Summary
我们详细介绍了一个简单的方法，以产生高分辨率延时电影的伪单一aeruginosa群，响应噬菌体（噬菌体）和抗生素压力使用平板文档扫描仪。这个过程是一种快速而简单的监测蜂群动力学的方法，可应用于研究其他细菌物种的动能和生长。
Abstract
蜂群是许多细菌物种观察到的表面运动形式，包括伪莫纳斯阿鲁吉诺萨和大肠杆菌。在这里，密集的细菌种群在数小时内在典型的肌腱状社区中远距离移动。蜂群对多种因素敏感，包括中等水分、湿度和营养成分。此外，在由抗生素或噬菌体（噬菌体）强调的P.aeruginosa中观察到的集体应激反应，排斥成群的人接近含有压力的区域。此处描述的方法涉及如何控制影响蜂群的关键因素。我们介绍了一种使用平板文档扫描仪以高时态分辨率监控蜂群动力学和集体应力响应的简单方法，并描述了如何编译和执行群的定量分析。这种简单且经济高效的方法提供精确且控制良好的蜂群定量，可扩展到其他类型的板基生长测定和细菌物种。
Introduction
蜂群是协调细菌活力的一种集体形式，它增加11、2、32,3宿主的抗生素耐药性和毒性因子的产生。这种多细胞行为发生在半固体表面上，类似于覆盖肺部上皮膜的粘膜44，5。5生物活性剂通常由蜂群产生，以克服表面张力，这些物的产生由复杂的细胞-细胞信号系统调节，也称为仲裁感应66，7，8。7,8许多种类的细菌能够蜂拥，包括伪莫纳斯阿鲁吉诺萨，金黄色葡萄球菌，和大肠杆菌99，10，11，12。10,11,12细菌产生的蜂群模式多种多样，受表层的物理和化学性质影响，包括营养成分、孔隙度和水分13、14。13,除了表面特性外，生长温度和环境湿度还影响蜂拥动力学的几个方面，包括蜂拥速率和模式12、13、14、15。12,13,14,15影响蜂群的生长变量会带来挑战，影响实验的可重复性和解释结果的能力。在这里，我们描述了一个简单的标准化方法，通过延时成像来监测细菌群的动态。该方法描述了如何控制显著影响蜂群进展的关键生长条件。与传统的群分析方法相比，这种延时成像方法能够同时跟踪多个群在较长时间内和高分辨率的动感。这些方面提高了从监测蜂群中获得的数据深度，并有助于识别影响蜂群的因素。
通过生产和释放黄脂质和3-（3-羟基甲氧）烷基酸进入周边地区6,6、16，促进在P.aeruginosa的蜂拥。抗生素亚致命浓度或噬菌体病毒感染的压力的引入影响群的组织。特别是，这些应力诱导P.aeruginosa释放仲裁传感分子2-七溴二苯基-4-奎诺酮，也称为伪单一奎诺酮信号（PQS）17，18。17,18在包含两个群群的群检测中，由压力引起的种群产生的PQS阻止未经处理的群群进入含有压力的区域（图1）。这种集体压力反应构成一个危险的通信信号系统，警告P.aeruginosa关于附近的威胁18，19。,19压力对P.aeruginosa的影响，集体应激反应的激活，以及群的排斥，都可以通过本文描述的延时成像方法进行可视化。此处描述的协议解释了如何：（1） 准备加盘以进行蜂拥，（2） 培养P. aeruginosa进行两种检测（传统蜂群测定或集体应力响应测定）（图 1），（3）获取延时图像，（4） 使用 ImageJ 编译和分析图像。
简单地说，在蜂拥的加盘中间发现了来自通宵培养的P.aeruginosa，而在卫星位置发现了感染噬菌体或用抗生素治疗的P.aeruginosa。P. aeruginosa蜂拥的进展在放置在湿度调节的 37 °C 培养箱中的消费者文档平板扫描仪上进行监测。扫描仪由软件控制，该软件可在群生长期（通常为 16-20 小时）定期自动扫描板。此方法可生成多达 6 个 10 厘米的蜂拥板的并发延时视频。这些图像被汇编成电影，压力引起的人群对人群的排斥被使用免费的ImageJ软件量化。特别考虑确保不同蜂拥实验之间的一致性和可重复性。
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Protocol
1. 准备加热的加盘P.阿鲁吉诺萨蜂拥延时间推移成像
- 通过在500 mL双蒸馏水中加入 64 克2Na2HPO4、15 克 KH2PO24和 2.5 g NaCl，在玻璃瓶中制备 1 L 5x M8 最小介质。使用额外的 ddH2O. 高压灭菌器将最终体积调整为 1 L，以在室温下消毒和储存液体介质。
- 通过在50 mL ddH2O中加入24.6克MgSO 4+7H24O，在玻璃瓶中制备100 mL的1M MgSO4（硫酸镁），将最终体积调整到100 mL，并附加dH2O.高压灭菌器进行消毒。在室温下存放。
- 通过在50 mL ddH2O中加入20克卡氨基酸，在玻璃瓶中制备100 mL的20%卡氨基酸。2在室温下存放。
- 通过在50 mL ddH2O中加入20克葡萄糖，在玻璃瓶中制备100 mL的20%葡萄糖。2在室温下存放。
- 要制作 10 个蜂拥的加盘，在 100 mL 的 ddH2O 中加入 1 g 的 agar，并将最终体积调整为 160 mL，并在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中加入额外的 ddH2O。通过高压灭菌进行消毒。
- 高压后立即将阿加溶液放入 55°C 水浴中 15 分钟。
- 从水浴中取出agar溶液，加入40 mL的5x M8最小介质，200 μL的1 M MgSO4，2mL的20%葡萄糖，和5 mL的20%卡氨基酸15。混合后立即继续步骤1.6。
注：最终浓度为0.5%的脂酸、1 mM MgSO 4、0.2% 葡萄糖和 0.5% 的卡氨基酸。4
- 使用 25 mL 移液器获得一致的体积，每 10 厘米直径的 Petri 皿中加入 20 mL 的蜂拥加溶液。
注：固定体积的agar溶液很重要，因为体积会影响阿加的干燥时间和水分含量。制作蜂拥的加盘时，避免气泡。 - 通过在室温下将装有盖子的加盘放在一个盖子的单个堆栈中，让加盘凝固。在下一步之前，打开除湿机，将房间的相对湿度降至 40-50% 1 小时。
- 将蜂拥的加盖板干燥 30 分钟，将盖子关闭在 300 英尺3/min 的层流罩中，在室温下相对湿度为 40-50%。将盖子正面放在层压流量罩中，使其朝上干燥盖子的内部。在 4 °C 下存放蜂拥的加盘，长达 24 小时。
- 准备黑色 10 厘米的 Petri 盘盖，以便用砂纸平滑盖子内部，以便成像。将盖子放入包装盒内，并将包装盒放在化学罩下。使用黑色喷漆在盖子内喷洒。让盖子干燥。
注：黑盖可重新用于其他实验。涂盖很重要，这样在扫描过程中不会反射光线。
2. P. aeruginosa和电镀条件的生长
- 通过将 10 克 LB-米勒粉末混合物加入 400 mL ddH2O 中，制备 400 mL 的脂质汤 （LB）。对于 2% LB-agar 培养皿，再添加 8 克 agar。高压灭菌器。
- 将 20 mL 熔融 LB-agar 介质倒入直径为 10 厘米的培养皿中，使其在室温下一夜之间凝固。将液体介质储存在室温下，在 4 °C 下将加盘储存。
- LB-agar Petri 盘上的条纹P. aeruginosa，使用无菌循环或木棍储存在-80°C 的冷冻库存中。在37°C下过夜孵育培养的培养皿。将 LB-agar 板储存在 4 °C 下长达 1 周。
- 用无菌循环或木棒从 Petri 盘中选取单个菌落，将其接种到 2 mL LB 介质中，并在 100 rpm 的滚筒中以 37°C 孵育到 37°C 的培养素过夜（16~18 小时）。
- 从步骤 2.4 开始，使用 P20 移液器和在蜂状板中心处的移液器 5 μL，以高于斑点区域 2.5 厘米的角度接近移液器尖端，移液至第一站，仅用液滴接触 agar（图 1B）。
- 避免用移液尖端触摸 Agar，因为它损坏了 agar。使用模板，以便在不同的蜂拥子板上一致地定位点（补充图 S1）。
- 对于传统的蜂拥检测，仅使用中心点并跳到步骤 2.8。对于集体压力反应测定继续步骤2.6（噬菌体感染）或步骤2.7（抗生素压力）。
- 对于噬菌体感染，从步骤 2.4 将 30 μL 的P. aeruginosa的过夜培养与 6 μL 的 1 x10 12 pfu/mL 噬菌体 DMS3vir20混合。立即继续下一步。
- 从步骤2.6开始，P.aeruginosa-噬菌体混合物的管道6 μL使用P20移液器，在2.8厘米半径的同心圆的6个等距卫星位置点，该圆体以Petri盘为中心，以一个角度（10至45°）接近斑点区域2.5厘米，移液至第一个停止点，仅接触液体滴入的agar（1Figure 1CC）。
- 避免用移液尖端触摸 Agar，因为它损坏了 agar。使用电镀模板进行一致性 （补充图 S1）。继续步骤 2.8。
- 对于抗生素治疗，从步骤 2.4 混合 30 μL 过夜培养P. aeruginosa，6 μL 3mg/mL 根质霉素，10 μL 100 mg/mL 卡纳霉素，或 7.5 μL 100 mg/mL 福霉素。立即继续下一步。
- 从步骤 2.7 开始，使用 P20 移液器对 E. aeruginosa 进行了 6 μL 的抗生素处理P. aeruginosa，并在约 2.8 厘米半径的同心圆上的 6 个等距卫星位置点点，以高于斑点区域 2.5 厘米的角度接近移液器尖端，向下移管到第一站，仅接触液体滴（图 1D）。
- 避免用移液尖端触摸 Agar，因为它损坏了 agar。使用电镀模板进行一致性 （补充图 S1）。继续步骤 2.8。
- 用步骤 1.9 中制作的黑色盖子替换透明培养皿盖（图2A）。
- 将蜂拥的加盘放在扫描仪上，放在37°C的培养箱中，加10升水浴，将湿度保持在75%（图1E，图2B）。
注意：请勿干扰蜂拥的加盘上的斑点细胞。始终保持板朝上。
3. 使用扫描仪采集图像
- 通过将黑色哑光织物连接到平板文档扫描仪上方 40-60 厘米的机架上，减少 Petri 菜肴的环境照明。使用拉链固定它 （图 2B）。
- 扫描仪将使用扫描软件和自动脚本软件进行控制。
- 在扫描软件中，选择"家庭模式"（图3A）。通过在"图像类型"下选择"颜色"来捕获彩色图像。要设置图像质量，请选择"目的地下的其他"，并将分辨率调整为 300 dpi。通过为"目标大小"选择"原始"来保持图像的标准大小。未选中"图像调整"下的所有选项，以检查标准图像质量。
注： 默认情况下，目标大小设置为"原始"。要选择"目标大小"的其他选项，请先单击"预览"。
- 在扫描软件中，选择"家庭模式"（图3A）。通过在"图像类型"下选择"颜色"来捕获彩色图像。要设置图像质量，请选择"目的地下的其他"，并将分辨率调整为 300 dpi。通过为"目标大小"选择"原始"来保持图像的标准大小。未选中"图像调整"下的所有选项，以检查标准图像质量。
- 通过单击扫描右侧的文件夹图标以打开文件保存设置（图 3A），设置图像的保存路径。
- 选择文件夹目标以保存图像，选择选择"位置下的其他"，然后单击"浏览"。选择一个文件夹来保存图像。
- 在"前缀"文本框中命名图像。设置起始编号001 以开始命名图像序列。通过选择 JPEG （*.jpg） 用于"图像格式下的类型"，然后单击"选项"以调整详细信息，将文件格式设置为 JPEG。通过将压缩级别调整为 16、编码为标准来设置图像格式质量，并检查嵌入 ICC 配置文件。单击"确定"关闭窗口（图 3B）。
- 取消选中第一个选项（"覆盖具有相同名称的任何文件"），并选中以下 3 个选项（"下次扫描前显示此对话框"，"扫描后打开图像文件夹"和"扫描后显示添加页面对话框"）。单击"确定"关闭窗口
- 单击"预览 "检查图像质量。将显示预览窗口，扫描图标将变为功能（图 3C）。
- 使用脚本软件自动获取映像。提供的脚本每隔 30 分钟单击"扫描"窗口中的"扫描"和"文件保存设置"窗口中的"确定"。
- 单击"任务 " 导入脚本 |导入并选择Single_scan.tsk和Idle_scanning.tsk（TSK文件作为补充文件 1 和 2提供）。参见图 3D。
注： Single_scan.tsk单击"扫描"窗口中的"扫描"按钮，在"文件保存设置"窗口中单击"确定"。Idle_scanning.tsk每 30 分钟激活一次Single_scan.tsk。一个可以通过改变Idle_scanning.tsk的激活来改变扫描频率。 - 通过选择空闲扫描（导入）和单扫描（导入），右键单击空闲扫描（导入），并左键单击启用（图 3D，补充图 S2），实现 30 分钟间隔的自动扫描。
注： 自动扫描将一直运行，直到用户手动停止脚本。要停止脚本，请选择空闲扫描（导入），右键单击空闲扫描（导入），然后左键单击"已启用"。复选标记将被删除。
- 单击"任务 " 导入脚本 |导入并选择Single_scan.tsk和Idle_scanning.tsk（TSK文件作为补充文件 1 和 2提供）。参见图 3D。
4. 编译延时图像和测量沼泽排斥
- 使用 ImageJ 执行影片编辑和图像分析。
- 单击"文件" 将所有扫描的图像导入 ImageJ |进口 |图像序列并选择图像。在"序列选项"窗口中，选中"转换为 RGB"以保持图像为颜色。图像数表示所选图像数。
- 将起始图像保持在 1 处以从文件夹中的第一张图片开始，并将图像缩放为 100%，以节省图像的原始大小。保持"保留不使用未选中使用虚拟堆栈"。单击"确定"并等待图像加载 （图 4A）。
- 单击"编辑 " 将视频压缩级别设置为 100 选项 |输入/输出...并将JPEG 质量调整为 100。
- 单击"文件" 将文件保存为 .avi |另存为 |AVI.将压缩调整到 JPEG 和帧速率到 5 fps（图 4B）。将 .avi 延时保存在所需的文件夹中。
- 要量化蜂拥距离，在 ImageJ 中，在蜂拥期结束时打开图像。单击文件 |打开并选择图像。通过单击"分析" 调整比例 |将"比例"和"距离"设置为像素118，已知距离为 1，像素宽长比设置为 1.0，并将长度单位设置为厘米（图 4C）。保持全局未选中。单击"确定"关闭窗口。
- 单击"直线"图标，从卫星位置的殖民地中心到蜂群边缘进行测量。选择分析 |使用测量值（长度）显示新窗口的度量（图 4D）。
注： 使用"+"放大更近，"-"缩小。
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Representative Results
生长P.aeruginosa的步骤，应力细胞，和图像的蜂拥的加盘在图1中表示。我们接种了一个野生型P.aeruginosa UCBPP-PA14菌株从LB-agar板在2 mL的LB汤在37°C过夜，并在蜂拥的加板中心发现5μL。这个板块的延时成像显示，在中心以殖民地的形式出现初始生长，然后从殖民地径向传播肌腱（视频1）。对于集体应力反应测定，除了在中心发现P.aeruginosa外，在卫星位置以5：1和6μL的比例将相同的隔夜培养物的30μL与6 μL的1 x12 pfu/mL DMS3vir或6 μL 3mg/mL根分霉素的比例混合。蜂群从蜂状的加盘中心移动到外围，被感染噬菌体（视频2，左上板）或用根分霉素（视频2，右上板）治疗的细菌发出的应力信号击退。单独在卫星位置发现的Phages（视频2，左下板）或根卡霉素（视频2，右下角板）不会导致蜂群避开这些区域。
图1：P.aeruginosa蜂拥测定和集体压力反应的原理图。（A） P. aeruginosa细胞在 37 °C 和（B）在蜂状板中间的 LB 肉汤中过夜（16-18 h 至 OD600约 1.5）。隔夜培养物与 （C） 噬菌体或 （D） 抗生素混合在一起，并在卫星位置发现用于集体压力响应测定。（E） 在扫描仪上以 30 分钟间隔在 37 °C 下以 16-18 小时的速度成像多达 6 个板。18小时后，P. aeruginosa蜂群避免 （F） 感染噬菌体或 （G） 用抗生素 （gentamycin） 治疗的细胞.（H） P. aeruginosa种群群聚于蜂拥的加盘上.请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：培养箱内的扫描仪设置。（A） 第 1 节内建造的黑培养皿盖。这些盖子在扫描过程中用于减少光反射和更换透明培养皿盖。（B） 平板文件扫描仪放置在37°C的培养箱中。扫描仪上放置了六个带黑色盖子的板（左图）。黑色遮罩织物连接到扫描仪上方 60 厘米的机架上，以进一步减少反射和杂散光（右图）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：使用扫描和自动脚本软件从平板文档扫描仪进行自动图像采集。（A） 主扫描窗口的屏幕截图。选择图像类型（颜色）和分辨率（300 dpi）。红色方块指示文件夹图标以打开"文件保存设置"窗口。请注意，可以按下"预览"按钮，但"扫描"按钮已禁用。（B） 文件保存设置窗口的屏幕截图，用于设置文件夹目标以保存图像、命名图像以及选择图像格式（左图）。"插件设置"窗口用于设置图像格式质量（右图）。（C） 单击预览后扫描窗口的屏幕截图。获取预览后，可单击"扫描"按钮。该程序现在可以使用脚本软件 （材料） 进行自动化。（D） 脚本软件窗口的屏幕截图，指示用于导入自动化脚本的导入按钮（左图）。导入Single_scan.tsk 和 Idle_scanning.tsk 后，这些窗口将显示为主窗口中的任务（右）。选择两个任务并右键单击它们后，将显示"已启用"按钮。左键单击"启用"可启动脚本，以 30 分钟间隔（右）自动扫描。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：使用 ImageJ 避免蜂群的图像分析。（A） 从延时扫描器图像导入图像序列的步骤。点击文件 |进口 |主 ImageJ 窗口中的图像序列（左）将打开"序列选项"窗口（右），并打开所有扫描的图像。红色方块表示选中以 RGB 格式加载图像的选项。所有其他选项都保留为默认值。（B） 以 AVI 格式保存延时视频的步骤。选择文件 |另存为 |AVI 将"保存为 AVI"窗口。压缩设置为 JPEG，帧速率设置为 5 fps。（C） 设置图像的比例单位。选择分析 |设置"缩放"将"设置缩放"窗口打开。对于 300 个 dpi 图像，适当的比例为 118 像素/厘米（D） 防止蜂群的测量。黄线从应力的殖民地中心绘制到肌腱的边缘。选择分析 |度量值在标记为"结果"的新窗口中报告行的长度。Ctrl + M 是一种键盘快捷键，无需选择菜单项即可执行测量。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：代表群P.阿鲁吉诺萨。P. aeruginosa蜂拥在蜂拥的加盘上， 是 （A） 干燥，（B ） 正常， （C） 潮湿， 和 （D） 额外的潮湿.干蜂状的加盘抑制P.aeruginosa的蜂群速率，减少肌腱的数量。潮湿的加状板会导致形成大肌腱。在额外的潮湿条件下，在整个蜂拥的加盘中，肌腱形成不均匀。层压流量罩的干燥时间和环境湿度对蜂塞板水分含量有显著影响。菜肴是10厘米的培养皿。请点击此处查看此图形的较大版本。
视频 1：蜂拥而至的延时电影。野生型P.aeruginosa在蜂群板的中心被发现，并在22小时的过程中在扫描仪上被成像。请点击这里观看这个视频。（右键单击以下载。
视频 2：集体压力反应的延时电影。在蜂群板的中心发现了野生型P.aeruginosa。卫星位置被发现与P.aeruginosa，与（左上）噬菌体或（右上）根卡霉素混合，或只发现（左下）噬菌体或（右下）根霉素。白点表示斑点的中心。板在16小时的过程中被成像，请点击这里观看这个视频。（右键单击以下载。
补充图 S1：用于发现P. aeruginosa细胞的电镀模板。中间黑点表示5μL过夜P.阿鲁吉诺萨区域性的斑点区域。内圆的半径距离板中心 2.8 厘米。内圈与穿过外圈的直线的交点表示应力P.aeruginosa、噬菌体感染或抗生素治疗细胞的6μL的斑点区域。外圆代表10厘米的培养皿的周长。请点击此处查看此图形的较大版本。
补充图 S2：宏命令定期开始扫描使用脚本软件. （A） Single_scan.tsk 中的宏命令将光标移动到扫描窗口中的扫描，单击扫描，在"文件保存设置"窗口中移动到"确定"，然后单击"确定"。（B） 命令每隔 30 分钟扫描一次。任务Idle_scanning.tsk 从Single_scan.tsk 开始，设置为以 30 分钟间隔激活。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议侧重于最小化蜂状板的变异性，并提供一种简单且低成本的方法，以获取P. aeruginosa的延时图像，并响应应力。通过调整介质组成和生长条件，可以扩展到图像其他细菌系统。对于P.aeruginosa，虽然M9或FAB最小介质可用于诱导蜂拥16，21，,21这里介绍的协议使用M8介质与卡氨基酸，葡萄糖和硫酸镁6。P. aeruginosa蜂群对中等成分敏感，如铁的可得性和营养来源，包括氨基酸22、23、24。23,2422因此，为蜂群板选择介质说明了对蜂群活力的一个重要方面。
控制开放式实验室区域的湿度和温度是群检测一致性的最大挑战之一。季节性变化导致蜂状板水分的变异性，从而显著影响蜂群模式。因此，需要持续控制相对湿度，以确保最佳的板质量。在将溢出流量罩下的暖状加板干燥前1小时开始，将相对湿度控制在恒定的45%，将干燥时间保持到30分钟。如果环境湿度无法控制，增加干燥时间是补偿潮湿环境的潜在简单解决方案。在蜂拥期间，37 °C 孵化器的相对湿度应保持在 70%，以防止加盘干燥。孵化器中未封顶的水箱可以用作蓄水池。干蜂状板减缓了蜂群的进展，减少了肌腱的数量，而潮湿的板块则会导致宽的肌腱结构（图5A+C）。额外的湿润的加状物板可防止明显的肌腱形成，并导致肌腱以不均匀的图案扩散（图5D）。此处描述的方法可用于保持恒定的潮湿环境，以确保板上蜂拥的一致性（图 5B，视频 1）。此外，板尺寸和包厚在保持板中的水分方面起着一定的作用。我们使用直径为 10 厘米的培养皿，并每盘添加 20 mL 的蜂拥液，以确保一致性。不建议不测量体积的浇注板。由于影响蜂群测定的许多变量，我们建议将测定优化到当地实验室条件，我们强调在单独的批次板上执行多个生物复制以观察一致和可比较的蜂群模式的重要性。
延时成像方法记录蜂拥运动性的优点是能够观察运动的进展，而无需打扰群。我们的方法在相同的条件下方便地同时创建6个板的延时，为同时评估多个菌株、多个实验条件或生物复制提供了受控环境。在每个板上使用六个卫星位置还有助于统计分析和使用 ImageJ，从而能够量化蜂拥的排斥。
这里描述的程序是一个简单的方法来研究P.aeruginosa的亚种群之间的相互作用：一个健康的蜂群和有压力的细胞。除了DMS3vir和根霉素之外，还可用于研究压力信号的其他类型的噬菌体、抗生素和竞争细菌或真菌。虽然这种方法侧重于P.aeruginosa蜂拥运动，其他细菌物种，如S.Aureus和大肠杆菌也表现出蜂群模式，但他们需要适应的介质，以群10，11。10,11通过优化介质成分和板条件，该方法可用于分析蜂群、细菌菌株和应力反应之间的蜂群相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
J.-L.B.、A.S.和N.M.H-K.撰写和修订手稿。所有作者都设计了这些实验。J.-L.B.进行了实验和分析。这项工作得到了NIH授予K22AI112816和R21AI139968赠款给A.S.和加利福尼亚大学的支持。N.M.H-K.得到伦德贝克奖学金R220-2016-860和R251-2017-1070的支持。资助者在将作品提交出版的决定中没有任何作用。我们没有相互竞争的利益可申报。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
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