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Biology

बैक्टीरियल झुंड और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की समय चूक इमेजिंग

Published: May 23, 2020 doi: 10.3791/60915
Automatic Translation
1, 1,2, 3
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

Summary

हम स्यूडोमोनास एरुजिनोसा झुंड ों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-चूक फिल्मों का उत्पादन करने के लिए एक सरल विधि का विस्तार करते हैं जो फ्लैटबेड दस्तावेज़ स्कैनर का उपयोग करके बैक्टीरियोफेज (फेज) और एंटीबायोटिक तनाव का जवाब देते हैं। यह प्रक्रिया झुंड गतिशीलता की निगरानी के लिए एक तेज और सरल विधि है और अन्य जीवाणु प्रजातियों के गतिशीलता और विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

झुंड सतह का एक रूप है जो स्यूडोमोनास एरुजिनोसा और एस्चेरिचिया कोलाईसहित कई जीवाणु प्रजातियों में देखा जाता है । यहां, बैक्टीरिया की घनी आबादी घंटों के दौरान विशिष्ट टेंड्रल के आकार के समुदायों में बड़ी दूरी पर जाती है। झुंड मध्यम नमी, आर्द्रता और पोषक तत्वों की सामग्री सहित कई कारकों के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया, जो पी एरुजिनोसा में मनाई जाती है जो एंटीबायोटिक ्स या बैक्टीरियोफेज (फेज) द्वारा जोर दिया जाता है, तनाव वाले क्षेत्र में आने से झुंड को पीछे हटा देता है। यहां वर्णित विधियां झुंड को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारकों को नियंत्रित करने के तरीके को संबोधित करती हैं। हम एक सपाट दस्तावेज़ स्कैनर का उपयोग करके उच्च लौकिक संकल्प के साथ झुंड की गतिशीलता और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए एक सरल विधि पेश करते हैं, और वर्णित करते हैं कि झुंडों का मात्रात्मक विश्लेषण कैसे संकलित और प्रदर्शन किया जाए। यह सरल और लागत प्रभावी विधि झुंड के सटीक और अच्छी तरह से नियंत्रित मात्रा प्रदान करता है और प्लेट आधारित विकास परख और जीवाणु प्रजातियों के अंय प्रकार के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Introduction

झुंड समन्वित जीवाणु गतिशीलता का एक सामूहिक रूप है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध को बढ़ाता है और मेजबान1,2,3में उग्रता कारकों का उत्पादन करता है । यह बहुकोशिकीय व्यवहार अर्ध-ठोस सतहों पर होता है जो फेफड़ोंमेंएपिथेलियल झिल्ली को कवर करने वाले श्लेष्म परतों के समान होते हैं 4,5। सतहों पर सतह के तनाव को दूर करने के लिए आमतौर पर झुंड वाली आबादी द्वारा बायोसर्फेक्टेंट का उत्पादन किया जाता है और इनके उत्पादन को जटिल सेल-सेल सिग्नलिंग सिस्टम द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसे कोरम सेंसिंग6,7,7,8के रूप में भी जाना जाता है। बैक्टीरिया की कई प्रजातियां झुंड में सक्षम हैं, जिनमें स्यूडोमोनास एरुजिनोसा, स्टेफिलोकोकस ऑरियसऔर एस्चेरिचिया कोलाई9,10,,11,,12शामिल हैं। बैक्टीरिया द्वारा बनाए गए झुंड के पैटर्न विविध होते हैं और पोषक तत्वों की संरचना, porosity, और नमी13,,14सहित सतह परत के भौतिक और रासायनिक गुणों से प्रभावित होते हैं । सतही गुणों के अलावा, विकास तापमान और परिवेश आर्द्रता झुंड की गतिशीलता के कई पहलुओं को प्रभावित करती है, जिसमें झुंड की दर और पैटर्न12,,13,,14,,15शामिल हैं। झुंड को प्रभावित करने वाले विकास चर चुनौतियां पैदा करते हैं जो प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और परिणामों की व्याख्या करने की क्षमता को प्रभावित करते हैं। यहां, हम समय-चूक इमेजिंग के माध्यम से बैक्टीरियल झुंड की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एक सरल मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। विधि का वर्णन कैसे महत्वपूर्ण विकास की स्थिति है कि काफी झुंड की प्रगति को प्रभावित को नियंत्रित करने के लिए । झुंड विश्लेषण के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इस समय चूक इमेजिंग विधि समय की विस्तारित अवधि के दौरान और उच्च संकल्प के साथ समवर्ती रूप से कई झुंडों की गतिशीलता पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है। ये पहलू डेटा की गहराई में सुधार करते हैं जिन्हें झुंडों की निगरानी से प्राप्त किया जा सकता है और झुंड को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान को सुगम बना सकता है।

पी aeruginosa में झुंड उत्पादन और rhamnolipids और 3-(3-हाइड्रोक्सीअलाकानोइलोक्सी) क्षारनोइक एसिड के आसपास के क्षेत्र6,,16में जारी करने के माध्यम से सुविधा है । एंटीबायोटिक दवाओं या phage वायरस द्वारा संक्रमण की उप घातक सांद्रता से तनाव की शुरूआत झुंड के संगठन को प्रभावित करता है । विशेष रूप से, ये तनाव पी एरुजिनोसा को कोरम संवेदन अणु 2-हेप्टिल-3-हाइड्रोक्सी-4-क्विनोलोन को छोड़ने के लिए प्रेरित करते हैं, जिसे स्यूडोमोनास क्विनोलोन सिग्नल (पीक्यूएस)17,,18के रूप में भी जाना जाता है। झुंड की परख में है कि झुंड की दो आबादी होते हैं, PQS तनाव से प्रेरित आबादी द्वारा उत्पादित तनाव युक्त क्षेत्र में प्रवेश करने से अनुपचारित झुंड repels(चित्रा 1)। यह सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया एक खतरे संचार सिग्नलिंग प्रणाली का गठन करती है जो पी एरुजिनोसा को आसपास के खतरों18,,19के बारे में चेतावनी देती है । पी aeruginosaपर तनाव के प्रभाव, सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की सक्रियता, और झुंड के प्रतिकर्षण समय चूक इमेजिंग विधि का उपयोग कर यहां वर्णित कल्पना की जा सकती है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे करें: (1) झुंड के लिए आगर प्लेटें तैयार करें, (2) संस्कृति पी aeruginosa दो प्रकार के परखों के लिए (पारंपरिक झुंड परख या सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया परख)(चित्र 1), (3)समय चूक छवियों को प्राप्त करने, और (4) छवियों को संकलित करने और विश्लेषण करने के लिए ImageJ का उपयोग करें ।

संक्षेप में, एक रात की संस्कृति से पी aeruginosa एक झुंड आगर प्लेट के बीच में देखा जाता है, जबकि पी aeruginosa कि phage से संक्रमित है या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज उपग्रह पदों पर देखा जाता है । पी aeruginosa झुंड की प्रगति एक उपभोक्ता दस्तावेज़ फ्लैटबेड स्कैनर है कि एक आर्द्रता विनियमित ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखा जाता है पर नजर रखी है । स्कैनर को एक सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो स्वचालित रूप से झुंड विकास अवधि में नियमित अंतराल पर प्लेटों को स्कैन करता है, आमतौर पर 16-20 घंटे। इस विधि से छह 10 सेमी तक की प्लेटों के समवर्ती समय-चूक वीडियो पैदा होते हैं। छवियों को फिल्मों में संकलित किया जाता है और तनाव-प्रेरित आबादी द्वारा झुंडों का प्रतिकर्षण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। विभिन्न झुंड प्रयोगों के बीच स्थिरता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाता है।

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Protocol

1. पी aeruginosa झुंड समय चूक इमेजिंग के लिए झुंड आगर प्लेटें तैयार

  1. एक ग्लास बोतल में 5x M8 न्यूनतम मीडिया के 1 एल तैयार एनए2एचपीओ4• 7H2O, KH2PO4के 15 ग्राम, और 500 मीटर डबल आसुत पानी (डीडीएच2ओ) में NaCl के 2.5 ग्राम जोड़कर। कमरे के तापमान पर तरल मीडिया को स्टरलाइज करने और स्टोर करने के लिए अतिरिक्त डीडीएच2ओ ऑटोक्लेव के साथ अंतिम मात्रा को 1 एल में समायोजित करें।
  2. एक ग्लास बोतल में 1 एम एमजीएसओ4 (मैग्नीशियम सल्फेट) के 100 एमएल तैयार करें, जो 50 एमएल डीडीएच 2 ओ में 24.6 ग्राम एमजीएसओ4•7H2O में 50 एमएल डीडीएच2ओ में जोड़कर अंतिम मात्रा को 100 एमएल में समायोजित करें।2 कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. 50 mL ddH2O. नसबंदी के लिए अतिरिक्त ddH2O. Autoclave के साथ 100 मीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करके एक गिलास की बोतल में 20% casamino एसिड के 100 मीटर तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  4. 50 मीटर डीडीएच2ओ में 20 ग्राम ग्लूकोज जोड़कर कांच की बोतल में 20% ग्लूकोज का 100 मीटर तैयार करें। 0.2 2 माइक्रोन फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा अतिरिक्त डीडीएच2ओ स्टरलीज़ के साथ अंतिम मात्रा को 100 मीटर तक समायोजित करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  5. 10 झुंड आगर प्लेटें बनाने के लिए, ddH2O के 100 mL में आगर के 1 ग्राम जोड़ें और एक 250 mL Erlenmeyer फ्लास्क में अतिरिक्त ddH2O के साथ 160 मीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। ऑटोक्लेविंग से स्टरलाइज करें।
    1. ऑटोक्लेव िंग के तुरंत बाद आगर घोल को 15 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 15 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें।
    2. पानी के स्नान से आगर समाधान निकालें और 5x M8 न्यूनतम मीडिया के 40 मिलीग्राम, 1 एम एमजीएसओ4,2 0% ग्लूकोज के 2 मिलीएल, और 20% कैसामिनो एसिड15के 5 मिलील जोड़ें। मिश्रण के तुरंत बाद 1.6 कदम के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: अंतिम सांद्रता 0.5% आगर, 1 एमएम एमजीएसओ4,0.2% ग्लूकोज, और 0.5% कैसामिनो एसिड हैं।
  6. लगातार मात्रा के लिए 25 mL पिपेट का उपयोग करना, 10 सेमी व्यास पेट्री डिश प्रति झुंड आगर समाधान के 20 mL जोड़ें ।
    नोट: आगर समाधान की एक निश्चित मात्रा महत्वपूर्ण है, क्योंकि मात्रा आगर के सुखाने के समय और नमी की मात्रा को प्रभावित करती है। झुंड आगर प्लेटें बनाते समय बुलबुले से बचें।
  7. कमरे के तापमान पर बेंच पर 1 घंटे के लिए ढक्कन के साथ एक ही ढेर में झुंड आगर प्लेटों रखकर आगर को जमना करने की अनुमति दें। अगले चरण से पहले कमरे की सापेक्ष आर्द्रता को 40-50% 1 घंटे तक कम करने के लिए डिह्यूमिडिफायर चालू करें।
  8. कमरे के तापमान पर 40-50% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 300 फुट3/न्यूनतम पर लैमिनार प्रवाह हुड में बंद ढक्कन के साथ एक अतिरिक्त 30 टिन के लिए झुंड आगर प्लेटों को सुखाएं। ढक्कन के इंटीरियर को लैमिनार फ्लो हुड में चेहरा रखकर सुखा लें। 24 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों को स्टोर करें।
  9. सैंडपेपर के साथ ढक्कन के अंदर चौरसाई करके इमेजिंग के लिए ब्लैक 10 सेमी पेट्री डिश लिड्स तैयार करें। एक पैकेजिंग बॉक्स के अंदर ढक्कन रखो और एक रासायनिक हुड के नीचे पैकेजिंग बॉक्स जगह है । काले स्प्रे पेंट का उपयोग कर ढक्कन के अंदर स्प्रे करें। ढक्कन सूखने दें।
    नोट: काले ढक्कन को अतिरिक्त प्रयोगों के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि ढक्कन को चित्रित किया जाता है ताकि वे स्कैनिंग के दौरान प्रकाश को प्रतिबिंबित न करें।

2. पी aeruginosa और चढ़ाना शर्तों के विकास

  1. 400 मिलीग्राम डीडीएच2ओ में एलबी-मिलर पाउडर मिक्स के 10 ग्राम जोड़कर लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) का 400 मिलीएल तैयार करें। 2% पौंड-आगर पेट्री व्यंजन के लिए, आगर के एक अतिरिक्त 8 ग्राम जोड़ें। नसबंदी करने के लिए ऑटोक्लेव।
  2. 10 सेमी व्यास पेट्री व्यंजन में पिघला हुआ पौंड-आगर माध्यम के 20 mL डालो और उन्हें रात भर कमरे के तापमान पर जमना करने के लिए अनुमति देते हैं । कमरे के तापमान पर तरल मीडिया और 4 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों स्टोर करें।
  3. बाँझ छोरों या लकड़ी की छड़ें का उपयोग कर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक जमे हुए स्टॉक से एक पौंड-एरुगिनीनोसा पर लकीर पी aeruginosa। पेट्री डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उल्टा इनक्यूबेट करें। 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एलबी-आगर प्लेट स्टोर करें।
  4. एक बाँझ पाश या लकड़ी की छड़ी के साथ पेट्री डिश से एक एकल कॉलोनी उठाओ, यह 2 mL पौंड माध्यम में टीका, और संस्कृति को संतृप्ति के लिए इनक्यूबेट (16-18 एच) एक रोलर ड्रम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० आरपीएम पर सेट ।
  5. चरण 2.4 से रातोंरात संस्कृति के पाइप्ट 5 माइक्रोन पी 20 पाइप्ट का उपयोग करके और स्पंदन क्षेत्र के ऊपर 2.5 सेमी पाइप्ट टिप से झुंड आगर प्लेट के केंद्र में स्पॉट, पहले स्टॉप पर नीचे पाइपिंग, और केवल तरल ड्रॉप(चित्रा 1बी)के साथ आगर को छूना।
    1. आगर को पिपेट टिप से छूने से बचें क्योंकि इससे आगर को नुकसान पहुंचता है। विभिन्न झुंड आगर प्लेटों(अनुपूरक चित्रा S1)भर में लगातार जगह की स्थिति के क्रम में एक टेम्पलेट का उपयोग करें ।
    2. पारंपरिक झुंड परख के लिए, केवल केंद्र स्थान का उपयोग करें और २.८ कदम छोड़ दें । सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया के लिए परख ों के लिए २.६ कदम जारी (phage संक्रमण के लिए) या कदम २.७ (एंटीबायोटिक तनाव के लिए) ।
  6. phage संक्रमण के लिए, पी aeruginosa की रात की संस्कृति के 30 μL चरण २.४ से 1 x 1012 pfu/mL phage DMS3vir20के 6 μL के साथ मिश्रण । अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    1. पी के पिपेट 6 μL। aeruginosa-चरण 2.6 से phage मिश्रण एक P20 pipet का उपयोग कर और एक 2.8 सेमी त्रिज्या गाढ़ा सर्कल है कि एक कोण पर पाइप टिप आ द्वारा पेट्री डिश पर केंद्रित है पर 6 समान दूरी की उपग्रह पदों पर जगह (10 से 45 डिग्री) 2.5 सेमी स्पॉटिंग क्षेत्र के ऊपर, पहले पड़ाव के लिए नीचे pipetting, और केवल तरल ड्रॉप(चित्रा 1सी)के साथ आगर छू।
    2. आगर को पिपेट टिप से छूने से बचें क्योंकि इससे आगर को नुकसान पहुंचता है। स्थिरता(अनुपूरक चित्रा S1)के लिए एक चढ़ाना टेम्पलेट का उपयोग करें । 2.8 कदम के लिए आगे बढ़ें।
  7. एंटीबायोटिक उपचार के लिए, 30 माइक्रोन रातोंरात संस्कृति पी aeruginosa चरण २.४ से 3 मिलीग्राम/mL gentamycin के 6 μL के साथ मिश्रण, १०० मिलीग्राम के 10 μL/mL kanamycin, या १०० मिलीग्राम/mL fosfomycin के ७.५ μL । अगले चरण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    1. एंटीबायोटिक के पाइप 6 μL चरण २.७ से पी aeruginosa का इलाज एक P20 पिपेट का उपयोग कर और एक कोण (10 से 45 डिग्री) २.५ सेमी खोलना क्षेत्र के ऊपर पाइप टिप आ द्वारा पकवान के केंद्र के बारे में एक २.८ सेमी त्रिज्या गाढ़ा सर्कल पर 6 समान दूरी की उपग्रह पदों पर हाजिर, पहले पड़ाव के लिए नीचे pipetting, और केवल तरल ड्रॉप(1 चित्रा 1)Dके साथ आगर छू ।
    2. आगर को पिपेट टिप से छूने से बचें क्योंकि इससे आगर को नुकसान पहुंचता है। स्थिरता(अनुपूरक चित्रा S1)के लिए एक चढ़ाना टेम्पलेट का उपयोग करें । 2.8 कदम के लिए आगे बढ़ें।
  8. स्पष्ट पेट्री डिश ढक्कन को चरण 1.9(चित्र ा 2ए)में बने काले ढक्कन से बदलें।
  9. 75% पर आर्द्रता बनाए रखने के लिए 10 एल पानी स्नान के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर में एक स्कैनर पर झुंड आगर प्लेटें रखें(चित्रा 1ई, चित्रा 2बी)।
    सावधानी: झुंड आगर प्लेटों पर देखा कोशिकाओं को परेशान न करें। प्लेटों को हर समय सामना करना पड़ रहा है।

3. स्कैनर के साथ छवि अधिग्रहण

  1. फ्लैटबेड दस्तावेज़ स्कैनर के ऊपर 40-60 सेमी रैक में काले मैट कपड़े संलग्न करके पेट्री व्यंजनों की परिवेश प्रकाश व्यवस्था को कम करें। ज़िप संबंधों(चित्रा 2बी)का उपयोग करके इसे सुरक्षित करें।
  2. स्कैनर को स्कैनिंग सॉफ्टवेयर और ऑटोमैटिक स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करनियंत्रित किया जाएगा ।
    1. स्कैनिंग सॉफ्टवेयर में, होम मोड (चित्रा 3ए)का चयन करें। इमेज टाइपके तहत रंग का चयन करके छवियों को रंग में कैप्चर करें। इमेज क्वालिटी सेट करने के लिए डेस्टिनेशन के तहत दूसरे का चयन करें और रिजॉल्यूशन को 300 डीपीआई में एडजस्ट करें। लक्ष्य आकारके लिए मूल का चयन करके छवियों के लिए मानक आकार रखें। मानक छवि गुणवत्ता के लिए अनियंत्रित छवि समायोजन के तहत सभी विकल्पों को छोड़ दें।
      नोट: लक्ष्य आकार डिफ़ॉल्ट रूप से मूल करने के लिए सेट किया गया है। टारगेट साइज के लिए अन्य विकल्पों का चयन करने के लिए, पहले पूर्वावलोकन पर क्लिक करें।
  3. फाइल सेव सेटिंग्स(चित्रा 3ए)खोलने के लिए स्कैन के दाईं ओर फ़ोल्डर आइकन पर क्लिक करके छवियों की बचत पथ सेट करें।
    1. स्थान के तहत अन्य का चयन करके छवियों को सहेजने के लिए फ़ोल्डर गंतव्य का चयन करें और ब्राउज़पर क्लिक करें। छवियों को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर चुनें।
    2. उपसर्ग टेक्स्ट बॉक्स में छवियों का नाम दें। छवियों के लिए अनुक्रम का नामकरण शुरू करने के लिए स्टार्ट नंबर 001 सेट करें। छवि प्रारूप के तहत टाइप के लिए जेपीईजी (*.जेपीजी) चुनकर जेपीईजी को फ़ाइल प्रारूप निर्धारित करें और विवरण के लिए समायोजित करने के लिए विकल्पों पर क्लिक करें। Details संपीड़न स्तर को 16 तक समायोजित करके छवि प्रारूप गुणवत्ता सेट करें, मानक के लिए एन्कोडिंग करें, और एम्बेड आईसीसी प्रोफाइलकी जांच करें। खिड़की बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें(चित्रा 3बी)।
    3. पहला विकल्प अनियंत्रित छोड़ दें ("किसी भी फ़ाइल को एक ही नाम के साथ ओवरराइट करें") और 3 अगले विकल्पों ("अगले स्कैन से पहले इस संवाद बॉक्स को दिखाएं", "स्कैनिंग के बाद ओपन इमेज फ़ोल्डर", और "स्कैनिंग के बाद दिखाएं पेज संवाद")। खिड़की बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें
    4. पूर्वावलोकनपर क्लिक करके छवि की गुणवत्ता की जांच करें । पूर्वावलोकन विंडो दिखाई देती है, और स्कैन आइकन कार्यात्मक हो जाता है(चित्रा 3सी)।
  4. छवि अधिग्रहण को स्वचालित करने के लिए स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। प्रदान की गई स्क्रिप्ट स्कैन विंडो में स्कैन पर क्लिक करती है और 30 मिन अंतराल पर फ़ाइल सेव सेटिंग्स विंडो में ओके करती है।
    1. टास्क पर क्लिक करके स्क्रिप्ट आयात करें । आयात और दोनों Single_scantsk और Idle_scanning.tsk (TSK फाइलों पूरक फ़ाइलें 1 और 2के रूप में प्रदान की) का चयन करें । देखें चित्र 3डी।
      नोट: स्कैन विंडो में स्कैन बटन पर Single_scan.tsk क्लिक और फ़ाइल सेव सेटिंग्स विंडो में ओके। Idle_scanning.tsk हर 30 घर Single_scan.tsk सक्रिय करता है । कोई भी Idle_scanning.tskकी सक्रियता को बदलकर स्कैन आवृत्ति बदल सकता है ।
    2. निष्क्रिय स्कैनिंग (आयातित) और एकल स्कैन (आयातित)दोनों का चयन करके 30 मिन अंतराल पर स्वचालित स्कैनिंग को सक्षम करें, निष्क्रिय स्कैनिंग (आयातित)पर सही क्लिक करें, और सक्षम (चित्रा 3डी, अनुपूरक चित्रा S2)पर बाएं क्लिक करें।
      नोट: स्वचालित स्कैनिंग तब तक चलती है जब तक उपयोगकर्ता स्क्रिप्ट को मैन्युअल रूप से बंद नहीं कर देता। स्क्रिप्ट को रोकने के लिए, निष्क्रिय स्कैनिंग (आयातित),सही क्लिक निष्क्रिय स्कैनिंग (आयातित)का चयन करें, और सक्षमपर बाएं क्लिक करें। चेक मार्क हटाया जाएगा।

4. समय चूक छवियों संकलन और झुंड प्रतिकर्षण को मापने

  1. इमेजजे का उपयोग करके फिल्म संपादन और छवि विश्लेषण करें।
  2. फ़ाइल पर क्लिक करके इमेजजे के लिए सभी स्कैन छवियों का आयात करें । आयात । छवि अनुक्रम और छवियों का चयन करें। अनुक्रम विकल्प खिड़की में, छवियों को रंग में रखने के लिए आरजीबी में परिवर्तित की जांच करें। छवियों की संख्या चयनित छवियों की संख्या को इंगित करती है।
  3. छवियों के मूल आकार के संरक्षण के लिए फ़ोल्डर और स्केल छवियों में पहली तस्वीर से 100% पर शुरू करने के लिए 1 पर छवि शुरू रखें। छोड़ दें आभासी ढेर अनियंत्रित का उपयोग करें। ठीक क्लिक करें और छवियों लोड करने के लिए प्रतीक्षा करें(चित्र 4ए)।
  4. एडिट पर क्लिक करके वीडियो संपीड़न स्तर को 100 तक सेट करें। विकल्प । इनपुट/आउटपुट... और जेपीईजी गुणवत्ता को 100 में समायोजित करें।
  5. फ़ाइल पर क्लिक करके एक .avi के रूप में फ़ाइल को बचाओ । के रूप में सहेजें । लवी. जेपीईजी और फ्रेम रेट को 5 एफपीएस(चित्रा 4बी)में संपीड़न समायोजित करें। वांछित फ़ोल्डर में .avi समय-चूक को सहेजें।
  6. झुंड प्रतिकर्षण दूरी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, ImageJ में झुंड अवधि के अंत के पास एक छवि खोलें। क्लिक करें फाइल पर । छवि खोलें और चुनें। विश्लेषण पर क्लिक करके पैमाने को समायोजित करें । स्केल सेट करें और पिक्सेल में 118, ज्ञात दूरी से 1, पिक्सेल पहलू अनुपात से 1.0 और लंबाई की इकाई से सेमी(चित्रा 4सी)में निर्धारित करें। वैश्विक अनियंत्रित छोड़ दें। खिड़की बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें।
  7. सीधे आइकन पर क्लिक करें और झुंड आबादी के किनारे करने के लिए उपग्रह की स्थिति में कॉलोनी के केंद्र से उपाय । विश्लेषण का चयन करें । माप (लंबाई)(चित्रा 4डी)के साथ एक नई खिड़की बनाने के लिए उपाय।
    नोट: ज़ूम आउट करने के लिए करीब और "-" में ज़ूम करने के लिए "+" का उपयोग करें।

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Representative Results

पी aeruginosaबढ़ने के कदम, कोशिकाओं पर जोर, और छवि झुंड आगर प्लेटों चित्र ा 1में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । हमने 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एलबी शोरबा के 2 मिलील में एलबी-एगर प्लेट से जंगली-प्रकार के पी एरुजिनोसा यूसीबीपीपी-पीए14 तनाव की एक कॉलोनी का टीका लगाया और झुंड वाले आगर प्लेट के केंद्र में 5 माइक्रोन देखा। इस प्लेट की समय-चूक इमेजिंग केंद्र में एक कॉलोनी के रूप में प्रारंभिक वृद्धि का पता चलता है और फिर कॉलोनी(वीडियो 1)से टेंड्रल्स के फैलने का पता चलता है। सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया परखों के लिए, केंद्र में पी aeruginosa खोलना के अलावा, एक ही रात संस्कृति के 30 μL 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir या 3 मिलीग्राम के 6 μL के साथ मिलाया जाता है/ झुंड झुंड आगर प्लेटों के केंद्र से परिधि में ले जाते हैं और बैक्टीरिया से संक्रमित बैक्टीरिया द्वारा उत्सर्जित तनाव संकेत से पीछे हट जाते हैं जो फेज(वीडियो 2,शीर्ष बाईं प्लेट) से संक्रमित थे या gentamycin(वीडियो 2,शीर्ष दाईं प्लेट) के साथ इलाज किया जाता है। Phages(वीडियो 2,नीचे बाईं प्लेट) या gentamycin(वीडियो 2,नीचे सही थाली) उपग्रह पदों पर अकेले देखा झुंड आबादी का कारण नहीं है इन क्षेत्रों से बचने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: पी aeruginosa झुंड परख और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया की योजनाबद्ध । (ए) पी aeruginosa कोशिकाओं को रातोंरात उगाया जाता है (16-18 एच लगभग १.५ के ओडी६००) पौंड शोरबा में ३७ डिग्री सेल्सियस और(बी)झुंड आगर प्लेट के बीच में देखा । रातोंरात संस्कृतियों(सी)phages या(डी)एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिलाया जाता है और सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया assays के लिए उपग्रह पदों पर देखा । (ई)अप करने के लिए 6 प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए 30 मिन अंतराल पर एक स्कैनर पर चित्रित किया जाता है। 18 घंटे के बाद, पी aeruginosa झुंड आबादी से बचने(एफ)phage या(जी)एंटीबायोटिक दवाओं (gentamycin) के साथ इलाज कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं । (ज) पी aeruginosa आबादी झुंड आगर प्लेट भर में झुंड । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इनक्यूबेटर के अंदर स्कैनर सेटअप। (A)धारा 1 में निर्मित काले पेट्री डिश ढक्कन। इन ढक्कनों का उपयोग प्रकाश प्रतिबिंब को कम करने और स्पष्ट पेट्री डिश ढक्कन को बदलने के लिए स्कैनिंग के दौरान किया जाता है। (ख)फ्लैटबेड डॉक्यूमेंट स्कैनर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट इनक्यूबेटर में रखा गया है। काले ढक्कन के साथ छह प्लेटें स्कैनर (बाएं छवि) पर रखी जाती हैं। ब्लैक मैट फैब्रिक को प्रतिबिंब और आवारा प्रकाश (सही छवि) को कम करने के लिए स्कैनर के ऊपर रैक 60 सेमी से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्कैनिंग और स्वचालित स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करफ्लैटबेड दस्तावेज़ स्कैनर से स्वचालित छवि अधिग्रहण। (A)मुख्य स्कैन विंडो का स्क्रीनशॉट। छवि प्रकार (रंग) और संकल्प (300 डीपीआई) का चयन। लाल वर्ग फ़ाइल सेव सेटिंग्स विंडो खोलने के लिए फ़ोल्डर आइकन को इंगित करता है। ध्यान दें पूर्वावलोकन बटन दबाया जा सकता है लेकिन स्कैन बटन अक्षम है। (ख)छवियों को सहेजने, छवियों का नामकरण करने और छवियों के प्रारूप (बाएं) चुनने के लिए फाइल सेव सेव सेटिंग्स विंडो का स्क्रीनशॉट। प्लग-इन सेटिंग्स विंडो का उपयोग छवि प्रारूप गुणवत्ता (दाएं) सेट करने के लिए किया जाता है। (C)पूर्वावलोकन पर क्लिक करने के बाद स्कैन विंडो का स्क्रीनशॉट। एक पूर्वावलोकन प्राप्त होने के बाद स्कैन बटन क्लिक करने योग्य है। प्रोग्राम अब स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री) का उपयोग करस्वचालित किया जा सकता है। (D)ऑटोमेशन स्क्रिप्ट (बाएं) आयात करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आयात बटन का संकेत देने वाली स्क्रिप्टिंग सॉफ्टवेयर खिड़कियों का स्क्रीनशॉट। एक बार Single_scantsk और Idle_scanning.tsk आयात कर रहे हैं, इन मुख्य खिड़की में कार्यों के रूप में दिखाई देते है (सही) । दोनों कार्यों का चयन करने और उन्हें सही क्लिक करने के बाद, सक्षम बटन दिखाई देता है। लेफ्ट क्लिक िंग इनसे स्क्रिप्ट 30 मिन इंटरवल (दाएं) पर स्वचालित रूप से स्कैन करने के लिए शुरू होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: ImageJ का उपयोग कर झुंड परिहार की छवि विश्लेषण। (A)समय चूक स्कैनर छवियों से एक छवि अनुक्रम आयात करने के लिए कदम । फ़ाइल पर क्लिक करें । आयात । मुख्य इमेजजे विंडो (बाएं) में इमेज सीक्वेंस अनुक्रम विकल्प खिड़की (दाएं) को लाता है और स्कैन किए गए सभी छवियों को खोलता है। लाल वर्ग आरजीबी प्रारूप में छवियों को लोड करने के लिए चेक किए गए विकल्प को इंगित करता है। अन्य सभी विकल्प डिफ़ॉल्ट के रूप में छोड़ दिए गए हैं। (ख)AVI प्रारूप में समय चूक वीडियो को बचाने के लिए कदम । फ़ाइल का चयन । के रूप में सहेजें । AVI AVI खिड़की के रूप में बचाने के लिए लाता है । संपीड़न जेपीईजी और फ्रेम रेट से 5 एफपीएस तक सेट है। (ग)छवियों के लिए पैमाने पर इकाइयों की स्थापना । विश्लेषण का चयन । सेट स्केल सेट स्केल विंडो को लाएं। ३०० डीपीआई छवियों के लिए, उचित पैमाने पर ११८ पिक्सल/सेमी है ।(डी)झुंड आबादी से परिहार का मापन । तनावग्रस्त कॉलोनियों के केंद्र से टेंड्रल के किनारे तक एक पीली लाइन खींची जाती है। विश्लेषण का चयन । उपाय एक नई खिड़की लेबल परिणाम में लाइन की लंबाई रिपोर्ट । सीटीआरएल + एम एक कीबोर्ड शॉर्टकट है जो मेनू आइटम का चयन किए बिना माप करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पी aeruginosaके प्रतिनिधि झुंड । पी aeruginosa झुंड आगर प्लेटों पर आबादी झुंड है कि(ए)सूखी,(बी)सामांय,(सी)नम, और(डी)अतिरिक्त नम हैं । सूखी झुंड आगर प्लेटें पी एरुजिनोसा की झुंड दर को रोकती हैं और टेंड्रल की संख्या को कम करती हैं। नम झुंड आगर प्लेटों बड़े tendrils के गठन का कारण। अतिरिक्त नम परिस्थितियों में, टेंड्रल्स झुंड आगर प्लेटों में असमान रूप से बनाते हैं। लैमिनार प्रवाह हुड और परिवेश आर्द्रता में सुखाने के समय झुंड प्लेट नमी सामग्री पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। व्यंजन 10 सेमी पेट्री व्यंजन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो 1: झुंड की समय चूक फिल्म । जंगली प्रकार पी aeruginosa झुंड थाली के केंद्र में देखा गया और 22 घंटे के पाठ्यक्रम पर स्कैनर पर छवि थे । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 2
वीडियो 2: सामूहिक तनाव प्रतिक्रिया के समय चूक फिल्म । जंगली प्रकार पी aeruginosa झुंड थाली के केंद्र में देखा गया । उपग्रह पदों पी aeruginosa के साथ देखा गया है कि अतिरिक्त (ऊपरी बाएं) phage या (ऊपरी दाएं) gentamycin, या (कम बाएं) phage या (निचले-दाएं) gentamycin के साथ पूरी तरह से देखा जाता है । सफेद डॉट्स धब्बे के केंद्र का संकेत देते हैं। प्लेटें 16 घंटे के पाठ्यक्रम पर छवि थे । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्रS1: पी aeruginosa कोशिकाओं खोलना के लिए चढ़ाना टेम्पलेट । मध्य काले डॉट 5 μL रातोंरात पी aeruginosa संस्कृति के खोलना क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । इनर सर्कल का त्रिज्या प्लेट के केंद्र से 2.8 सेमी दूर है। बाहरी सर्कल में इनर सर्कल और सीधी रेखाओं के बीच का चौराहा तनावग्रस्त पी एरुजिनोसा,फेज संक्रमित या एंटीबायोटिक दवाओं के इलाज कोशिकाओं के 6 μL के खोलना क्षेत्र को इंगित करता है। बाहरी सर्कल 10 सेमी पेट्री डिश की परिधि का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
पूरक चित्रा S2: मैक्रो आदेश समय-समय पर एक पटकथा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्कैनिंग शुरू करने के लिए ।(A)Single_scanत्स्क में मैक्रो कमांड स्कैन विंडो में स्कैन करने के लिए कर्सर ले जाता है, स्कैन पर क्लिक करता है, फ़ाइल सेव सेटिंग्स विंडो में ओके पर ले जाता है, और ओके पर क्लिक करता है। (ख)30 मिन के अंतराल में स्कैन करने के लिए आदेश । कार्य Idle_scanningtsk Single_scan.tsk शुरू होता है और 30 min अंतराल में सक्रिय करने के लिए सेट है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल झुंड आगर प्लेटों में परिवर्तनशीलता को कम करने और पी aeruginosa झुंड और तनाव का जवाब देने के समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए एक सरल और कम लागत विधि प्रदान करने पर केंद्रित है । इस प्रक्रिया को मीडिया संरचना और विकास की स्थिति को अनुकूल बनाकर अन्य जीवाणु प्रणालियों की छवि तक बढ़ाया जा सकता है। पी aeruginosaके लिए, हालांकि M9 या फैब ंयूनतम माध्यम झुंड16,,21प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल casamino एसिड, ग्लूकोज, और मैग्नीशियम सल्फेट6के साथ M8 माध्यम का उपयोग करता है । पी एरुजिनोसा झुंड मध्यम संरचना जैसे लोहा उपलब्धता और अमीनो एसिड22,,23,,24सहित पोषक तत्वों के स्रोतों के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, झुंड आगर प्लेटों के लिए मीडिया का चयन परख के एक महत्वपूर्ण पहलू को दिखाता है।

एक खुली प्रयोगशाला क्षेत्र में आर्द्रता और तापमान के लिए नियंत्रण झुंड के रूप में स्थिरता के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है । मौसमी परिवर्तन झुंड आगर प्लेटों नमी में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान है, जो काफी झुंड पैटर्न को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, इष्टतम प्लेट गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए सापेक्ष आर्द्रता का निरंतर नियंत्रण आवश्यक है। लैमिनार प्रवाह हुड के नीचे झुंड आगर प्लेटों को सुखाने से पहले डिह्यूमिडिफायर 1 एच शुरू करना सापेक्ष आर्द्रता को लगातार 45% तक नियंत्रित करेगा, 30 मिन के लिए समय सुखाने को ध्यान में रखते हुए। यदि परिवेश नमी को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, तो सुखाने के समय को बढ़ाना आर्द्र वातावरण की भरपाई करने के लिए एक संभावित सरल समाधान है। झुंड के दौरान, सापेक्ष आर्द्रता 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 70% पर रहना चाहिए ताकि आगर प्लेटों को सूखने से रोका जा सके। इनक्यूबेटर में पानी का एक अनकैप्ड बिन पानी जलाशय के रूप में काम कर सकता है। सूखी झुंड आगर प्लेटें झुंड आबादी की प्रगति को धीमा और tendrils की संख्या को कम करते हुए नम प्लेटों व्यापक tendril संरचना का कारण(चित्रा 5ए-सी)। अतिरिक्त नम झुंड आगर प्लेटें स्पष्ट टेंड्रल गठन को रोकने और tendrils एक असमान पैटर्न(अंजीर 5 डी)में फैलने के लिए कारण । यहां वर्णित विधि का उपयोग निरंतर आर्द्र वातावरण बनाए रखने के लिए किया जा सकता है जो प्लेटों पर झुंड की स्थिरता सुनिश्चित करेगा(चित्रा 5B, वीडियो 1)। इसके अतिरिक्त, प्लेट का आकार और आगर मोटाई थाली में नमी बनाए रखने में भूमिका निभाते हैं। हम 10 सेमी व्यास पेट्री व्यंजन का इस्तेमाल किया है और प्रति थाली झुंड आगर समाधान के 20 mL जोड़ा निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए । मात्रा को मापने के बिना प्लेटडालने की सिफारिश नहीं की जाती है। झुंड परख को प्रभावित करने वाले कई चरों के कारण, हम स्थानीय प्रयोगशाला स्थितियों पर परख को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं और हम लगातार और तुलनीय झुंड पैटर्न का पालन करने के लिए प्लेटों के अलग-अलग बैचों पर कई जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन करने के महत्व पर जोर देते हैं।

झुंड गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए समय-चूक इमेजिंग विधि का लाभ झुंड को परेशान करने की आवश्यकता के बिना गतिशीलता की प्रगति का निरीक्षण करने की क्षमता है। हमारी विधि आसानी से एक ही शर्तों के तहत 6 प्लेटों की समय-चूक पैदा करती है, जो कई उपभेदों, कई प्रयोगात्मक स्थितियों, या जैविक प्रतिकृतियों के एक साथ मूल्यांकन के लिए दोनों एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती है। प्रत्येक प्लेट पर छह उपग्रह पदों का उपयोग अतिरिक्त रूप से सांख्यिकीय विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है और इमेजजे का उपयोग झुंड प्रतिकर्षण के परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है।

यहां वर्णित प्रक्रिया पी aeruginosaकी उप आबादी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सरल तरीका है: एक स्वस्थ झुंड आबादी और जोर दिया कोशिकाओं । DMS3vir और gentamycin से परे, अतिरिक्त प्रकार के फेज, एंटीबायोटिक्स और प्रतिस्पर्धी बैक्टीरिया या कवक का उपयोग तनाव संकेत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि यह विधि पी aeruginosa झुंड गतिशीलता पर केंद्रित है, एस ऑरियस और ई. कोलाई के रूप में अंय जीवाणु प्रजातियों भी झुंड पैटर्न प्रदर्शित करते हैं, लेकिन वे10,,11झुंड के लिए अनुकूलित मीडिया की आवश्यकता है । मीडिया रचनाओं और प्लेट की स्थिति को अनुकूलित करके, इस विधि को बैक्टीरियल उपभेदों और तनाव प्रतिक्रियाओं के बीच झुंड, झुंड वाली बातचीत और तनाव प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जे-एलएलबी, एएस, और N.M.H.K. पांडुलिपि लिखी और संशोधित की। सभी लेखकों ने प्रयोगों को डिजाइन किया। जे-एलएलबी ने प्रयोगों और विश्लेषण का प्रदर्शन किया । इस काम को एनआईएच पुरस्कार K22AI112816 और R21AI139968 अनुदान एएस और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। N.M.H.K लुंडबेक फैलोशिप R220-2016-860 और R251-2017-1070 द्वारा समर्थित किया गया था । प्रकाशन के लिए काम जमा करने के फैसले में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी । हमारे पास घोषणा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010 For LB-agar plate and swarming agar plate
Casamino acids BD Difco 223050 For swarming media
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose. For swarming media
Fosfomycin disodium salt Tokyo Chemical Industry F0889 Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Gentamycin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O
LB-Miller BD Difco 244620 For LB broth and LB-agar plates
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391 For swarming media
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 For 5x M8 media
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 For 5x M8 media
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373 For 5x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab AFS27E.118 PA14 strain
DMS3vir O'Toole lab DMS3vir20 Bacteriophage
Supplies
Aluminium oxide sandpaper 3M 150 Fine For black lids
Black fabric Joann PRD7089 Black fabric
Black spray paint Krylon 5592 Matte Black For black lids
Erlenmeyer flask Kimax 26500 250 mL
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1,000 mL
8 inches zip ties Gardner Bender E173770 For attaching black matte fabric
Petri dishes (100 mm x 15 mm) Fisher FB0875712 100 mm x 15 mm polystyrene plates
Wooden sticks Fisher 23-400-102 For streaking and inoculating bacteria
Equipment
Autoclave Market Forge Industries STM-E For sterilizing reagents
25 mL pipette USA Scientific, Inc. 1072-5410 To pipet 20 mL for swarming agar plates
Dehumidifier Frigidaire FAD704DWD 70-pint For maintaing room relative humidity at about 45%
ImageJ NIH v1.52a Software for image analysis
Incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Isotemp waterbath Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C
Laminar flow hood The Baker Company SG603A For drying plates
P-20 pipet Gilson F123601 Spotting on swarming agar plates
Pipette Controller BrandTech accu-jet To pipet 20 mL for swarming agar plates
Roller Drum New Brunswick TC-7 For growth of bacteria at 100 rpm
Scanner Epson Epson Perfection V370 Photo Scanner for imaging plates
Scanner automation software RoboTask Lite v7.0.1.932 For 30 min internals imaging
Scanner image acquisition software Epson v9.9.2.5US Software for imaging plates

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References

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Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (159), e60915, doi:10.3791/60915 (2020).

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