري عن طريق ربط النسيج الأسود غير اللامع برف 40-60 سم فوق ماسح المستندات المسطح. تأمينه باستخدام العلاقات الرمز البريدي(الشكل 2B).
  2. سيتم التحكم في الماسح الضوئي باستخدام برنامج المسح الضوئي وبرنامج البرمجة النصية التلقائي.
    1. في برنامج المسح الضوئي، حدد الوضع المنزلي (الشكل 3A). التقاط الصور بالألوان عن طريق تحديد اللون تحت نوع الصورة. لتعيين جودة الصورة، حدد جودة أخرى ضمن الوجهة وضبط الدقة إلى 300 نقطة في البوصة. الحفاظ على الحجم القياسي للصور عن طريق تحديد الأصل لحجم الهدف. اترك جميع الخيارات ضمن تعديلات الصور دون تحديد لجودة الصورة القياسية.
      ملاحظة: يتم تعيين حجم الهدف إلى الأصل بشكل افتراضي. لتحديد خيارات أخرى لحجم الهدف، انقر على المعاينة أولاً.
  3. تعيين مسار حفظ الصور عن طريق النقر على رمز المجلد إلى يمين المسح الضوئي لفتح إعدادات حفظ الملف(الشكل 3A).
    1. حدد وجهة المجلد لحفظ الصور عن طريق تحديد أخرى تحت الموقع وانقر على استعراض. اختر مجلدًا لحفظ الصور.
    2. قم بتسمية الصور في مربع نص البادئة. تعيين رقم البدء 001 لبدء تسمية تسلسل للصور. تعيين تنسيق الملف إلى JPEG عن طريق اختيار JPEG (*.jpg) للكتابة تحت تنسيق الصورة وانقر على خيارات لضبط التفاصيل. تعيين جودة تنسيق الصورة عن طريق ضبط مستوى الضغط إلى 16، الترميز إلى قياسي، والتحقق من تضمين ملف تعريف المحكمة الجنائية الدولية. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة(الشكل 3B).
    3. اترك الخيار الأول دون تحديد ("الكتابة فوق أي ملفات تحمل نفس الاسم") وتحقق من الخيارات التالية 3 ("إظهار مربع الحوار هذا قبل الفحص التالي"، و"فتح مجلد الصور بعد المسح الضوئي"، و"إظهار مربع حوار إضافة صفحة بعد المسح الضوئي"). انقر فوق موافق لإغلاق النافذة
    4. تحقق من جودة الصورة من خلال النقر على معاينة. تظهر نافذة المعاينة، ويصبح رمز الفحص وظيفيًا(الشكل 3C).
  4. استخدم برنامج البرمجة لأتمتة الحصول على الصورة. نقرات البرنامج النصي المقدمة على المسح الضوئي في إطار المسح الضوئي وموافق في إطار إعدادات حفظ الملفات في 30 دقيقة فترات.
    1. استيراد البرنامج النصي عن طريق النقر على المهمة | استيراد وتحديد كل من Single_scan.tsk و Idle_scanning.tsk (ملفات TSK المقدمة كملفات تكميلية 1 و 2). انظر الشكل 3دال.
      ملاحظة: Single_scan.tsk النقرات على زر المسح الضوئي في إطار المسح الضوئي وموافق في إطار إعدادات حفظ الملفات. Idle_scanning.tsk ينشط Single_scan.tsk كل 30 دقيقة. يمكن للمرء تغيير تردد المسح الضوئي عن طريق تغيير تنشيط Idle_scanning.tsk.
    2. تمكين المسح التلقائي على فترات 30 دقيقة عن طريق تحديد كل من المسح الخمول (المستوردة) والمسح الضوئي الفردي (المستوردة)، والنقر على الحق في المسح الخمول (المستوردة)، والنقر على اليسار على تمكين (الشكل 3D، الرقم التكميلي S2).
      ملاحظة: يعمل المسح التلقائي حتى يقوم المستخدم بإيقاف البرنامج النصي يدويًا. لإيقاف البرنامج النصي، حدد المسح الخمول (المستوردة)، انقر فوق الحق في المسح الخمول (المستوردة)، وانقر علىاليسار تمكين . ستتم إزالة علامة الاختيار.

4. تجميع الصور الفاصلالزمني وقياس سرب التنافر

  1. إجراء تحرير الأفلام وتحليل الصور باستخدام ImageJ.
  2. استيراد جميع الصور الممسوحة ضوئيا إلى ImageJ عن طريق النقر على ملف | استيراد | تسلسل الصور وتحديد الصور. في إطار خيارات التسلسل، تحقق من التحويل إلى RGB للحفاظ على الصور بالألوان. يشير عدد الصور إلى عدد الصور المحددة.
  3. حافظ على بدء الصورة عند 1 للبدء من الصورة الأولى في المجلد ومقياس الصور بنسبة 100٪ للحفاظ على الحجم الأصلي للصور. اترك استخدام المكدس الظاهري دون تحديد. انقر فوق موافق وانتظر الصور لتحميل(الشكل 4A).
  4. تعيين مستوى ضغط الفيديو إلى 100 بالنقر على تحرير | خيارات | الإدخال / الإخراج... وضبط جودة JPEG إلى 100.
  5. حفظ الملف كـ .avi بالنقر على ملف | حفظ كما | AVI. ضبط الضغط على JPEG ومعدل الإطار إلى 5 إطارا في الثانية(الشكل 4B). حفظ الفاصل الزمني .avi في المجلد المطلوب.
  6. لتحديد مسافات التنافر سرب، فتح صورة بالقرب من نهاية الفترة يحتشدون في ImageJ. انقر على ملف | فتح الصورة وتحديدها. ضبط المقياس من خلال النقر على تحليل | تعيين المقياس وتحديد المسافة بالبكسل إلى 118، والمسافة المعروفة إلى 1، ونسبة العرض إلى الارتفاع من البكسل إلى 1.0، ووحدة الطول إلى الطول(الشكل 4C). اترك العالمية دون رادع. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
  7. انقر على رمز مستقيم وقياس من وسط المستعمرة في موقف الأقمار الصناعية إلى حافة السكان يحتشدون. حدد تحليل | قياس لجعل نافذة جديدة تظهر مع القياسات (طول)(الشكل 4D).
    ملاحظة: استخدم "+" للتكبير بشكل أقرب و"-" للتصغير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تمثيل الخطوات اللازمة لنمو P. aeruginosa، والإجهاد الخلايا ، وصورة لوحات أجار يحتشدون في الشكل 1. نحن تلقيح مستعمرة واحدة من البرية من نوع P. aeruginosa UCBPP-PA14 سلالة من لوحة LB-agar في 2 مل من مرق LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ورصدت 5 ميكرولتر في وسط لوحة أجار يحتشدون. يكشف تصوير هذه اللوحة عن النمو الأولي في شكل مستعمرة في المركز ثم انتشار الأوتار شعاعياً من المستعمرة(فيديو 1). للحصول على التقييمات الجماعية للاستجابة للإجهاد ، بالإضافة إلى اكتشاف P. aeruginosa في المركز ، يتم خلط 30 ميكرولتر من نفس الثقافة بين عشية وضحاها مع 6 ميكرولتر من 1 ×10 12 pfu/mL DMS3vir أو 6 ميكرولتر من 3 ملغ / مل يتم رصد جنتاميكسين بنسبة 5:1 و 6 ميكرولتر في مواقع الأقمار الصناعية. أسراب الانتقال من وسط لوحات أجار يحتشدون إلى المحيط ويتم صدها من قبل إشارة الإجهاد المنبعثة من البكتيريا التي كانت مصابة phages(فيديو 2، أعلى لوحة اليسار) أو تعامل مع gentamycin(فيديو 2، أعلى لوحة اليمين). Phages(فيديو 2، أسفل لوحة اليسار) أو gentamycin(فيديو 2، أسفل لوحة اليمنى) رصدت وحدها في مواقف الأقمار الصناعية لا تسبب تجمعات سكانية لتجنب هذه المناطق.

Figure 1
الشكل 1: التخطيطي للP. aeruginosa يحتشدون القول والاستجابة الإجهاد الجماعي. (أ)تزرع خلايا P. aeruginosa بين عشية وضحاها (16-18 ح إلى OD600 من حوالي 1.5) في مرق LB عند 37 درجة مئوية و(B)رصدت في منتصف لوحة أجار يحتشدون. تختلط الثقافات بين عشية وضحاها مع(C)phages أو(D)المضادات الحيوية ورصدت في مواقع الأقمار الصناعية للحصول على الاستجابات الإجهاد الجماعي. (E)يتم التقاط صور تصل إلى 6 لوحات على ماسح ضوئي على فترات 30 دقيقة لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد 18 ساعة، P. aeruginosa السكان يحتشدون تجنب(F)الخلايا المصابة phage أو(G)الخلايا المعالجة بالمضادات الحيوية (gentamycin). (H) P. aeruginosa السكان سرب عبر لوحة أجار يحتشدون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد الماسح الضوئي داخل الحاضنة. (أ)أغطية طبق بيتري السوداء التي شيدت في القسم 1. وتستخدم هذه الأغطية أثناء المسح الضوئي للحد من انعكاسات الضوء واستبدال أغطية طبق بيتري واضحة. (ب)يتم وضع الماسح الضوئي المستند مسطحة في حاضنة تعيين في 37 درجة مئوية. يتم وضع ست لوحات مع أغطية سوداء على الماسح الضوئي (الصورة اليسرى). يتم إرفاق النسيج الأسود غير اللامع إلى الحامل 60 سم فوق الماسح الضوئي لتقليل الانعكاسات والضوء الضال (الصورة اليمنى). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الحصول الآلي على الصورة من ماسح المستندات المسطح باستخدام برنامج المسح الضوئي والبرمجة التلقائية. (أ)لقطة شاشة من نافذة المسح الضوئي الرئيسية. تحديد نوع الصورة (اللون) والدقة (300 نقطة في البوصة). يشير المربع الأحمر إلى رمز المجلد لفتح إطار إعدادات حفظ الملف. لاحظ أنه يمكن الضغط على زر المعاينة ولكن يتم تعطيل زر الفحص. (ب)لقطة شاشة من نافذة إعدادات حفظ الملفات لتعيين وجهة المجلد لحفظ الصور، وتسمية الصور، واختيار تنسيق الصور (يسار). يتم استخدام إطار إعدادات المكونات الإضافية لتعيين جودة تنسيق الصورة (يمين). (C)لقطة شاشة من نافذة المسح الضوئي بعد النقر على المعاينة. يمكن النقر فوق زر الفحص بعد الحصول على معاينة. يمكن الآن أن يكون البرنامج الآلي باستخدام برنامج البرمجة (المواد). (D)لقطة شاشة لنوافذ برامج البرمجة النصية تشير إلى زر الاستيراد المستخدم لاستيراد البرامج النصية التلقائية (يسار). بمجرد استيراد Single_scan.tsk و Idle_scanning.tsk، تظهر هذه كمهام في النافذة الرئيسية (يمين). بعد تحديد كل من المهام والنقر عليها بالزر "ممكّن". النقر على اليسار تمكين يبدأ البرامج النصية لمسح تلقائيا في فواصل زمنية 30 دقيقة (يمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل الصورة من تجنب يحتشدون باستخدام ImageJ. (أ)خطوات لاستيراد تسلسل صورة من صور الماسح الضوئي الفاصل الزمني. النقر على ملف | استيراد | تسلسل الصورة في إطار ImageJ الرئيسي (يسار) إحضار نافذة خيارات التسلسل (يمين) ويفتح جميع الصور الممسوحة ضوئيًا. يشير المربع الأحمر إلى الخيار المحدد لتحميل الصور بتنسيق RGB. يتم ترك كافة الخيارات الأخرى بشكل افتراضي. (ب)خطوات لحفظ الفيديو الفاصل الزمني بتنسيق AVI. تحديد الملف | حفظ كما | AVI إحضار حفظ كنافذة AVI. يتم تعيين الضغط إلى JPEG ومعدل الإطار إلى 5 إطارا في الثانية. (C)تعيين وحدات المقياس للصور. اختيار تحليل | تعيين مقياس إحضار إطار مقياس تعيين. بالنسبة لـ 300 صورة من نقطة في البوصة ، فإن المقياس المناسب هو 118 بكسل / سم. يتم رسم خط أصفر من وسط المستعمرات المجهدة إلى حافة الأوتار. اختيار تحليل | يقيس تقارير طول السطر في إطار جديد يسمى النتائج. Ctrl + M هو اختصار لوحة المفاتيح الذي ينفذ القياس دون تحديد عناصر القائمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: أسراب تمثيلية من P. aeruginosa. P. aeruginosa يحتشدون السكان على لوحات أجار يحتشدون التي هي (أ) الجافة ،(ب)العادي ،(C)رطبة ، و (D)رطبة اضافية. لوحات الأجار الدافئة الجافة تمنع معدل سرب P. aeruginosa وتقليل عدد tendrils. رطبة يحتشدون أجار لوحات يسبب تشكيل tendrils كبيرة. في ظل ظروف رطبة إضافية، تشكل الأوتار بشكل غير متساو في جميع أنحاء لوحات أجار يحتشدون. أوقات التجفيف في غطاء محرك السيارة تدفق لامينار والرطوبة المحيطة لها آثار كبيرة على محتوى رطوبة لوحة يحتشدون. الأطباق هي 10 سم أطباق بيتري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Video 1
فيديو 1: فيلم الفاصل الزمني من يحتشدون. البرية من نوع P. aeruginosa شوهدت في وسط لوحة يحتشدون وصورة على الماسح الضوئي على مدى 22 ح. يرجى النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Video 2
فيديو 2: فيلم الفاصل الزمني للاستجابة الإجهاد الجماعي. البرية من نوع P. aeruginosa شوهدت في وسط لوحة يحتشدون. تم رصد مواقع الأقمار الصناعية مع P. aeruginosa التي يتم خلطها بالإضافة إلى ذلك مع (أعلى اليسار) phage أو (أعلى اليمين) gentamycin، أو رصدت فقط مع phage (أسفل اليسار) أو (أسفل اليمين) gentamycin. النقاط البيضاء تشير إلى مركز البقع. تم تصوير لوحات على مدى 16 ح. يرجى النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)

Supplementary Figure 1
الرقم التكميلي S1: قالب الطلاء لاكتشاف خلايا P. aeruginosa. تمثل النقطة السوداء الوسطى منطقة اكتشاف 5 ميكرولتر بين عشية وضحاها P. aeruginosa الثقافة. نصف قطر الدائرة الداخلية هو 2.8 سم بعيدا عن وسط لوحة. يشير التقاطع بين الدائرة الداخلية والخطوط المستقيمة عبر الدائرة الخارجية إلى منطقة اكتشاف 6 ميكرولتر من الخلايا المصابة ب. aeruginosa، أو الخلايا المصابة بالفيج أو المضادات الحيوية المعالجة. تمثل الدائرة الخارجية محيط طبق بيتري 10 سم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 2
الرقم التكميلي S2: أوامر الماكرو لبدء المسح الضوئي بشكل دوريAباستخدام برنامج برمجة Single_scan. (ب)أوامر لمسح في فترات 30 دقيقة. تبدأ المهمة Idle_scanning.tsk Single_scan.tsk ويتم تعيينها للتنشيط في فواصل زمنية 30 دقيقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يركز هذا البروتوكول على تقليل التباين في لوحات الاجار المحتشدة وتوفير طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة للحصول على صور الفاصل الزمني لP. aeruginosa يحتشدون ويستجيبون للإجهاد. يمكن توسيع هذا الإجراء لتصوير الأنظمة البكتيرية الأخرى عن طريق تكييف تكوين الوسائط وظروف النمو. لP. aeruginosa، على الرغم من M9 أو FAB الحد الأدنى من المتوسطة يمكن استخدامها للحث على يحتشدون16،21، البروتوكول المعروض هنا يستخدم M8 المتوسطة مع الأحماض casamino ، الجلوكوز ، وسلفات المغنيسيوم6. P. aeruginosa يحتشدون حساسة لتكوين متوسط مثل توافر الحديد ومصادر المغذيات بما في ذلك الأحماض الأمينية22،23،24. لذلك ، فإن اختيار وسائل الإعلام للوحات أجار يحتشدون يوضح جانبًا مهمًا من مظاهر إثارة الحركة.

التحكم في الرطوبة ودرجة الحرارة في منطقة المختبر المفتوح يمثل واحدة من أكبر التحديات لاتساق الشواهد سرب. تساهم التغيرات الموسمية في التغير في رطوبة لوحات أغار المحتشدة ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الأنماط الدافئة. لذلك ، هناك حاجة إلى التحكم المستمر في الرطوبة النسبية لضمان جودة اللوحة المثلى. بدء مزيل الرطوبة 1 ساعة قبل تجفيف لوحات أجار يحتشدون تحت غطاء تدفق لامير سوف السيطرة على الرطوبة النسبية إلى ثابت 45٪، مع الحفاظ على وقت التجفيف إلى 30 دقيقة. إذا تعذر التحكم في الرطوبة المحيطة ، فإن زيادة وقت التجفيف هو حل بسيط محتمل للتعويض عن البيئات الرطبة. أثناء الاحترار ، يجب أن تبقى الرطوبة النسبية عند 70٪ في حاضنة 37 درجة مئوية لمنع أطباق الأجار من الجفاف. يمكن أن تكون سلة المياه غير المغطاة في الحاضنة بمثابة خزان للمياه. لوحات أجار المحتشدة الجافة تبطئ تطور السكان يحتشدون وتقلل من عدد الأوتار في حين تسبب اللوحات الرطبة بنية وترية واسعة(الشكل 5A-C). اضافية رطبة يحتشدون أجار لوحات منع تشكيل الأوتار واضحة وتسبب tendrils إلى انتشار في نمط غير متساو(الشكل 5D). يمكن استخدام الطريقة الموصوفة هنا للحفاظ على بيئة رطبة ثابتة من شأنها أن تضمن اتساق الاحترار على الألواح(الشكل 5B، فيديو 1). بالإضافة إلى ذلك، حجم لوحة وسمك أجار تلعب دورا في الحفاظ على الرطوبة في لوحة. لقد استخدمنا 10 سم قطرها أطباق بيتري وأضفت 20 مل من محلول أجار يحتشدون لكل لوحة لضمان الاتساق. لا ينصح صب لوحات دون قياس وحدات التخزين. نظرًا للعديد من المتغيرات التي تؤثر على الدفء ، نوصي بتحسين القول لظروف المختبر المحلية ونشدد على أهمية إجراء عمليات تكرار بيولوجية متعددة على دفعات منفصلة من اللوحات لمراقبة أنماط الحشود المتسقة والقابلة للمقارنة.

ميزة طريقة التصوير الفاصل الزمني لتسجيل الحركة يحتشدون هي القدرة على مراقبة تطور الحركة دون الحاجة إلى إزعاج الأسراب. أسلوبنا يخلق مريح الهفوات الزمنية من 6 لوحات في وقت واحد في ظل نفس الظروف، والتي توفر كل من بيئة خاضعة للرقابة للتقييم المتزامن لسلالات متعددة، والظروف التجريبية المتعددة، أو يكرر البيولوجية. كما أن استخدام ستة مواقع ساتلية على كل لوحة ييسر التحليل الإحصائي، ويمكّن استخدام ImageJ من التحديد الكمي للتنافر المحتشد.

الإجراء الموصوف هنا هو طريقة بسيطة لدراسة التفاعل بين السكان الفرعيين من P. aeruginosa: السكان يحتشدون صحية والخلايا وشدد. وراء DMS3vir وgentamycin، يمكن استخدام أنواع إضافية من الفاج، والمضادات الحيوية، والبكتيريا أو الفطريات المتنافسة لدراسة إشارات الإجهاد. على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على P. aeruginosa يحتشدون الحركة، الأنواع البكتيرية الأخرى مثل S. aureus والإشريكية القولونية أيضا تظهر أنماط يحتشدون، لكنها تتطلب وسائل الإعلام تكييفها لسرب10,11. من خلال تحسين التراكيب الإعلامية وظروف اللوحة ، يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل التفاعلات المحتشدة والمتزايدة بين السلالات البكتيرية واستجابات الإجهاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ج.- ل.ب. كتب ونقح المخطوطة. صمم جميع المؤلفين التجارب. J.-L.B. أجرى التجارب والتحليلات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعاهد القومية للصحة K22AI112816 وR21AI139968 منحة لA.S. ومن قبل جامعة كاليفورنيا. ن. م. هـ-ك. تم دعمه من قبل زمالات لوندبيك R220-2016-860 و R251-2017-1070. ولم يكن للممولين أي دور في قرار تقديم العمل للنشر. ليس لدينا مصالح متنافسة لنعلنها

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010 For LB-agar plate and swarming agar plate
Casamino acids BD Difco 223050 For swarming media
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose. For swarming media
Fosfomycin disodium salt Tokyo Chemical Industry F0889 Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Gentamycin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O
LB-Miller BD Difco 244620 For LB broth and LB-agar plates
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391 For swarming media
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 For 5x M8 media
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 For 5x M8 media
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373 For 5x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab AFS27E.118 PA14 strain
DMS3vir O'Toole lab DMS3vir20 Bacteriophage
Supplies
Aluminium oxide sandpaper 3M 150 Fine For black lids
Black fabric Joann PRD7089 Black fabric
Black spray paint Krylon 5592 Matte Black For black lids
Erlenmeyer flask Kimax 26500 250 mL
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1,000 mL
8 inches zip ties Gardner Bender E173770 For attaching black matte fabric
Petri dishes (100 mm x 15 mm) Fisher FB0875712 100 mm x 15 mm polystyrene plates
Wooden sticks Fisher 23-400-102 For streaking and inoculating bacteria
Equipment
Autoclave Market Forge Industries STM-E For sterilizing reagents
25 mL pipette USA Scientific, Inc. 1072-5410 To pipet 20 mL for swarming agar plates
Dehumidifier Frigidaire FAD704DWD 70-pint For maintaing room relative humidity at about 45%
ImageJ NIH v1.52a Software for image analysis
Incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Isotemp waterbath Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C
Laminar flow hood The Baker Company SG603A For drying plates
P-20 pipet Gilson F123601 Spotting on swarming agar plates
Pipette Controller BrandTech accu-jet To pipet 20 mL for swarming agar plates
Roller Drum New Brunswick TC-7 For growth of bacteria at 100 rpm
Scanner Epson Epson Perfection V370 Photo Scanner for imaging plates
Scanner automation software RoboTask Lite v7.0.1.932 For 30 min internals imaging
Scanner image acquisition software Epson v9.9.2.5US Software for imaging plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
  3. Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
  4. Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  5. Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
  6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
  7. Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
  8. Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
  9. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  10. Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
  11. Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
  12. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  13. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
  14. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
  15. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
  16. Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  17. Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
  18. Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
  19. van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
  20. Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
  21. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
  22. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
  23. Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
  24. Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).

Tags

علم الأحياء، العدد 159، Pseudomonas aeruginosa، يحتشدون، الاتصال الخطر البكتيري، استشعار النصاب، PQS، الإجهاد المضادات الحيوية، البكتيريا
تصوير السرب البكتيري والاستجابة الجماعية للإجهاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bru, J. L., Siryaporn, A.,… More

Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (159), e60915, doi:10.3791/60915 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter