Summary
Vi beskriver en enkel metode for å produsere høyoppløselige time-lapse filmer av Pseudomonas aeruginosa svermer som reagerer på bakteriofan (phage) og antibiotika stress ved hjelp av en plandokument skanner. Denne prosedyren er en rask og enkel metode for overvåking av svermende dynamikk og kan tilpasses for å studere motilitet og vekst av andre bakterielle arter.
Abstract
Swarming er en form for overflate motilitet observert i mange bakterielle arter, inkludert Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli. Her beveger tette bestander av bakterier seg over store avstander i karakteristiske tendrilformede samfunn i løpet av timer. Svermer er følsomt for flere faktorer, inkludert middels fuktighet, fuktighet og næringsinnhold. I tillegg avviser den kollektive stressresponsen, som observeres i P. aeruginosa som er stresset av antibiotika eller bakteriofan (phage), svermer fra å nærme seg området som inneholder stresset. Metodene som er beskrevet her, tar for seg hvordan man kontrollerer de kritiske faktorene som påvirker oppvarmingen. Vi introduserer en enkel metode for å overvåke svermende dynamikk og den kollektive stressresponsen med høy timelig oppløsning ved hjelp av en plandokumentskanner, og beskriver hvordan man kompilerer og utfører en kvantitativ analyse av svermer. Denne enkle og kostnadseffektive metoden gir presis og velkontrollert kvantifisering av svermer og kan utvides til andre typer platebaserte vekstanalyser og bakterielle arter.
Introduction
Swarming er en kollektiv form for koordinert bakteriell motilitet som øker antibiotikaresistens og produksjon av virulens faktorer i verten1,2,3. Denne flercellulære oppførselen oppstår på halvfaste overflater som ligner de av slimete lag som dekker epitelmembraner i lungene4,5. Biosurfactants er ofte produsert av svermende populasjoner for å overvinne overflatespenningen på overflater og produksjonen av disse er regulert av komplekse celle-celle signalsystemer, også kjent som quorum sensing6,7,8. Mange arter av bakterier er i stand til å sverme, inkludert Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, og Escherichia coli9,10,11,12. De svermende mønstreskapt av bakterier er forskjellige og påvirkes av de fysiske og kjemiske egenskapene til overflatelaget, inkludert næringssammensetning, porøsitet og fuktighet13,14. I tillegg til overflateegenskaper påvirker veksttemperatur og omgivelsesfuktighet flere aspekter ved svermende dynamikk, inkludert svermende hastighet og mønstre12,,13,,14,15. Vekstvariablene som påvirker svermen skaper utfordringer som påvirker eksperimentell reproduserbarhet og evnen til å tolke resultater. Her beskriver vi en enkel standardisert metode for å overvåke dynamikken i bakterielle svermer gjennom tidsforløpsavbildning. Metoden beskriver hvordan man kontrollerer kritiske vekstforhold som i betydelig grad påvirker progresjonen av svermende. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for svermanalyse, gjør denne tidsforløpsmetoden det mulig å spore motiliteten til flere svermer samtidig i lengre perioder og med høy oppløsning. Disse aspektene forbedrer dybden av data som kan oppnås ved å overvåke svermer og lette identifisering av faktorer som påvirker oppvarming.
Svermip aeruginosa er tilrettelagt gjennom produksjon og frigjøring av rhamnolipider og 3-(3-hydroksyalkanoyloksy) alkanosyrer inn i området6,16. Innføringen av stress fra sub-dødelige konsentrasjoner av antibiotika eller infeksjon ved phage virus påvirker organiseringen av svermer. Spesielt induserer disse påkjenningene P. aeruginosa for å frigjøre quorumet sensing molekyl 2-heptyl-3-hydroksy-4-quinolon, også kjent som Pseudomonas kinoolon signal (PQS)17,18. I svermanalyser som inneholder to populasjoner av svermer, avviser PQS produsert av den stressinduserte populasjonen ubehandlede svermer fra å komme inn i området som inneholder stresset (figur 1). Denne kollektive stressresponsen utgjør et farekommunikasjonssignalsystem som advarer P. aeruginosa om trusler i nærheten18,19. Effekten av stress på P. aeruginosa, aktiveringen av den kollektive stressresponsen, og frastøtelsen av svermer kan visualiseres ved hjelp av tidsforløpsbildemetoden som er beskrevet her. Protokollen som er beskrevet her forklarer hvordan: (1) forberede agar plater for sverming, (2) kultur P. aeruginosa for to typer analyser (tradisjonelle svermende analyser eller kollektiv stress respons analyser) (Figur 1), (3) skaffe time-lapse bilder, og (4) bruke ImageJ til å kompilere og analysere bildene.
Kort, P. aeruginosa fra en overnatting kultur er oppdaget midt i en svermende agar plate mens P. aeruginosa som er smittet med phage eller behandlet med antibiotika er oppdaget på satellittstillinger. Progresjonen av P. aeruginosa svermer overvåkes på en forbruker dokument planskanner som er plassert i en fuktighetsregulert 37 °C inkubator. Skanneren styres av en programvare som automatisk skanner platene med jevne mellomrom over den svermvekstperioden, vanligvis 16–20 timer. Denne metoden gir samtidige time-lapse videoer på opptil seks 10 cm svermende plater. Bildene er kompilert i filmer og frastøting av svermer av stress-indusert populasjoner er kvantifisert ved hjelp av fritt tilgjengelig ImageJ programvare. Det tas særlig hensyn for å sikre konsistens og reproduserbarhet mellom ulike svermende eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbereder Svermende Agar Plater for P. aeruginosa Svermende Time-lapse Imaging
- Forbered 1 l 5x M8 minimumsmedium i en glassflaske ved å tilsette 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4og 2,5 g NaCl i 500 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O). Juster det endelige volumet til 1 L med ekstra ddH2O. Autoklav for å sterilisere og lagre flytende medier ved romtemperatur.
- Forbered 100 ml 1 M MgSO4 (magnesiumsulfat) i en glassflaske ved å tilsett 24,6 g MgSO4•7H2O i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumet til 100 ml med ekstra ddH2O. Autoklav for sterilisering. Oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 100 ml 20% casamino syrer i en glassflaske ved å tilsett 20 g casamino syrer i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumet til 100 ml med ekstra ddH2O. Autoklav for å sterilisere. Oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 100 ml 20% glukose i en glassflaske ved å tilsette 20 g glukose i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumet til 100 ml med ekstra ddH2O. Steriliser ved filtrering med 0,22 μm filter. Oppbevares ved romtemperatur.
- For å lage 10 svermende agarplater, tilsett 1 g agar i 100 ml ddH2O og juster det endelige volumet til 160 ml med ekstra ddH2O i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Steriliser ved autoklaving.
- Umiddelbart etter autoklaving, plasser agaroppløsningen i et 55 °C vannbad i 15 min.
- Fjern agaroppløsningen fra vannbadet og tilsett minimum sl 5x M8 minimumsmedium, 200 μL av 1 M MgSO4,2 ml 20 % glukose og 5 ml 20 % casaminosyrer15. Fortsett til trinn 1.6 umiddelbart etter blanding.
MERK: De endelige konsentrasjonene er 0,5% agar, 1 mM MgSO4,0,2% glukose og 0,5% casamino syrer.
- Bruk en 25 ml pipette for konsistent volum, tilsett 20 ml av den svermende agaroppløsningen per 10 cm diameter Petriskål.
MERK: Et fast volum av agaroppløsning er viktig, da volumet påvirker tørketiden og fuktighetsinnholdet i agaren. Unngå bobler når du lager de svermende agarplatene. - La agaren stivne ved å plassere de svermende agarplatene i en enkelt stabel med lokk på i 1 t på benken ved romtemperatur. Slå på avfukteren for å redusere den relative fuktigheten i rommet til 40–50 % 1 time før neste trinn.
- Tørk de svermende agarplatene i ytterligere 30 minutter med lokkene av i en lamiarstrømningshette på 300 fot3/min med 40–50 % relativ fuktighet ved romtemperatur. Tørk det indre av lokkene ved å plassere dem med forsiden opp i lamiklassstrømningshetten. Oppbevar ei agarplater ved 4 °C i opptil 24 timer.
- Forbered svart 10 cm Petriparabollokk for bildebehandling ved å glatte ut innsiden av lokket med sandpapir. Legg lokkene inn i en emballasjeboks og plasser emballasjeboksen under en kjemisk hette. Spray inne i lokkene ved hjelp av svart spraymaling. La lokkene tørke.
MERK: Svarte lokk kan brukes på nytt for flere eksperimenter. Det er viktig at lokkene males slik at de ikke reflekterer lys under skanning.
2. Vekst av P. aeruginosa og plating forhold
- Forbered 400 ml lysogeny buljong (LB) ved å tilsette 10 g LB-Miller pulverblanding i 400 ml ddH2O. For 2% LB-agar Petri retter, legg til en ekstra 8 g agar. Autoklav for å sterilisere.
- Hell 20 ml smeltet LB-agar medium i 10 cm diameter Petri retter og la dem stivne ved romtemperatur over natten. Oppbevar flytende medier ved romtemperatur og agarplater ved 4 °C.
- Streak P. aeruginosa på en LB-agar Petri skål fra en frossen lager lagret på -80 °C ved hjelp av sterile løkker eller trepinner. Inkuber petriskålen opp ned over natten ved 37 °C. Oppbevar LB-agarplaten ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Velg en enkelt koloni fra Petri-skålen med en steril sløyfe eller trepinne, inokuler den i 2 ml LB medium, og inkuber kulturen til metning over natten (16–18 h) ved 37 °C i en rulletrommel satt til 100 o/min.
- Rør 5 μL av overnattingskultur fra trinn 2.4 ved hjelp av en P20-rør og plasser i midten av den svermende agarplaten ved å nærme seg rørspissen i en vinkel (10–45°) 2,5 cm over spottingområdet, pipetterned til første stopp og berøre agaren med bare væskefallet(figur 1B).
- Unngå å berøre agaren med rørspissen, da den skader agaren. Bruk en mal for å plassere stedet konsekvent på tvers av forskjellige svermende agarplater (Supplerende figur S1).
- For tradisjonelle svermende analyser, bruk bare midtpunktet og hopp til trinn 2.8. For kollektive stressresponsanalyser fortsetter til trinn 2.6 (for phage infeksjon) eller trinn 2.7 (for antibiotikastress).
- For phage infeksjon, bland 30 μL av overnatting kultur av P. aeruginosa fra trinn 2.4 med 6 μL av 1 x 1012 PFU / ml phage DMS3vir20. Fortsett umiddelbart til neste trinn.
- Rør 6 μL av P. aeruginosa-phage blanding fra trinn 2.6 ved hjelp av en P20 pipet og spot ved 6 likefjerne satellittposisjoner på en 2,8 cm radius konsentrisk sirkel som er sentrert på Petri parabolen ved nærmer seg rørspissen i en vinkel (10 til 45°) 2,5 cm over spotting området, piptting ned til første stopp, og berøre agar med bare væskefall(Figur 1C).
- Unngå å berøre agaren med rørspissen, da den skader agaren. Bruk en platingmal for konsistens (Supplerende figur S1). Fortsett til trinn 2.8.
- For antibiotikabehandlinger, bland 30 μL over natten kultur P. aeruginosa fra trinn 2,4 med 6 μL 3 mg/ml gentamycin, 10 μL av 100 mg/ml kanamycin, eller 7,5 μL av 100 mg/ml fosfomycin. Fortsett umiddelbart til neste trinn.
- Rør 6 μL antibiotikabehandlet P. aeruginosa fra trinn 2.7 ved hjelp av en P20 pipette og punkt ved 6 likefjerne satellittposisjoner på en 2,8 cm radius konsentrisk sirkel om midten av parabolen ved å nærme seg rørspissen i en vinkel (10 til 45°) 2,5 cm over spottingområdet, rørned til første stopp, og berøre agaren med bare væskefall(figur 1D).
- Unngå å berøre agaren med rørspissen, da den skader agaren. Bruk en platingmal for konsistens (Supplerende figur S1). Fortsett til trinn 2.8.
- Sett inn de klare petriskållokkene med svarte lokk i trinn 1.9 (Figur 2A).
- Plasser de svermende agarplatene på en skanner i en inkubator satt til 37 °C med et 10 L vannbad for å opprettholde fuktigheten ved 75 % (Figur 1E, figur 2B).
FORSIKTIG: Ikke forstyrr flekkede celler på de svermende agarplatene. Hold platene vendt opp til enhver tid.
3. Bildeanskaffelse med skanner
- Reduser omgivelsesbelysningen på Petri-rettene ved å feste svart matt stoff til et stativ 40–60 cm over flatbed-dokumentskanneren. Fest den ved hjelp av glidelåsbånd (figur 2B).
- Skanneren styres ved hjelp av en skanneprogramvare og en automatisk skriptprogramvare.
- I skanneprogramvaren velger du Hjemmodus (Figur 3A). Ta bilder i farger ved å velge Farge under Bildetype. Hvis du vil angi bildekvaliteten, velger du Annet under Mål og justerer oppløsningen til 300 ppt. Behold standardstørrelsen for bildene ved å velge Original for Målstørrelse. La alle alternativer under Bildejusteringer være ukontrollert for standard bildekvalitet.
MERK: Målstørrelsen er satt til Original som standard. Hvis du vil velge andre alternativer for Målstørrelse, klikker du på Forhåndsvis først.
- I skanneprogramvaren velger du Hjemmodus (Figur 3A). Ta bilder i farger ved å velge Farge under Bildetype. Hvis du vil angi bildekvaliteten, velger du Annet under Mål og justerer oppløsningen til 300 ppt. Behold standardstørrelsen for bildene ved å velge Original for Målstørrelse. La alle alternativer under Bildejusteringer være ukontrollert for standard bildekvalitet.
- Angi lagringsbanen til bilder ved å klikke på mappeikonet til høyre for Skann for å åpne Innstillinger for fillagring (Figur 3A).
- Velg mappemålet for lagring av bilder ved å velge Annet under Plassering og klikk på Bla gjennom. Velg en mappe for å lagre bildene.
- Gi bildene et navn i tekstboksen Prefiks. Angi Start nummer 001 for å begynne å navngi sekvensfor bildene. Sett filformatet til JPEG ved å velge JPEG (*.jpg) for Type under Bildeformat og klikk på Alternativer for å justere for detaljer. Angi kvaliteten på bildeformatet ved å justere komprimeringsnivået til 16, Koding til Standard og sjekk Bygg inn ICC-profil. Klikk OK for å lukke vinduet (Figur 3B).
- La det første alternativet være ukontrollert ("Overskriv alle filer med samme navn") og merk av for 3 neste alternativer ("Vis denne dialogboksen før neste skanning", "Åpne bildemappe etter skanning" og "Vis dialogboksen Legg til side etter skanning"). Klikk OK for å lukke vinduet
- Kontroller bildekvaliteten ved å klikke på Forhåndsvisning. Forhåndsvisningsvinduet vises, og Skanne-ikonet blir funksjonelt (figur 3C).
- Bruk skriptprogramvaren til å automatisere bildeanskaffelsen. Det angitte skriptet klikker på Scan i skannevinduet og OK i vinduet Innstillinger for fillagring med 30 min intervaller.
- Importere skriptet ved å klikke på Oppgave | Importer og velg både Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk (TSK-filer gitt som tilleggsfiler 1 og 2). Se figur 3D.
MERK: Single_scan.tsk klikker på Scan-knappen i skannevinduet og OK i vinduet Fillagringsinnstillinger. Idle_scanning.tsk aktiverer Single_scan.tsk hver 30. Man kan endre skannefrekvensen ved å endre aktiveringen av Idle_scanning.tsk. - Aktiver automatisk skanning med 30 min intervaller ved å velge både Inaktiv skanning (importert) og Enkeltskanning (importert),høyreklikk på Inaktiv skanning (importert)og venstre klikke på Aktivert (Figur 3D, Supplerende figur S2).
MERK: Automatisk skanning går til brukeren stopper skriptet manuelt. Hvis du vil stoppe skriptet, velger du Inaktiv skanning (importert), høyreklikker Inaktiv skanning (importert)og venstreklikker på Aktivert. Haken fjernes.
- Importere skriptet ved å klikke på Oppgave | Importer og velg både Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk (TSK-filer gitt som tilleggsfiler 1 og 2). Se figur 3D.
4. Kompilering av tidsforløpsbilder og måling av svermfrastøting
- Utfør filmredigering og bildeanalyse ved hjelp av ImageJ.
- Importer alle de skannede bildene til ImageJ ved å klikke på Fil | Importere | Bildesekvens og velg bildene. I vinduet Sekvensalternativer merker du av for Konverter til RGB for å holde bilder i farger. Antall bilder angir antall bilder som er valgt.
- Behold startbildet på 1 for å starte fra det første bildet i mappen og Skalere bilder på 100% for å spare original størrelse på bildene. La bruk virtuell stakk ukontrollert. Klikk OK og vent på at bildene lastes inn (figur 4A).
- Angi videokomprimeringsnivået til 100 ved å klikke på Rediger | Alternativer | Inngang/utgang... og juster JPEG-kvaliteten til 100.
- Lagre filen som en AVI ved å klikke på Fil | Lagre som | AVI. Juster komprimering til JPEG og bildefrekvens til 5 fps (figur 4B). Lagre AVI-tidsforløpet i ønsket mappe.
- For å kvantifisere svermfrastøtingavstander, åpne et bilde nær slutten av svermperioden i ImageJ. Klikk på Fil | Åpne og velg bildet. Juster skalaen ved å klikke på Analyser | Angi Skala og angi Avstand i piksler til 118, Kjent avstand til 1, Pikselstørrelsesforhold til 1,0 og Lengdeenhet til cm (Figur 4C). La Global være ukontrollert. Klikk OK for å lukke vinduet.
- Klikk på Straight-ikonet og mål fra midten av kolonien på satellittposisjonen til kanten av den svermende befolkningen. Velg Analyser | Mål for å få et nytt vindu til å vises med målene (Lengde) (Figur 4D).
MERK: Bruk "+" for å zoome inn nærmere og "-" for å zoome ut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinnene for å vokse P. aeruginosa, stresscellene, og bilde de svermende agar platene er representert i figur 1. Vi inokulerte en enkelt koloni av villtype P. aeruginosa UCBPP-PA14 stamme fra en LB-agar plate i 2 ml LB kjøttkraft over natten på 37 ° C og oppdaget 5 μL i midten av svermende agar plate. Time-lapse imaging av denne platen avslører innledende vekst i form av en koloni i sentrum og deretter spredning av tendrils radially fra kolonien (Video 1). For kollektive stressresponsanalyser, i tillegg til å oppdage P. aeruginosa i midten, blandes 30 μL av samme overnattingskultur med 6 μL på 1 x 1012 PFU/ml DMS3vir eller 6 μL på 3 mg/ml gentamycin i forholdet 5:1 og 6 μL oppdages ved satellittposisjonene. Svermer beveger seg fra midten av de svermende agarplatene til periferien og blir frastøtt av et stresssignal som slippes ut av bakteriene som ble smittet med phages (Video 2,øverst til venstre plate) eller behandlet med gentamycin (Video 2, øverst til høyre plate). Phages (Video 2, nederst til venstre plate) eller gentamycin (Video 2, nederst til høyre plate) oppdaget alene på satellittposisjoner ikke forårsaker svermende populasjoner for å unngå disse områdene.
Figur 1: Skjematisk av P. aeruginosa svermende analyse og kollektiv stressrespons. (A) P. aeruginosa celler dyrkes over natten (16-18 h til OD600 på ca 1,5) i LB kjøttkraft ved 37 °C og (B) oppdaget i midten av svermende agar plate. Over natten er kulturer blandet med (C) phages eller (D) antibiotika og oppdaget på satellittstillinger for kollektiv stress respons analyser. (E) Opptil 6 plater er avbildet på en skanner ved 30 min intervaller for 16–18 timer ved 37 °C. Etter 18 timer unngår P. aeruginosa svermende populasjoner (F) celler infisert med phage eller (G) celler behandlet med antibiotika (gentamycin). (H) P. aeruginosa populasjoner svermer over den svermende agar platen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skanneroppsett inne i inkubatoren. (A) Svart Petri parabollokk konstruert i avsnitt 1. Disse lokkene brukes under skanning for å redusere lysrefleksjoner og erstatte klare Petri parabollokk. (B) Flatbed dokumentskanneren er plassert i en inkubator satt til 37 °C. Seks plater med svarte lokk er plassert på skanneren (venstre bilde). Svart matt stoff er festet til stativet 60 cm over skanneren for å ytterligere redusere refleksjoner og bortkommen lys (høyre bilde). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Automatisert bildeanskaffelse fra flatbed-dokumentskanneren ved hjelp av skanne- og automatisk skriptprogramvare. (A) Skjermbilde av hovedskannevinduet. Valg av bildetype (farge) og oppløsning (300 ppt). Den røde firkanten angir mappeikonet for å åpne vinduet Innstillinger for fillagring. Legg merke til forhåndsvisningsknappen kan trykkes, men Skann-knappen er deaktivert. (B) Skjermbilde av vinduet Innstillinger for fillagring for å angi mappemål for lagring av bilder, navngi bildene og velge formatet på bildene (venstre). Vinduet Plug-In Settings brukes til å angi bildeformatkvaliteten (høyre). (C) Skjermbilde av Skanne-vinduet etter å ha klikket på Forhåndsvisning. Skanneknappen kan klikkes etter at en forhåndsvisning er anskaffet. Programmet kan nå automatiseres ved hjelp av skriptprogramvaren (Material). (D) Skjermbilde av skriptprogramvarevinduene som indikerer Import-knappen som brukes til å importere automatiseringsskriptene (venstre). Når Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk importeres, vises disse som oppgaver i hovedvinduet (høyre). Når du har valgt begge oppgavene og høyreklikket på dem, vises Aktivert-knappen. Venstre klikker Aktiver starter skriptene for å automatisk skanne med 30 min intervaller (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bildeanalyse av svermende unngåelse ved hjelp av ImageJ. (A) Trinn for å importere en bildesekvens fra tidsforløpskannerbildene. Klikke på fil | Importere | Image Sequence i hovedimageJ-vinduet (til venstre) bringer opp sekvensalternativer -vinduet (høyre) og åpner alle de skannede bildene. Den røde firkanten angir det merkede alternativet for å laste inn bilder i RGB-format. Alle andre alternativer er igjen som standard. (B) Trinn for å lagre time-lapse-videoen i AVI-format. Velge fil | Lagre som | AVI tar opp Save as AVI-vinduet. Komprimering er satt til JPEG og Bildefrekvens til 5 fps. (C) Stille inn skaleringsenhetene for bilder. Velge analyser | Angi skalering for å få opp vinduet Angi skalering. For 300 dpi-bilder er riktig skala 118 piksler/cm.(D) Måling av unngåelse fra svermende populasjoner. En gul linje trekkes fra midten av de stressede koloniene til kanten av tendrils. Velge analyser | Mål rapporterer lengden på linjen i et nytt vindu merket Resultater. Ctrl + M er en hurtigtast som utfører målingen uten å velge menyelementene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative svermer av P. aeruginosa. P. aeruginosa svermende populasjoner på svermende agarplater som er (A) tørr, (B) normal, (C) fuktig, og (D) ekstra fuktig. Tørre svermende agarplater hemmer svermhastigheten til P. aeruginosa og reduserer antall tendrils. Fuktige svermende agarplater forårsaker dannelse av store tendrils. Under ekstra fuktige forhold danner tendrils ujevnt gjennom de svermende agarplatene. Tørketider i lamimen strømningshette og fuktighet har betydelige effekter på svermende platefuktighetsinnhold. Rettene er 10 cm Petri-retter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Time-lapse film av svermende. Wild-type P. aeruginosa ble oppdaget i midten av svermplaten og ble avbildet på skanneren i løpet av 22 h. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Time-lapse film av den kollektive stress respons. Wild-type P. aeruginosa ble oppdaget i midten av svermplaten. Satellittstillinger ble oppdaget med P. aeruginosa som blandes i tillegg med (øvre venstre) phage eller (øverst til høyre) gentamycin, eller oppdaget utelukkende med (nedre venstre) phage eller (nederst til høyre) gentamycin. Hvite prikker indikerer midten av flekkene. Plater ble avbildet i løpet av 16 h. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende figur S1: Plating mal for spotting P. aeruginosa celler. Den midterste svarte prikken representerer spottingområdet på 5 μL over natten P. aeruginosa kultur. Radiusen til den indre sirkelen er 2,8 cm fra midten av platen. Skjæringspunktet mellom den indre sirkelen og de rette linjene over den ytre sirkelen indikerer spotting området på 6 μL av stresset P. aeruginosa, phage infisert eller antibiotika behandlede celler. Den ytre sirkelen representerer omkretsen av 10 cm Petriskål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggfigur S2: Makrokommandoer for å regelmessig begynne å skanne ved hjelp av en skriptprogramvare. (A) Makrokommandoene i Single_scan.tsk flytter markøren til Skann i skannevinduet, klikker på Skann, flytter til OK i vinduet Innstillinger for fillagring og klikker på OK. (B) Kommandoer for å skanne i 30 min intervaller. Oppgaven Idle_scanning.tsk starter Single_scan.tsk og er satt til å aktivere i 30 min intervaller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen fokuserer på å minimere variasjonen i svermende agarplater og gi en enkel og rimelig metode for å skaffe time-lapse bilder av P. aeruginosa svermer og reagerer på stress. Denne prosedyren kan utvides til bilde andre bakterielle systemer ved å tilpasse mediesammensetningen og vekstforholdene. For P. aeruginosa, selv om M9 eller FAB minimalt medium kan brukes til å indusere svermende16,21, protokollen som presenteres her bruker M8 medium med casamino syrer, glukose og magnesiumsulfat6. P. aeruginosa svermer er følsom for middels sammensetning som jern tilgjengelighet og næringskilder inkludert aminosyrer22,,23,24. Derfor illustrerer valg av medier for svermende agarplater et viktig aspekt ved å si svermende motilitet.
Kontroll for fuktighet og temperatur i et åpent laboratorieområde representerer en av de største utfordringene for konsistens av svermanalyser. Sesongmessige endringer bidrar til variasjon i de svermende agarplatene fuktighet, noe som kan påvirke svermende mønstre betydelig. Derfor er konstant kontroll av den relative fuktigheten nødvendig for å sikre optimal platekvalitet. Starte avfukteren 1 time før tørking av de svermende agarplatene under lamitarstrømningshetten vil kontrollere den relative fuktigheten til en konstant 45%, og holde tørketiden til 30 min. Hvis omgivelsesfuktighet ikke kan kontrolleres, er det en potensiell enkel løsning for å kompensere for fuktige miljøer hvis omgivelsesfuktighet ikke kan kontrolleres. Under swarming bør relativ fuktighet holde seg på 70% i 37 °C inkubatoren for å hindre at agarplatene tørker ut. En ubesudlede beholder med vann i inkubatoren kan tjene som et vannreservoar. Tørre svermende agarplater senker utviklingen av svermende populasjoner og reduserer antall tendrils mens fuktige plater forårsaker bred tendrilstruktur (figur 5A–C). Ekstra fuktige swarming agar plater hindre klar tendril dannelse og føre til tendrils å spre seg i et ujevnt mønster (Fig 5D). Metoden som er beskrevet her kan brukes til å opprettholde et konstant fuktig miljø som vil sikre konsistens av sverming på plater (Figur 5B, Video 1). I tillegg spiller platestørrelse og agartykkelse en rolle i å beholde fuktighet i platen. Vi har brukt 10 cm diameter Petri retter og lagt 20 ml svermende agar løsning per plate for å sikre konsistens. Helle plater uten å måle volumer anbefales ikke. På grunn av de mange variablene som påvirker den svermende analysen, anbefaler vi å optimalisere analysen til lokale laboratorieforhold, og vi understreker viktigheten av å utføre flere biologiske replikater på separate grupper av plater for å observere konsistente og sammenlignbare svermende mønstre.
Fordelen med time-lapse imaging metoden for å registrere svermende motilitet er evnen til å observere utviklingen av motilitet uten å måtte forstyrre svermene. Vår metode skaper enkelt tidsforløp på 6 plater samtidig under de samme forholdene, noe som gir både et kontrollert miljø for samtidig vurdering av flere stammer, flere eksperimentelle forhold eller biologiske replikater. Bruk av seks satellittposisjoner på hver plate letter i tillegg statistisk analyse og bruk av ImageJ muliggjør kvantifisering av svermende frastøting.
Prosedyren som er beskrevet her er en enkel metode for å studere samspillet mellom underpopulasjoner av P. aeruginosa: en sunn svermende befolkning og stressede celler. Utover DMS3vir og gentamycin kan flere typer phages, antibiotika og konkurrerende bakterier eller sopp brukes til å studere stresssignalering. Selv om denne metoden fokuserer på P. aeruginosa svermende motilitet, viser andre bakterielle arter som S. aureus og E. coli også svermende mønstre, men de krever tilpassede medier for å sverme10,11. Ved å optimalisere mediesammensetninger og plateforhold, kan denne metoden brukes til å analysere svermende, svermende interaksjoner mellom bakterielle stammer og stressresponser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., og N.M.H-K. skrev og reviderte manuskriptet. Alle forfattere designet eksperimentene. J.-L.B. utførte eksperimenter og analyser. Dette arbeidet ble støttet av NIH-prisen K22AI112816 og R21AI139968 stipend til A.S. og ved University of California. N.M.H-K. ble støttet av Lundbeck Fellowships R220-2016-860 og R251-2017-1070. Funders hadde ingen rolle i beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering. Vi har ingen konkurrerende interesser å erklære.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
