Summary
Мы подробно простой метод для производства высокого разрешения замедленного фильмов Pseudomonas aeruginosa стаи, которые реагируют на бактериофаг (фаг) и антибиотик стресс с помощью планшетного сканера документов. Эта процедура является быстрым и простым методом мониторинга динамики рояии и может быть адаптирована для изучения подвижности и роста других видов бактерий.
Abstract
Рой является одной из форм подвижности поверхности наблюдается во многих бактериальных видов, включая Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Здесь плотные популяции бактерий перемещаются на большие расстояния в характерных тендриловидных сообществах в течение нескольких часов. Рой чувствителен к нескольким факторам, включая среднюю влажность, влажность и содержание питательных веществ. Кроме того, коллективная реакция на стресс, которая наблюдается в P. aeruginosa, которые подчеркиваются антибиотиками или бактериофаг (фаг), отталкивает рои от приближения области, содержащей стресс. Описанные здесь методы касаются того, как контролировать критические факторы, влияющие на рой. Мы внедряем простой метод мониторинга динамики рояии и коллективного реагирования на стресс с высоким временным разрешением с помощью планшетного сканера документов, а также описываем, как компилировать и выполнять количественный анализ роев. Этот простой и экономичный метод обеспечивает точную и хорошо контролируемую количественную оценку рояии и может быть распространен на другие типы анализов роста на основе плит и бактериальных видов.
Introduction
Рой является коллективной формой скоординированной бактериальной подвижности, что повышает устойчивость к антибиотикам и производство факторов вирулентности в принимающей1,2,3. Это многоклеточное поведение происходит на полутвердых поверхностях, которые напоминают слизистые слои, покрывающие эпителиальные мембраны в легких4,,5. Biosurfactants обычно производятся роятся населения для преодоления поверхностного натяжения на поверхности и производство из них регулируется комплексных клеток ячейки сигнализации систем, также известный как кворум зондирования6,7,8. Многие виды бактерий способны роятся, в том числе Pseudomonas aeruginosa,Золотистый стафилококк,и Escherichia coli9,10,11,12. Узоры роятся, созданные бактериями, разнообразны и подвержены воздействию физических и химических свойств поверхностного слоя, включая состав питательных веществ, пористость и влажность13,14. В дополнение к поверхностным свойствам, температура роста и влажность окружающей среды влияют на некоторые аспекты динамики роя, в том числе скорость роения и модели12,,13,,14,15. Переменные роста, влияющие на рой, создают проблемы, влияющие на экспериментальное воспроизводимость и способность интерпретировать результаты. Здесь мы описываем простой стандартизированный метод мониторинга динамики бактериальных стай с помощью замедленной визуализации. Метод описывает, как контролировать критические условия роста, которые существенно влияют на прогрессирование роя. По сравнению с традиционными методами анализа роя, этот метод визуализации замедленного действия позволяет отслеживать подвижность нескольких роев одновременно в течение длительных периодов времени и с высоким разрешением. Эти аспекты улучшают глубину данных, которые могут быть получены в ходе мониторинга стай, и облегчают выявление факторов, влияющих на рой.
Рой в P. aeruginosa облегчается через производство и высвобождение rhamnolipids и 3-(3-гидроксиалканоилокси)алканоиновые кислоты в окружающую среду6,16. Введение стресса от сублетальных концентраций антибиотиков или инфекции фаговым вирусом влияет на организацию стай. В частности, эти стрессы побуждают P. aeruginosa выпустить молекулу кворума зондирования 2-гептил-3-гидрокси-4-хинолона, также известный как Псевдомонас хинолон сигнал (ПЗС)17,18. В рое анализы, которые содержат две популяции стаи, ПЗС производства стресс-индуцированной населения отталкивает необработанных стай от входа в область, содержащую стресс (Рисунок 1). Этот коллективный стресс ответ представляет собой опасность связи сигнализации системы, которая предупреждает P. aeruginosa о близлежащих угроз18,19. Влияние стресса на P. aeruginosa, активации коллективной реакции на стресс, и отвращение стаи могут быть визуализированы с помощью замедленного метода изображения описано здесь. Описанный здесь протокол объясняет, как: (1) подготовить агар пластины для роятся, (2) культуры P. aeruginosa для двух типов анализов (традиционные анализы рояилища или коллективные анализы реакции на стресс) ( Рисунок 1 ),(рисунок 1),(3) приобрести замедленного изображения, и (4) использовать ImageJ для компиляции и анализа изображений.
Кратко, P. aeruginosa от ночной культуры пятнистый в середине роятся агар пластины в то время как P. aeruginosa, которые инфицированы фагом или лечение антибиотиками заметили на спутниковых позиций. Прогрессирование P. aeruginosa роятся на потребительском документе планшетный сканер, который помещается в влажности регулируется 37 C инкубатор. Сканер управляется программным обеспечением, которое автоматически сканирует пластины через регулярные промежутки времени в течение периода роста роя, как правило, 16-20 ч. Этот метод дает одновременные видеозаписи до шести 10 см роящихся пластин. Изображения компилируются в кино, и отталкивание стай вызванными стрессом популяций количественно с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Особое внимание уделяется обеспечению согласованности и воспроизводимости между различными экспериментами роятся.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Роекинг Агар плиты для P. aeruginosa Рой Time-lapse Изображений
- Приготовьте 1 l 5x M8 минимальных носителей в стеклянной бутылке, добавив 64 г Na2HPO4No7H2O, 15 г KH2PO4и 2,5 г NaCl в 500 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O). Отрегулируйте окончательный объем до 1 л с дополнительным ddH2O. Autoclave для стерилизации и хранения жидких носителей при комнатной температуре.
- Приготовьте 100 мл 1 М MgSO4 (сульфат магния) в стеклянной бутылке, добавив 24,6 г MgSO47H2O в 50 мл ddH2O. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с дополнительным ddH2O. Autoclave для стерилизации. Хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 100 мл 20% касаминокислот в стеклянной бутылке, добавив 20 г касаминокислот в 50 мл ddH2O. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с дополнительным ddH2O. Autoclave для стерилизации. Хранить при комнатной температуре.
- Приготовьте 100 мл 20% глюкозы в стеклянной бутылке, добавив 20 г глюкозы в 50 мл ddH2O. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с дополнительным ddH2O. Стерилизовать фильтрацией с фильтром 0,22 мкм. Хранить при комнатной температуре.
- Чтобы сделать 10 кишащих агарпластинами, добавьте 1 г агара в 100 мл ddH2O и отрегулируйте конечный объем до 160 мл с дополнительным ddH2O в колбе Erlenmeyer 250 мл. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
- Сразу после автоклавирования поместите агар-раствор на водную ванну в течение 15 минут.
- Удалите раствор агара из водяной ванны и добавьте 40 мл 5x M8 минимальных носителей, 200 л 1 M MgSO4, 2 мл 20% глюкозы, и 5 мл 20% casamino кислот15. Приступайте к шагу 1.6 сразу после смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации 0,5% агар, 1 мМ MgSO4, 0,2% глюкозы, и 0,5% casamino кислот.
- Используя пипетку диаметром 25 мл для согласованного объема, добавьте 20 мл роящегося агарного раствора диаметром 10 см. Чашка Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важны фиксированный объем раствора агара, так как объем влияет на время сушки и содержание влаги в агаре. Избегайте пузырьков при принятии роятся агар пластины. - Разрешить агар затвердеть, поместив роятся агар пластины в одном стеке с крышками на 1 ч на скамейке при комнатной температуре. Включите обезвоживание, чтобы снизить относительную влажность помещения до 40-50% 1 ч до следующего шага.
- Сухие кишащие агарные тарелки в течение дополнительных 30 минут с крышками в ламинарном капоте потока на 300 футов3/мин с 40-50% относительной влажности при комнатной температуре. Сухие интерьер крышки, поместив их лицом вверх в ламинарный капот потока. Храните роятся агар пластины на 4 КК на срок до 24 ч.
- Приготовьте черные 10 см петри блюдо крышки для изображения путем разглаживания внутри крышки с наждачной бумагой. Поместите крышки в упаковочную коробку и поместите упаковочную коробку под химический капот. Спрей внутри крышки с помощью черной краски спрей. Дайте крышкам высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Черные крышки могут быть повторно использованы для дополнительных экспериментов. Важно, чтобы крышки окрашены таким образом, чтобы они не отражали свет во время сканирования.
2. Рост P. aeruginosa и условия покрытия
- Приготовьте 400 мл лисогенного бульона (LB), добавив 10 г порошковой смеси LB-Miller в 400 мл ddH2O. Для 2% блюд LB-agar Petri добавьте еще 8 г агара. Автоклав для стерилизации.
- Налейте 20 мл расплавленного LB-агар агар агар агар агара среды в 10 см диаметром Петри блюда и позволяют им затвердеть при комнатной температуре на ночь. Храните жидкие носители при комнатной температуре и агарные пластины при температуре 4 градусов по Цельсию.
- Streak P. aeruginosa на блюдо LB-agar Petri из замороженного бульона хранится при -80 градусов по Цельсию с использованием стерильных петель или деревянных палочек. Инкубировать чашку Петри вверх дном на ночь при 37 градусах Цельсия. Храните пластину LB-agar при 4 градусах по Цельсию в течение 1 недели.
- Выберите одну колонию из чашки Петри с стерильной петлей или деревянной палкой, привить его в 2 мл LB среды, и инкубировать культуру насыщения ночь (16-18 ч) при 37 градусов по Цельсию в роликовой барабанной установке на 100 об/ ч.
- Pipet 5 qL ночной культуры от шага 2.4 используя pipet P20 и пятно на центре роятся плита агара путем причаливать кончику pipet под углом (10-45' 2.5 см над пятнистой зоной, pipetting вниз к первой остановке, и касатьться агара с только жидким падением(рисунок 1B).
- Избегайте прикосновения к агару с наконечником трубы, как он повреждает агар. Используйте шаблон для того, чтобы положение пятно последовательно через различные роятся агар пластины(Дополнительный рисунок S1).
- Для традиционных анализов роятся, используйте только центральное место и перейти к шагу 2.8. Для коллективных анализов реакции на стресс продолжают сярвые действия 2.6 (для фаговой инфекции) или шаг 2.7 (для антибиотиков стресса).
- Для фаговой инфекции, смешайте 30 qL ночной культуры P. aeruginosa от шага 2.4 с 6 qL 1 x 10 pfu/mL фаг DMS3vir20.12 Немедленно приступайке к следующему шагу.
- Пипет 6 Зл П. aeruginosa-фаговаясмесь со ступени 2.6 с помощью p20 пайпетик и пятно на 6 равномерных спутниковых позиций на 2,8 см радиуса концентрического круга, который сосредоточен на чашке Петри, приближаясь к трубачам кончик под углом (10 до 45 ") 2,5 см выше области пятнистости, pipetting до первой остановки, и касаясь agarРисунокс жидким).
- Избегайте прикосновения к агару с наконечником трубы, как он повреждает агар. Используйте шаблон покрытия для согласованности(Дополнительная рисунок S1). Приступай к шагу 2.8.
- Для лечения антибиотиками смешайте 30 qL ночной культуры P. aeruginosa с шагом 2.4 с 6 мг/мл гентамицина, 10 л 100 мг/мл канамицина, или 7,5 л 100 мг/мл фосфомицина. Немедленно приступайке к следующему шагу.
- Pipet 6 зЛ антибиотика обработанных P. aeruginosa от шага 2.7 используя пипетку P20 и пятно на 6 равномерных положениях спутника на 2.8 cm радиусе концентрический круг о центре тарелки путем причаливать кончику трубы под углом (10 до 45' 2.5 см над пятнистой областью, pipetting вниз к первой остановке, и касающ жидкость толькоFigure 1.
- Избегайте прикосновения к агару с наконечником трубы, как он повреждает агар. Используйте шаблон покрытия для согласованности(Дополнительная рисунок S1). Приступай к шагу 2.8.
- Замените прозрачные крышки чашки Петри черными крышками, сделанными в шаге 1.9(Рисунок 2A).
- Поместите роятся агар пластины на сканер в инкубатор, установленный на 37 градусов по Цельсию с 10 L водяной ванны для поддержания влажности на 75% (Рисунок 1E, Рисунок 2B).
ВНИМАНИЕ: Не беспокоить пятнистые клетки на роятся агар пластины. Держите пластины вверх во все времена.
3. Приобретение изображения со сканером
- Уменьшите окружающее освещение посуды Петри, прикрепив черную матовую ткань к стойке на 40-60 см над планшетным сканером документов. Закрепите его с помощью почтовых связей(рисунок 2B).
- Сканер будет управляться с помощью сканирующего программного обеспечения и программного обеспечения для автоматического скрипта.
- В программном обеспечении для сканирования выберите домашний режим (рисунок 3A). Захват изображений в цвете, выбрав цвет под типом изображения. Чтобы установить качество изображения, выберите Другие в соответствии с назначением и настроить разрешение до 300 dpi. Сохраняйте стандартный размер для изображений, выбрав Original для целевого размера. Оставьте все параметры под image Adjustments непроверенными для стандартного качества изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой размер установлен на исходный по умолчанию. Чтобы выбрать другие варианты для целевого размера, нажмите на Предварительный просмотр в первую очередь.
- В программном обеспечении для сканирования выберите домашний режим (рисунок 3A). Захват изображений в цвете, выбрав цвет под типом изображения. Чтобы установить качество изображения, выберите Другие в соответствии с назначением и настроить разрешение до 300 dpi. Сохраняйте стандартный размер для изображений, выбрав Original для целевого размера. Оставьте все параметры под image Adjustments непроверенными для стандартного качества изображения.
- Установите спасительный путь изображений, нажав на значок папки справа от сканирования, чтобы открыть настройки сохранения файлов(рисунок 3A).
- Выберите пункт назначения папки для сохранения изображений, выбрав другие под местоположением и нажмите на Просмотр. Выберите папку для сохранения изображений.
- Назовите изображения в текстовом поле Префикс. Установите стартовый номер 001, чтобы начать последовательности имен для изображений. Установите формат файла в JPEG, выбрав JPEG (.jpg) для типа под форматом изображения и нажмите на Параметры, чтобы настроить для деталей. Установите качество формата изображения, регулируя уровень сжатия до 16, кодирование в стандарте и проверьте профиль ICC. Нажмите OK, чтобы закрыть окно(рисунок 3B).
- Оставьте первый вариант неконтролируемым ("Перезаписи любых файлов с тем же именем") и проверьте 3 следующих варианта ("Показать это диалоговое поле перед следующим сканированием", "Открытая папка изображения после сканирования" и "Показать добавить диалог страницы после сканирования"). Нажмите OK, чтобы закрыть окно
- Проверьте качество изображения, нажав на Preview. Окно предварительного просмотра появляется, и значок сканирования становится функциональным(рисунок 3C).
- Используйте программное обеспечение для разработки сценариев для автоматизации приобретения изображения. Предоставленный скрипт нажимает на сканирование в окне сканирования и OK в окне настройки файла с интервалом 30 минут.
- Импортировать скрипт, нажав на задачу (ru) Импортировать и выбирать как Single_scan.tsk, так и Idle_scanning.tsk (файлы TSK, предоставленные в качестве дополнительных файлов 1 и 2). Смотрите рисунок 3D.
ПРИМЕЧАНИЕ: Single_scan.tsk нажимает на кнопку сканирования в окне сканирования и OK в окне настройки сохранения файлов. Idle_scanning.tsk активирует Single_scan.tsk каждые 30 минут. Можно изменить частоту сканирования, изменив активацию Idle_scanning.tsk. - Включите автоматическое сканирование с интервалом 30 минут, выбрав как idle scanning (импорт) и Single scan (импортируется),правое нажатие на сканирование простоя (импорт)и левое нажатие на Enabled (Рисунок 3D, Дополнительная рисунок S2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматическое сканирование выполняется до тех пор, пока пользователь вручную не остановит скрипт. Чтобы остановить скрипт, выберите idle сканирование (импорт), нажмите правой кнопкой Idle сканирования (импортируется), и слева нажмите на Enabled. Контрольный знак будет удален.
- Импортировать скрипт, нажав на задачу (ru) Импортировать и выбирать как Single_scan.tsk, так и Idle_scanning.tsk (файлы TSK, предоставленные в качестве дополнительных файлов 1 и 2). Смотрите рисунок 3D.
4. Составление изображений с покадровой успеваемое и измерение репульсирования роя
- Выполняйте редактирование и анализ изображений с помощью ImageJ.
- Импортируйте все отсканированные изображения в ImageJ, нажав на файл Импорт (импорт) Последовательность изображений и выберите изображения. В окне последовательности опционов проверьте Convert to RGB, чтобы сохранить изображения в цвете. Количество изображений указывает количество выбранных изображений.
- Держите исходное изображение на 1, чтобы начать с первого изображения в папке и масштаб изображения на 100% для сохранения первоначального размера изображений. Оставьте Использовать виртуальный стек беспрепятственно. Нажмите OK и ждать изображения для загрузки(Рисунок 4A).
- Установите уровень сжатия видео до 100, нажав на Edit Варианты и опции Вход/выход... и настроить качество JPEG до 100.
- Сохранить файл в качестве .avi, нажав на файл (ru) Сохранить Как АВИ. Отрегулируйте сжатие до JPEG и частоты кадров до 5 кадров(рисунок 4B). Сохраните промежуток времени .avi в нужной папке.
- Чтобы количественно определить расстояния отвращения роя, откройте изображение ближе к концу периода роявства в ImageJ. Нажмите на файл Откройте и выберите изображение. Отрегулируйте шкалу, нажав на Анализ (ru) Установите шкалу и настройку расстояния в пикселях до 118, Известное расстояние до 1, соотношение аспекта Пикселя до 1,0, и единица длины до см(рисунок 4C). Оставьте Глобальный беспрепятственно. Нажмите OK, чтобы закрыть окно.
- Нажмите на значок Прямой и измерьте от центра колонии в положении спутника до края роющей сядох. Выберите Анализ (ru) Мера, чтобы сделать новое окно появится с измерениями (длина) (Рисунок 4D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте "Я", чтобы увеличить ближе и "-" для увеличения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаги, чтобы вырастить P. aeruginosa, подчеркнуть клетки, и изображение роятся агар пластины представлены на рисунке 1. Мы привили одну колонию дикого типа P. aeruginosa UCBPP-PA14 штамма из LB-агар пластины в 2 мл бульона LB ночь на 37 градусов по Цельсию и пятнистый 5 qL в центре роятся агар пластины. Временное изображение этой пластины показывает первоначальный рост в виде колонии в центре, а затем распространение сухожилий радиально из колонии(видео 1). Для коллективных анализов реакции на стресс, в дополнение к пятнистости P. aeruginosa в центре, 30 Зл той же ночной культуры смешивается с 6 Зл 1 х10 12 pfu/mL DMS3vir или 6 Л 3 мг/мл гентамицин в соотношении 5:1 и 6 л замечен на спутниковых позициях. Рои перемещаются из центра роятся агар пластины на периферию и отталкиваются от стрессового сигнала, испускаемого бактериями, которые были инфицированы фаги(Видео 2, верхняя левая пластина) или лечение с gentamycin (Видео 2, верхняя правая пластина). Фаги(Видео 2, нижняя левая пластина) или gentamycin(Видео 2, нижняя правая пластина) пятнистый только на спутниковых позиций не вызывают роятся населения, чтобы избежать этих областях.
Рисунок 1: Схема P. aeruginosa роятся асссееи и коллективной реакции на стресс. (A) P. aeruginosa клетки выращиваются на ночь (16-18 ч до OD600 примерно 1,5) в бульоне LB при 37 кс и (B) заметили в середине роятся агар пластины. Ночные культуры смешиваются с (C) фаги или (D) антибиотики и пятнистый на спутниковых позиций для коллективного реагирования на стресс анализы. (E) До 6 пластин изображены на сканере с интервалом 30 минут в течение 16-18 ч при 37 градусах Цельсия. После 18 ч, P. aeruginosa роятся населения избежать (F) клетки, инфицированные фагом или (G) клетки, обработанные антибиотиками (gentamycin). (H) P. aeruginosa населения роятся через роятся агар пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Установка сканера внутри инкубатора. (A) Черный Петри блюдо крышки построены в разделе 1. Эти крышки используются во время сканирования, чтобы уменьшить светоотражающие отражения и заменить прозрачные крышки чашки Петри. (B) Планшетный сканер документов помещается в инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия. На сканере помещаются шесть пластин с черными крышками (слева). Черная матовая ткань крепится к стойке на 60 см над сканером для дальнейшего уменьшения отражений и рассеянного света (правое изображение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Автоматизированное приобретение изображения с помощью планшетного сканера документов с помощью программного обеспечения для сканирования и автоматического скрипта. (A) Скриншот главного окна сканирования. Выбор типа изображения (цвет) и разрешение (300 dpi). Красный квадрат указывает значок папки для открытия окна настройки файла. Обратите внимание на кнопку Предварительного просмотра, но кнопка сканирования отключена. (B) Скриншот окна настройки файла для установки папок назначения для сохранения изображений, именования изображений и выбора формата изображений (слева). Окно настройки подключаемых положений используется для настройки качества формата изображения (справа). (C) Скриншот окна сканирования после нажатия на Предварительный просмотр. Кнопка сканирования является кнопкой мыши после получения предварительного просмотра. Теперь программа может быть автоматизирована с помощью программного обеспечения для сценариев (Материалы). (D) Скриншот окон программного обеспечения для сценариев с указанием кнопки Импорта, используемой для импорта скриптов автоматизации (слева). После импорта Single_scan.tsk и Idle_scanning.tsk они отображаются как задачи в главном окне (справа). После выбора обеих задач и правильного нажатия на них появляется кнопка «Включено». Левый нажатие Включить запускает скрипты для автоматического сканирования с интервалом 30 минут (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ изображений избегания роясов с помощью ImageJ. (A) Шаги по импорту последовательности изображений из замедленного изображения сканера. Нажав на файл (ru) Импорт (импорт) Последовательность изображений в главном окне ImageJ (слева) поднимает окно последовательности опций (справа) и открывает все отсканированные изображения. Красный квадрат указывает проверенную опцию загрузки изображений в формате RGB. Все остальные параметры остаются по умолчанию. (B) Шаги, чтобы сохранить замедленное видео в формате AVI. Выбор файла Сохранить Как AVI поднимает Сохранить как окно AVI. Сжатие устанавливается на JPEG и частота кадров до 5 кадров в секунду. (C) Установка единиц масштаба для изображений. Выбор анализов Установить масштаб довести окно шкалы настройки. Для 300 dpi изображений соответствующая шкала составляет 118 пикселей/см. (D) Измерение избежания от роятся популяций. От центра подчеркнутых колоний до края усиков протягивается желтая линия. Выбор анализов Измерение сообщает длину строки в новом окне с пометкой Результаты. Ctrl m — это ярлык клавиатуры, который выполняет измерения без выбора элементов меню. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель стаи P. aeruginosa. P. aeruginosa роятся населения на роятся агар пластины, которые являются (A) сухой, (B) нормальный, (C) влажный, и ( (D) дополнительные влажные. Сухие кишащие агарные пластины подавляют скорость роя P. aeruginosa и уменьшают количество сухожилий. Влажные кишащие агарные пластины вызывают образование крупных сухожилий. При дополнительных влажных условиях, tendrils образуются неравномерно по всей роятся агар пластины. Время сушки в ламинарном капоте и влажности окружающей среды оказывают значительное влияние на содержание влаги в кишах пластинами. Блюда 10 см Петри блюда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Повремени фильм роятся. Дикий тип P. aeruginosa были замечены в центре роятся пластины и были изображены на сканере в течение 22 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео 2: Покадровая съемка коллективного стресса. Дикий тип P. aeruginosa были замечены в центре рояющей пластины. Спутниковые позиции были замечены с P. aeruginosa, которые смешиваются дополнительно с (вверху слева) фаг или (вверху справа) гентамицин, или пятнистый исключительно с (нижний левый) фаг или (нижний-правый) гентамицин. Белые точки указывают на центр пятен. Плиты были изображены в течение 16 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительная рисунок S1: Шаблон покрытия для выявления клеток P. aeruginosa. Средняя черная точка представляет собой область пятен в размере 5 злителк овой ночи P. aeruginosa культуры. Радиус внутреннего круга находится на 2,8 см от центра пластины. Пересечение между внутренним кругом и прямыми линиями через внешний круг указывает на область пятен 6 злиться на стресс P. aeruginosa, фаг инфицированных или антибиотики обработанных клеток. Внешний круг представляет собой окружность 10 см чашкой Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра S2: Макро команды периодически начать сканирование с помощью программного обеспечения для сценариев. (A) Макро команды в Single_scan.tsk перемещает курсор для сканирования в окне сканирования, нажимает на сканирование, перемещается в ОК в окну сохранения файлов, и нажимает на OK. (B) Команды для сканирования в 30 минут интервалов. Задание Idle_scanning.tsk начинается Single_scan.tsk и настроено на активацию в 30 минутах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол фокусируется на минимизации изменчивости в роятся агар пластин и предоставление простой и недорогой метод для получения замедленного изображения P. aeruginosa роятся и реагирования на стресс. Эта процедура может быть расширена до изображения других бактериальных систем путем адаптации состава средств массовой информации и условий роста. Для P. aeruginosa, хотя M9 или FAB минимальная среда может быть использована для индуцирования роятся16,21, протокол, представленный здесь использует M8 среды с casamino кислот, глюкозы и сульфата магния6. P. aeruginosa рояется чувствителен к среднему составу, таким как наличие железа и питательных источников, включая аминокислоты22,23,24. Таким образом, выбор средств массовой информации для роятся агар пластин иллюстрирует важный аспект assaying роятся подвижности.
Контроль влажности и температуры в открытой лабораторной зоне представляет собой одну из самых больших проблем для согласованности анализов роя. Сезонные изменения способствуют изменчивости в роятся агар пластин влаги, которые могут значительно повлиять на роятся моделей. Поэтому для обеспечения оптимального качества пластины необходим постоянный контроль относительной влажности. Начиная обезвоживание 1 ч до сушки роятся агар пластины под ламинаром капота будет контролировать относительную влажность до постоянного 45%, сохраняя время сушки до 30 мин. Если влажная окружающая среда не поддается контролю, увеличение времени сушки является потенциальным простым решением для компенсации влажной среды. Во время роя, относительная влажность должна оставаться на 70% в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить высыхание агаровых пластин. Необнаруженный резервуар с водой в инкубаторе может служить водохранилищем. Сухие кишащие агарные пластины замедляют прогрессирование роятся популяций и уменьшают количество усиков, в то время как влажные пластины вызывают широкую структуру сухожилия(рисунок 5A-C). Дополнительные влажные кишащие агарпластины предотвратить четкое образование сухожилия и вызвать усики распространяться в неравномерном шаблоне(рис 5D). Описанный здесь метод может быть использован для поддержания постоянной влажной среды, которая обеспечит последовательность роятся на тарелках(Рисунок 5B, Видео 1). Кроме того, размер пластины и толщина агара играют роль в сохранении влаги в пластине. Мы использовали 10 см диаметром петри блюда и добавил20 мл роятся агар раствор на тарелку для обеспечения консистенции. Заливка пластин без измерения объемов не рекомендуется. В связи со многими переменными, которые влияют на рой обзор, мы рекомендуем оптимизацию проверки на местных лабораторных условиях, и мы подчеркиваем важность выполнения нескольких биологических репликации на отдельных партиях пластин для соблюдения последовательного и сопоставимых роящихся моделей.
Преимуществом метода замедленной визуализации для записи роящейподвижности является способность наблюдать прогрессирование подвижности без необходимости нарушать рои. Наш метод удобно создает промежуток времени в 6 пластин одновременно при одинаковых условиях, что обеспечивает как контролируемую среду для одновременной оценки нескольких штаммов, множественных экспериментальных условий, так и биологических репликаций. Использование шести спутниковых позиций на каждой пластине дополнительно облегчает статистический анализ, а использование ImageJ позволяет количественно определить рояющийся отпор.
Описанная здесь процедура является простым методом изучения взаимодействия между субпопуляциями P. aeruginosa:здоровой роющейся популяции и подчеркнутыми клетками. Помимо DMS3vir и gentamycin, дополнительные виды фагов, антибиотиков и конкурирующих бактерий или грибков могут быть использованы для изучения сигналов стресса. Хотя этот метод фокусируется на P. aeruginosa роятся подвижность, другие бактериальные виды, такие как S. aureus и кишечной палочки также демонстрируют роятся моделей, но они требуют адаптированных средств массовой информации роя1010,11. Оптимизируя составы средств и условия плиты, этот метод можно прикладной для того чтобы проанализировать киша, киша яси взаимодействия между бактериальными напряжениями, и реакциями усилия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Дж-Л.Б., А.С., и Н.М.Х-К. написал и пересмотрел рукопись. Все авторы разработали эксперименты. J.-L.B. провел эксперименты и анализ. Эта работа была поддержана NIH награду K22AI112816 и R21AI139968 грант a.S. и Калифорнийского университета. Н.М.Х-К. была поддержана Lundbeck стипендий R220-2016-860 и R251-2017-1070. Спонсоры не принимали никакого решения о представлении работы для публикации. У нас нет конкурирующих интересов, чтобы заявить.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
