Summary
Wir beschreiben eine einfache Methode, um hochauflösende Zeitrafferfilme von Pseudomonas aeruginosa Schwärmen zu produzieren, die mit einem Flachbett-Dokumentenscanner auf Bakteriophage (Phagen) und Antibiotikastress reagieren. Dieses Verfahren ist eine schnelle und einfache Methode zur Überwachung der Schwärmedynamik und kann angepasst werden, um die Beweglichkeit und das Wachstum anderer Bakterienarten zu untersuchen.
Abstract
Schwärmen ist eine Form der Oberflächenbeweglichkeit, die bei vielen Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa und Escherichia colibeobachtet wird. Hier bewegen sich dichte Bakterienpopulationen im Laufe der Stunden über große Entfernungen in charakteristischen rankenförmigen Gemeinschaften. Das Schwärmen ist empfindlich gegenüber mehreren Faktoren, einschließlich mittlerer Feuchtigkeit, Feuchtigkeit und Nährstoffgehalt. Darüber hinaus wehrt die kollektive Stressreaktion, die bei P. aeruginosa beobachtet wird, die durch Antibiotika oder Bakteriophagen (Phagen) gestresst sind, Schwärme ab, sich dem Bereich zu nähern, der den Stress enthält. Die hier beschriebenen Methoden befassen sich mit der Kontrolle der kritischen Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen. Wir führen eine einfache Methode ein, um die Schwärmedynamik und die kollektive Stressreaktion mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Flachbett-Dokumentenscanner zu überwachen und zu beschreiben, wie eine quantitative Analyse von Schwärmen kompiliert und durchgeführt wird. Diese einfache und kostengünstige Methode ermöglicht eine präzise und gut kontrollierte Quantifizierung des Schwarms und kann auf andere Arten von plattenbasierten Wachstumstests und Bakterienarten ausgedehnt werden.
Introduction
Schwärmen ist eine kollektive Form der koordinierten bakteriellen Beweglichkeit, die Antibiotikaresistenz und Produktion von Virulenzfaktoren im Wirt1,2,3erhöht. Dieses multizelluläre Verhalten tritt auf halbfesten Oberflächen auf, die denen von Schleimschichten ähneln, die Epithelmembranen in der Lungeabdecken 4,5. Biosurfactants werden üblicherweise von Schwärmepopulationen produziert, um die Oberflächenspannung auf Oberflächen zu überwinden, und die Produktion dieser stoffe wird durch komplexe Zell-Zell-Signalsysteme reguliert, auch bekannt als Quorum-Sensing6,7,8. Viele Arten von Bakterien sind in der Lage zu schwärmen, einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, und Escherichia coli9,10,11,12. Die von Bakterien erzeugten Schwarmmuster sind vielfältig und werden durch die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberflächenschicht beeinflusst, einschließlich Nährstoffzusammensetzung, Porosität und Feuchtigkeit13,14. Neben den Oberflächeneigenschaften beeinflussen Wachstumstemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit verschiedene Aspekte der Schwärmedynamik, einschließlich Schwarmrate und Muster12,13,14,15. Die Wachstumsvariablen, die das Schwärmen beeinflussen, schaffen Herausforderungen, die sich auf die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit zur Interpretation von Ergebnissen auswirken. Hier beschreiben wir eine einfache standardisierte Methode, um die Dynamik von Bakterienschwärmen durch Zeitraffer-Bildgebung zu überwachen. Die Methode beschreibt, wie kritische Wachstumsbedingungen gesteuert werden können, die das Fortschreiten des Schwärmens erheblich beeinflussen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Schwarmanalyse ermöglicht diese Zeitraffer-Bildgebungsmethode die gleichzeitige Verfolgung der Beweglichkeit mehrerer Schwärme während längerer Zeiträume und mit hoher Auflösung. Diese Aspekte verbessern die Tiefe der Daten, die durch die Überwachung von Schwärmen gewonnen werden können, und erleichtern die Identifizierung von Faktoren, die das Schwärmen beeinflussen.
Das Schwärmen in P. aeruginosa wird durch die Herstellung und Freisetzung von Rhamnolipiden und 3-(3-Hydroxyalkanoyloxy)alkanoic Säuren in die Umgebung 66,16erleichtert. Die Einführung von Stress aus subtödlichen Konzentrationen von Antibiotika oder Infektionen durch Phagenviren wirkt sich auf die Organisation von Schwärmen aus. Insbesondere veranlassen diese Spannungen P. aeruginosa, das Quorum-Sensing-Molekül 2-Heptyl-3-hydroxy-4-chinolon, auch bekannt als Pseudomonas-Chinolonsignal (PQS)17,18,freizusetzen. In Schwarm-Assays, die zwei Populationen von Schwärmen enthalten, wehrt PQS, die von der stressinduzierten Population produziert werden, unbehandelte Schwärme ab, die in das Gebiet eindringen, das den Stress enthält (Abbildung 1). Diese kollektive Stressreaktion stellt ein Gefahrenkommunikationssignalsystem dar, das P. aeruginosa vor nahegelegenen Bedrohungen warnt18,19. Die Auswirkungen von Stress auf P. aeruginosa, die Aktivierung der kollektiven Stressreaktion und die Abstoßung von Schwärmen können mit der hier beschriebenen Zeitraffer-Bildgebungsmethode visualisiert werden. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie: (1) Agarplatten für schwärmen, (2) Kultur P. aeruginosa für zwei Arten von Assays (traditionelle Schwarm-Assays oder kollektive Stressreaktions-Assays) (Abbildung 1), (3) Zeitrafferbilder erfassen und (4) ImageJ zum Kompilieren und Analysieren der Bilder verwenden.
Kurz gesagt, P. aeruginosa aus einer Nachtkultur wird in der Mitte einer schwärmenden Agarplatte gesichtet, während P. aeruginosa, die mit Phagen infiziert oder mit Antibiotika behandelt werden, an den Satellitenpositionen gesichtet werden. Das Fortschreiten des P. aeruginosa-Schwarms wird auf einem Verbraucherdokument-Flachbettscanner überwacht, der in einem feuchtigkeitsregulierten 37 °C-Inkubator platziert wird. Der Scanner wird von einer Software gesteuert, die die Platten in regelmäßigen Abständen über die Schwarmwachstumsphase, in der Regel 16 bis 20 H, automatisch scannt. Diese Methode liefert gleichzeitige Zeitraffervideos von bis zu sechs 10 cm Schwarmplatten. Die Bilder werden in Filmen zusammengestellt und die Abstoßung von Schwärmen durch stressinduzierte Populationen wird mit frei verfügbarer ImageJ-Software quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wird der Gewährleistung der Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Schwarmexperimenten gewidmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung Schwärmender Agarplatten für P. aeruginosa Schwärmen Zeitraffer-Imaging
- Bereiten Sie 1 L 5x M8 Mindestmedium in einer Glasflasche vor, indem Sie 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4und 2,5 g NaCl in 500 ml doppeldestilliertem Wasser (ddH2O) hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen auf 1 L mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav ein, um flüssige Medien bei Raumtemperatur zu sterilisieren und zu lagern.
- Bereiten Sie 100 ml 1 M MgSO4 (Magnesiumsulfat) in einer Glasflasche vor, indem Sie 24,6 g MgSO4•7H2O in 50 ml ddH2O hinzufügen. Passen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav zur Sterilisation an. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Bereiten Sie 100 ml 20% Casaminosäuren in einer Glasflasche vor, indem Sie 20 g Casaminosäuren in 50 ml ddH2O hinzufügen. Passen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Autoklav enumnieren, um es zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Bereiten Sie 100 ml 20% Glukose in einer Glasflasche vor, indem Sie 20 g Glukose in 50 ml ddH2O hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit zusätzlichem ddH2O. Sterilisieren durch Filtration mit 0,22 m Filter. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Um 10 schwärmende Agarplatten herzustellen, fügen Sie 1 g Agar in 100 ml ddH2O hinzu und stellen Sie das Endvolumen auf 160 ml mit zusätzlichem ddH2O in einem 250 ml ErlenmeyerKolben ein. Sterilisieren durch Autoklavieren.
- Unmittelbar nach dem Autoklavieren die Agarlösung 15 min in ein 55 °C-Wasserbad geben.
- Entfernen Sie die Agar-Lösung aus dem Wasserbad und fügen Sie 40 ml 5x M8 minimale Medien, 200 l von 1 M MgSO4, 2 ml 20% Glukose und 5 ml 20% Casaminosäuren15. Fahren Sie unmittelbar nach dem Mischen mit Schritt 1.6 fort.
HINWEIS: Die Endkonzentrationen sind 0,5% Agar, 1 mM MgSO4,0,2% Glukose und 0,5% Casaminosäuren.
- Mit einer 25 ml Pipette für gleichmäßiges Volumen 20 ml der Schwarmagarlösung pro Petrischale 10 cm Hinzufügen.
HINWEIS: Ein festes Volumen der Agarlösung ist wichtig, da das Volumen die Trocknungszeit und den Feuchtigkeitsgehalt des Agars beeinflusst. Vermeiden Sie Blasen, wenn Sie die schwärmenden Agarplatten machen. - Lassen Sie den Agar erstarren, indem Sie die schwärmenden Agarplatten in einem einzigen Stapel mit Deckeln auf der Bank bei Raumtemperatur auf die Bank legen. Schalten Sie den Luftentfeuchter ein, um die relative Luftfeuchtigkeit des Raumes vor dem nächsten Schritt auf 40–50% 1 h zu verringern.
- Trocknen Sie die schwärmenden Agarplatten für weitere 30 min mit den Deckeln in einer laminaren Durchflusshaube bei 300 ft3/min mit 40–50% relativer Luftfeuchtigkeit bei Raumtemperatur. Trocknen Sie das Innere der Deckel, indem Sie sie nach oben in die laminare Strömungshaube legen. Schwärmende Agarplatten bei 4 °C für bis zu 24 h lagern.
- Bereiten Sie schwarze 10 cm Petrischalendeckel für die Bildgebung vor, indem Sie die Innenseite des Deckels mit Schleifpapier glätten. Legen Sie die Deckel in eine Verpackungsbox und legen Sie die Verpackung unter eine chemische Haube. Sprühen Sie die Deckel mit schwarzer Sprühfarbe in die Deckel. Lassen Sie die Deckel trocknen.
HINWEIS: Schwarze Deckel können für weitere Experimente wiederverwendet werden. Es ist wichtig, dass die Deckel so lackiert sind, dass sie beim Scannen kein Licht reflektieren.
2. Wachstum von P. aeruginosa und Plating Bedingungen
- Bereiten Sie 400 ml Lysogeny-Brühe (LB) vor, indem Sie 10 g LB-Miller-Pulvermischung in 400 ml ddH2O geben. Für 2% LB-Agar Petri-Gerichte, fügen Sie eine zusätzliche 8 g Agar. Autoklav zu sterilisieren.
- 20 ml geschmolzenes LB-Agar-Medium in Petrischalen mit 10 cm Durchmesser gießen und bei Raumtemperatur über Nacht erstarren lassen. Flüssigmedien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 °C lagern.
- Streak P. aeruginosa auf einer LB-Agar Petrischale aus einem gefrorenen Vorrat, der bei -80 °C mit sterilen Schlaufen oder Holzstäben gelagert wird. Die Petrischale über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen. LB-Agar-Platte bis zu 1 Woche bei 4 °C lagern.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Petrischale mit einer sterilen Schleife oder Holzstab, impfen Sie es in 2 ml LB Medium, und bebrüten die Kultur zur Sättigung über Nacht (16-18 h) bei 37 °C in einer Walzentrommel bei 100 U/min.
- Pipetten Sie 5 l der Nachtkultur von Schritt 2,4 mit einer P20 Pipette und Spot in der Mitte der schwärmenden Agarplatte, indem Sie sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10–45°) 2,5 cm über dem Sichtbereich nähern, bis zum ersten Stopp pfeifen und den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen berühren (Abbildung 1B).
- Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Vorlage, um den Spot konsistent über verschiedene Schwarm-Agar-Platten zu positionieren (Zusatzabbildung S1).
- Verwenden Sie für herkömmliche Schwarm-Assays nur den Mittelpunkt, und fahren Sie mit Schritt 2.8 fort. Für kollektive Stressreaktion Assays weiterhin Schritt 2.6 (für Phageninfektion) oder Schritt 2.7 (für Antibiotika-Stress).
- Bei einer Phageninfektion 30 l Nachtkultur von P. aeruginosa ab Schritt 2,4 mit 6 x l von 1 x 1012 pfu/ml Phagen DMS3vir20mischen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- Pipette 6 l des P. aeruginosa-phagenmischung aus Schritt 2.6 mit einer P20 Pipette und Spot an 6 äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 cm Radius konzentrischen Kreis, der an der Petrischale zentriert wird, indem man sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10 bis 45°) 2,5 cm über dem Sichtbereich nähert, bis zum ersten Stopp abpfeifen und den Agar nur mit dem Flüssigkeitstropfen berührt(Abbildung 1C).
- Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Beschichtungsvorlage für Konsistenz (Ergänzende Abbildung S1). Fahren Sie mit Schritt 2.8 fort.
- Mischen Sie bei Antibiotika-Behandlungen 30 l Übernachtkultur P. aeruginosa ab Schritt 2,4 mit 6 l mit 3 mg/ml Gentamycin, 10 l mit 100 mg/ml Kanamycin oder 7,5 l mit 100 mg/ml Fosfomycin. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- Pipette 6 l von Antibiotika behandelt P. aeruginosa von Schritt 2.7 mit einer P20 Pipette und Punkt an 6 äquidistanten Satellitenpositionen auf einem 2,8 cm Radius konzentrischen Kreis um die Mitte der Schale, indem sie sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10 bis 45°) 2,5 cm über dem Fleckenbereich nähern, bis zum ersten Stopp pfeifen und den Agar mit nur dem Flüssigkeitstropfen berühren (Abbildung 1D).
- Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da er den Agar beschädigt. Verwenden Sie eine Beschichtungsvorlage für Konsistenz (Ergänzende Abbildung S1). Fahren Sie mit Schritt 2.8 fort.
- Ersetzen Sie die klaren Petrischalendeckel durch schwarze Deckel aus Schritt 1.9 (Abbildung 2A).
- Legen Sie die Schwärme-Agar-Platten auf einen Scanner in einem Inkubator, der bei 37 °C mit einem 10-Liter-Wasserbad eingestellt ist, um die Luftfeuchtigkeit bei 75 % zu halten (Abbildung 1E, Abbildung 2B).
VORSICHT: Stören Sie die gefleckten Zellen auf den schwärmenden Agarplatten nicht. Halten Sie Die Platten jederzeit nach oben gerichtet.
3. Bildaufnahme mit Scanner
- Verringern Sie die Umgebungsbeleuchtung der Petri-Schalen, indem Sie schwarzes mattes Gewebe an einem Rack 40–60 cm über dem Flachbett-Dokumentenscanner befestigen. Sichern Sie es mit Zip-Krawatten (Abbildung 2B).
- Der Scanner wird über eine Scansoftware und eine automatische Skriptsoftware gesteuert.
- Wählen Sie in der Scansoftware den Startmodus aus (Abbildung 3A). Erfassen Sie Bilder in Farbe, indem Sie Unter Bildtyp Farbe auswählen. Um die Bildqualität festzulegen, wählen Sie Unter Ziel Die Option Andere aus, und passen Sie die Auflösung auf 300 dpi an. Behalten Sie die Standardgröße für die Bilder bei, indem Sie Original für Zielgrößeauswählen. Lassen Sie alle Optionen unter Bildanpassungen auf Standardbildqualität deaktiviert.
HINWEIS: Die Zielgröße ist standardmäßig auf Original festgelegt. Um andere Optionen für die Zielgröße auszuwählen, klicken Sie zuerst auf Vorschau.
- Wählen Sie in der Scansoftware den Startmodus aus (Abbildung 3A). Erfassen Sie Bilder in Farbe, indem Sie Unter Bildtyp Farbe auswählen. Um die Bildqualität festzulegen, wählen Sie Unter Ziel Die Option Andere aus, und passen Sie die Auflösung auf 300 dpi an. Behalten Sie die Standardgröße für die Bilder bei, indem Sie Original für Zielgrößeauswählen. Lassen Sie alle Optionen unter Bildanpassungen auf Standardbildqualität deaktiviert.
- Legen Sie den Speicherpfad von Bildern fest, indem Sie auf das Ordnersymbol rechts neben dem Scan klicken, um die Dateispeichereinstellungen zu öffnen (Abbildung 3A).
- Wählen Sie das Ordnerziel zum Speichern von Bildern aus, indem Sie unter Standort andere auswählen und auf Durchsuchenklicken. Wählen Sie einen Ordner aus, um die Bilder zu speichern.
- Benennen Sie die Bilder im Textfeld Präfix. Legen Sie startnumber 001 fest, um mit der Namenssequenz für die Bilder zu beginnen. Legen Sie das Dateiformat auf JPEG fest, indem Sie JPEG (*.jpg) für Typ unter Bildformat auswählen und auf Optionen klicken, um Detailsanzupassen. Legen Sie die Bildformatqualität fest, indem Sie die Komprimierungsstufe auf 16, die Codierung auf Standard und das Einbetten des ICC-Profilsanpassen. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen (Abbildung 3B).
- Lassen Sie die erste Option deaktiviert ("Alle Dateien mit demselben Namen überschreiben") und aktivieren Sie die 3 nächsten Optionen ("Dieses Dialogfeld vor dem nächsten Scan anzeigen", "Bildordner nach dem Scannen öffnen" und "Seite hinzufügen nach dem Scannen anzeigen"). Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen
- Überprüfen Sie die Bildqualität, indem Sie auf Vorschauklicken. Das Vorschaufenster wird angezeigt, und das Scan-Symbol wird funktionsfähig (Abbildung 3C).
- Verwenden Sie die Skriptsoftware, um die Bildaufnahme zu automatisieren. Das bereitgestellte Skript klickt im Scan-Fenster auf Scannen und im Fenster Dateispeichereinstellungen in 30 Min. auf OK.
- Importieren des Skripts durch Klicken auf Aufgabe | Importieren und wählen Sie sowohl Single_scan.tsk als auch Idle_scanning.tsk (TSK-Dateien als Zusatzdateien 1 und 2). Siehe Abbildung 3D.
HINWEIS: Single_scan.tsk klickt auf die Schaltfläche Scannen im Scan-Fenster und OK im Fenster Dateispeichern. Idle_scanning.tsk aktiviert Single_scan.tsk alle 30 Min. Man kann die Scan-Frequenz ändern, indem man die Aktivierung von Idle_scanning.tsk. - Aktivieren Sie das automatische Scannen in 30 Minuten Intervallen, indem Sie sowohl den Leerlaufscan (importiert) als auch den Einzelscan (importiert)auswählen, mit der rechten Maustaste auf Idle scanning (importiert)klicken und mit der linken Maustaste auf Aktiviert klicken (Abbildung 3D, Zusatzabbildung S2).
HINWEIS: Das automatische Scannen wird ausgeführt, bis der Benutzer das Skript manuell stoppt. Um das Skript zu beenden, wählen Sie Leerlaufscannen (importiert),rechts klicken Sie auf Leerlaufscannen (importiert), und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Aktiviert. Das Häkchen wird entfernt.
- Importieren des Skripts durch Klicken auf Aufgabe | Importieren und wählen Sie sowohl Single_scan.tsk als auch Idle_scanning.tsk (TSK-Dateien als Zusatzdateien 1 und 2). Siehe Abbildung 3D.
4. Kompilieren von Zeitrafferbildern und Messen der Schwarmabstoßung
- Führen Sie Filmbearbeitung und Bildanalyse mit ImageJ durch.
- Importieren Sie alle gescannten Bilder in ImageJ, indem Sie auf Datei | Import | Bildsequenz und wählen Sie die Bilder aus. Aktivieren Sie im Fenster Sequenzoptionen die Option In RGB konvertieren, um Bilder in Farbe zu halten. Die Anzahl der Bilder gibt die Anzahl der ausgewählten Bilder an.
- Halten Sie das Startbild bei 1, um mit dem ersten Bild im Ordner zu beginnen, und skalieren Sie Bilder auf 100 %, um die Originalgröße der Bilder zu erhalten. Lassen Sie den virtuellen Stapel verwenden deaktiviert. Klicken Sie auf OK, und warten Sie, bis bilder geladen werden (Abbildung 4A).
- Legen Sie die Videokomprimierungsstufe auf 100 fest, indem Sie auf Bearbeiten | Optionen | Eingang/Ausgang... und passen Sie die JPEG-Qualität auf 100 an.
- Speichern Sie die Datei als .avi, indem Sie auf Datei | Speichern als | AVI. Anpassen der Komprimierung auf JPEG und Bildrate auf 5 fps (Abbildung 4B). Speichern Sie den .avi-Zeitraffer im gewünschten Ordner.
- Um Schwarmabstoßungsentfernungen zu quantifizieren, öffnen Sie ein Bild am Ende der Schwarmperiode in ImageJ. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Bild, und wählen Sie es aus. Passen Sie die Skala an, indem Sie auf Analysieren | Legen Sie Skalierung fest und legen Sie Den Abstand in Pixel auf 118, Den bekannten Abstand auf 1, das Pixel-Seitenverhältnis auf 1,0 und die Längeneinheit auf cm fest (Abbildung 4C). Lassen Sie Global ungeprüft. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen.
- Klicken Sie auf das Symbol Gerade und messen Sie von der Mitte der Kolonie an der Satellitenposition bis zum Rand der schwärmenden Population. Analysieren auswählen | Messen, damit ein neues Fenster mit den Maßen (Länge) angezeigt wird (Abbildung 4D).
HINWEIS: Verwenden Sie "+", um näher und "-" zu zoomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Schritte zum Wachstum von P. aeruginosa, Stress die Zellen, und Bild die Schwarm Agar Platten sind in Abbildung 1dargestellt . Wir haben eine einzige Kolonie von Wild-Typ P. aeruginosa UCBPP-PA14-Stamm von einer LB-Agar-Platte in 2 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 °C geimpft und 5 l in der Mitte der schwärmenden Agarplatte gesichtet. Die Zeitraffer-Bildgebung dieser Platte zeigt das anfängliche Wachstum in Form einer Kolonie in der Mitte und dann die Ausbreitung der Ranken radial aus der Kolonie (Video 1). Für kollektive Stressreaktionstests werden zusätzlich zu P. aeruginosa in der Mitte 30 l der gleichen Nachtkultur mit 6 l von 1 x 1012 pfu/ml DMS3vir oder 6 'L von 3 mg/ml Gentamycin im Verhältnis 5:1 und 6 'L an den Satellitenpositionen gesichtet. Schwärme bewegen sich von der Mitte der schwärmenden Agarplatten in die Peripherie und werden durch ein Stresssignal abgewehrt, das von den Bakterien emittiert wird, die mit Phagen infiziert wurden (Video 2, obere linke Platte) oder mit Gentamycin behandelt wurden (Video 2, obere rechte Platte). Phages (Video 2, bottom left plate) oder gentamycin (Video 2, bottom right plate), die allein an den Satellitenpositionen gesichtet werden, führen nicht dazu, dass Schwarmpopulationen diese Gebiete meiden.
Abbildung 1: Schematische swarming assay und kollektive Stressreaktion von P. aeruginosa. (A) P. aeruginosa Zellen werden über Nacht (16–18 h bis OD600 von ca. 1,5) in LB-Brühe bei 37 °C und (B) in der Mitte der schwärmenden Agarplatte gesichtet angebaut. Nachtkulturen werden mit (C) Phagen oder (D) Antibiotika gemischt und an den Satellitenpositionen für kollektive Stressreaktionstests gesichtet. (E) Bis zu 6 Platten werden auf einem Scanner in 30 min Intervallen für 16–18 h bei 37 °C abgebildet. Nach 18 h vermeiden P. aeruginosa Schwarmpopulationen (F) Zellen, die mit Phagen oder (G) mit Antibiotika (Gentamycin) behandelt werden. (H) P. aeruginosa Populationen schwärmen über die schwärmende Agarplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Scanner-Setup im Inkubator. (A) Schwarze Petrischalendeckel aus Abschnitt 1. Diese Deckel werden beim Scannen verwendet, um Lichtreflexionen zu reduzieren und klare Petrischalendeckel zu ersetzen. (B) Der Flachbett-Dokumentenscanner wird in einem Inkubator auf 37 °C gelegt. Sechs Platten mit schwarzen Deckeln sind auf dem Scanner platziert (linkes Bild). Das schwarze, matte Gewebe wird 60 cm über dem Scanner am Rack befestigt, um Reflexionen und Streulicht weiter zu reduzieren (rechtes Bild). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Automatisierte Bildaufnahme vom Flachbett-Dokumentenscanner mit der Scan- und automatischen Skriptsoftware. (A) Screenshot des Hauptfensters für den Scan. Auswahl des Bildtyps (Farbe) und Auflösung (300 dpi). Das rote Quadrat zeigt das Ordnersymbol an, um das Fenster Dateispeichereinstellungen zu öffnen. Beachten Sie, dass die Vorschautaste gedrückt werden kann, aber die Scan-Schaltfläche deaktiviert ist. (B) Screenshot des Fensters Dateispeichernseinstellungen, um das Ordnerziel zum Speichern von Bildern, Benennen der Bilder und Auswählen des Formats der Bilder (links) festzulegen. Das Fenster Plug-In-Einstellungen wird verwendet, um die Bildformatqualität festzulegen (rechts). (C) Screenshot des Scan-Fensters nach einem Klick auf Vorschau. Die Schaltfläche Scannen kann angeklickt werden, nachdem eine Vorschau erworben wurde. Das Programm kann nun mit der Skriptsoftware (Materialien) automatisiert werden. (D) Screenshot der Skriptsoftwarefenster, die die Schaltfläche Import anzeigen, die zum Importieren der Automatisierungsskripts verwendet wird (links). Sobald Single_scan.tsk und Idle_scanning.tsk importiert wurden, werden diese als Aufgaben im Hauptfenster (rechts) angezeigt. Nachdem Sie beide Aufgaben ausgewählt und mit der rechten Maustaste darauf geklickt haben, wird die Schaltfläche Aktiviert angezeigt. Wenn Sie mit der linken Maustaste Aktivieren klicken, werden die Skripts gestartet, um automatisch in 30 Minuten Intervallen zu scannen (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bildanalyse der Schwarmvermeidung mit ImageJ. (A) Schritte zum Importieren einer Bildsequenz aus den Zeitrafferscannerbildern. Klicken auf Datei | Import | Die Bildsequenz im ImageJ-Hauptfenster (links) öffnet das Fenster Sequenzoptionen (rechts) und öffnet alle gescannten Bilder. Das rote Quadrat zeigt die aktivierte Option zum Laden von Bildern im RGB-Format an. Alle anderen Optionen bleiben standardmäßig. (B) Schritte zum Speichern des Zeitraffervideos im AVI-Format. Auswählen von Datei | Speichern als | AVI öffnet das Fenster Speichern als AVI. Die Komprimierung ist auf JPEG und Frame Rate auf 5 fps eingestellt. (C) Festlegen der Skalierungseinheiten für Bilder. Auswählen von Analysieren | Set Scale schalten das Fenster Skalieren festlegen auf. Für 300 dpi-Bilder beträgt die entsprechende Skala 118 Pixel/cm. (D) Messung der Vermeidung von Schwarmpopulationen. Eine gelbe Linie wird von der Mitte der gestressten Kolonien bis zum Rand der Ranken gezogen. Auswählen von Analysieren | Measure meldet die Länge der Zeile in einem neuen Fenster mit der Bezeichnung Ergebnisse. Strg + M ist eine Tastenkombination, die die Messung durchführt, ohne die Menüelemente auszuwählen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Schwärme von P. aeruginosa. P. aeruginosa Schwärmen Populationen auf schwärmenden Agarplatten, die (A) trocken, (B) normal, (C) feucht sind, und (D) extra feucht. Trockene Schwärme-Agarplatten hemmen die Schwarmrate von P. aeruginosa und reduzieren die Anzahl der Ranken. Feuchtschwärme-Agarplatten verursachen die Bildung von großen Ranken. Unter besonders feuchten Bedingungen bilden sich Ranken ungleichmäßig in den schwärmenden Agarplatten. Trocknungszeiten in der laminaren Strömungshaube und Umgebungsfeuchtigkeit haben erhebliche Auswirkungen auf den Feuchtigkeitsgehalt der Schwarmplatte. Die Gerichte sind 10 cm Petri-Gerichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Zeitrafferfilm des Schwärmens. Wildtyp P. aeruginosa wurden in der Mitte der Schwarmplatte gesichtet und im Laufe von 22 h auf dem Scanner abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Zeitrafferfilm der kollektiven Stressreaktion. Wildtyp P. aeruginosa wurden in der Mitte der Schwarmplatte gesichtet. Satellitenpositionen wurden mit P. aeruginosa gesichtet, die zusätzlich mit (oben-links) Phagen oder (oben rechts) Gentamycin oder nur mit (unten-links) Phagen oder (unten-rechts) Gentamycin gemischt werden. Weiße Punkte zeigen die Mitte der Flecken an. Die Platten wurden im Laufe von 16 h abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzende Abbildung S1: Beschichtungsvorlage zum Erkennen von P. aeruginosa Zellen. Der mittlere schwarze Punkt stellt den Fleckenbereich von 5 L über Nacht P. aeruginosa Kultur dar. Der Radius des inneren Kreises ist 2,8 cm von der Mitte der Platte entfernt. Der Schnittpunkt zwischen dem inneren Kreis und den geraden Linien über den äußeren Kreis zeigt die Sichtfläche von 6 l gestressten P. aeruginosa, phageninfizierten oder antibiotikabehandelten Zellen an. Der äußere Kreis stellt den Umfang von 10 cm Petrischale dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S2: Makrobefehle, um in regelmäßigen Abständen mit dem Scannen mit einer Skriptsoftware zu beginnen. (A) Die Makrobefehle in Single_scan.tsk bewegt den Cursor zum Scannen im Scan-Fenster, klicken auf Scannen, wechseln zu OK im Fenster Dateispeichern und klicken auf OK. (B) Befehle zum Scannen in 30 min Intervallen. Die Aufgabe Idle_scanning.tsk beginnt Single_scan.tsk und wird in 30-min-Intervallen aktiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Minimierung der Variabilität in Schwärmen von Agarplatten und die Bereitstellung einer einfachen und kostengünstigen Methode, um Zeitrafferbilder von P. aeruginosa zu erfassen, die schwärmen und auf Stress reagieren. Dieses Verfahren kann durch Anpassung der Medienzusammensetzung und der Wachstumsbedingungen auf andere Bakterielle Systeme erweitert werden. Für P. aeruginosa, obwohl M9 oder FAB minimales Medium verwendet werden kann, um Schwärmenuszenkann 16,21, das hier vorgestellte Protokoll verwendet M8 Medium mit Casaminosäuren, Glukose und Magnesiumsulfat6. P. aeruginosa Schwärme ist empfindlich auf mittlere Zusammensetzung wie EisenVerfügbarkeit und Nährstoffquellen einschließlich Aminosäuren22,23,24. Daher veranschaulicht die Auswahl von Medien für schwärmende Agarplatten einen wichtigen Aspekt der Beschrauchung der Motilität.
Die Kontrolle der Luftfeuchtigkeit und Temperatur in einem offenen Laborbereich stellt eine der größten Herausforderungen für die Konsistenz von Schwarmtests dar. Saisonale Veränderungen tragen zur Variabilität der schwärmenden Agarplatten Feuchtigkeit bei, die sich erheblich auf Schwärmemuster auswirken kann. Daher ist eine konstante Kontrolle der relativen Luftfeuchtigkeit erforderlich, um eine optimale Plattenqualität zu gewährleisten. Wenn Sie den Luftentfeuchter 1 h vor dem Trocknen der schwärmenden Agarplatten unter der laminaren Strömungshaube starten, wird die relative Luftfeuchtigkeit auf konstante 45 % kontrolliert, wodurch die Trocknungszeit auf 30 min bleibt. Wenn die Umgebungsfeuchtigkeit nicht kontrolliert werden kann, ist die Erhöhung der Trocknungszeit eine mögliche einfache Lösung, um feuchte Umgebungen zu kompensieren. Während des Schwärmens sollte die relative Luftfeuchtigkeit im 37 °C-Inkubator bei 70 % bleiben, um das Austrocknen der Agarplatten zu verhindern. Ein nicht gekapselter Wasserbehälter im Inkubator kann als Wasserreservoir dienen. Trockene Schwärme-Agarplatten verlangsamen das Fortschreiten der Schwarmpopulationen und reduzieren die Anzahl der Ranken, während feuchte Platten eine breite Rankenstruktur verursachen (Abbildung 5A-C). Extra feuchte Schwärme-Agarplatten verhindern eine klare Rankenbildung und bewirken, dass sich die Ranken in einem ungleichmäßigen Muster ausbreiten(Abb. 5D). Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um eine konstante feuchte Umgebung aufrechtzuerhalten, die die Konsistenz des Schwärmens auf Platten gewährleistet (Abbildung 5B, Video 1). Darüber hinaus spielen Plattengröße und Agardicke eine Rolle bei der Rückhaltung der Feuchtigkeit in der Platte. Wir haben Petrischalen mit 10 cm Durchmesser verwendet und 20 ml Schwarmagarlösung pro Platte hinzugefügt, um konsistenzgebissagt zu sein. Gießplatten ohne Messvolumen werden nicht empfohlen. Aufgrund der vielen Variablen, die den Schwarmtest beeinflussen, empfehlen wir, den Test auf lokale Laborbedingungen zu optimieren, und wir betonen die Bedeutung der Durchführung mehrerer biologischer Replikationen auf separaten Plattenchargen, um konsistente und vergleichbare Schwarmmuster zu beobachten.
Der Vorteil der Zeitraffer-Bildgebungsmethode zur Erfassung der Schwärmender Motilität ist die Fähigkeit, das Fortschreiten der Bewegung zu beobachten, ohne die Schwärme stören zu müssen. Unsere Methode erstellt bequem Zeitraffer von 6 Platten gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen, was sowohl eine kontrollierte Umgebung für die gleichzeitige Bewertung mehrerer Stämme, mehrere experimentelle Bedingungen oder biologische Replikationen bietet. Die Verwendung von sechs Satellitenpositionen auf jeder Platte erleichtert zusätzlich die statistische Analyse und die Verwendung von ImageJ ermöglicht die Quantifizierung der Schwärmeabstoßung.
Das hier beschriebene Verfahren ist eine einfache Methode, um die Wechselwirkung zwischen Subpopulationen von P. aeruginosazu untersuchen: eine gesunde Schwarmpopulation und gestresste Zellen. Neben DMS3vir und Gentamycin können zusätzliche Arten von Phagen, Antibiotika und konkurrierenden Bakterien oder Pilzen verwendet werden, um Stresssignale zu untersuchen. Obwohl sich diese Methode auf P. aeruginosa Schwärmen Motilität konzentriert, andere Bakterienarten wie S. aureus und E. coli zeigen auch Schwarmmuster, aber sie erfordern angepasste Medien, um10,11zu schwärmen. Durch die Optimierung von Medienzusammensetzungen und Plattenbedingungen kann diese Methode angewendet werden, um Schwärme, Schwarm-Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen und Stressreaktionen zu analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., und N.M.H-K. das Manuskript geschrieben und überarbeitet. Alle Autoren haben die Experimente entworfen. J.-L.B. führte die Experimente und Analysen durch. Diese Arbeit wurde durch den NIH Award K22AI112816 und R21AI139968 Stipendium an A.S. und die University of California unterstützt. N.M.H-K. wurde unterstützt von den Lundbeck Fellowships R220-2016-860 und R251-2017-1070. Die Geldgeber spielten bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen, keine Rolle. Wir haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
