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Biology

Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

Published: May 23, 2020 doi: 10.3791/60915
Automatic Translation
1, 1,2, 3
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

Summary

Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.

Abstract

El enjambre es una forma de motilidad superficial observada en muchas especies bacterianas incluyendo Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Aquí, las poblaciones densas de bacterias se mueven a grandes distancias en comunidades características en forma de zarcillo en el transcurso de horas. El enjambre es sensible a varios factores, incluyendo humedad media, humedad y contenido de nutrientes. Además, la respuesta al estrés colectivo, que se observa en P. aeruginosa que se estresa con antibióticos o bacteriófagos (fago), repele que los enjambres se acerquen a la zona que contiene el estrés. Los métodos descritos aquí abordan cómo controlar los factores críticos que afectan al enjambre. Presentamos un método sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y la respuesta de tensión colectiva con alta resolución temporal usando un escáner de documentos de base plana, y describimos cómo compilar y realizar un análisis cuantitativo de enjambres. Este método simple y rentable proporciona una cuantificación precisa y bien controlada del enjambre y puede extenderse a otros tipos de ensayos de crecimiento a base de placas y especies bacterianas.

Introduction

El enjambre es una forma colectiva de motilidad bacteriana coordinada que aumenta la resistencia a los antibióticos y la producción de factores de virulencia en el huésped1,2,3. Este comportamiento multicelular ocurre en superficies semisólidas que se asemejan a las de las capas mucosas que cubren las membranas epiteliales en los pulmones4,5. Los biosurfactantes son comúnmente producidos por poblaciones enjambres para superar la tensión superficial en las superficies y la producción de estos está regulada por complejos sistemas de señalización de células celulares, también conocidos como cuórum de sensato6,7,8. Muchas especies de bacterias son capaces de enjambre, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,y Escherichia coli9,10,11,12. Los patrones de enjambre creados por las bacterias son diversos y se ven afectados por las propiedades físicas y químicas de la capa superficial, incluyendo la composición de nutrientes, porosidad y humedad13,14. Además de las propiedades de la superficie, la temperatura de crecimiento y la humedad ambiental afectan a varios aspectos de la dinámica de enjambre, incluyendo la tasa de enjambre y los patrones12,,13,,14,,15. Las variables de crecimiento que afectan al enjambre crean desafíos que afectan la reproducibilidad experimental y la capacidad de interpretar los resultados. Aquí, describimos un método estandarizado simple para monitorear la dinámica de los enjambres bacterianos a través de imágenes de lapso de tiempo. El método describe cómo controlar las condiciones críticas de crecimiento que afectan significativamente la progresión del enjambre. En comparación con los métodos tradicionales de análisis de enjambres, este método de imágenes de lapso de tiempo permite realizar un seguimiento de la motilidad de múltiples enjambres simultáneamente durante períodos prolongados de tiempo y con alta resolución. Estos aspectos mejoran la profundidad de los datos que se pueden obtener de la supervisión de enjambres y facilitan la identificación de los factores que afectan el enjambre.

El enjambre en P. aeruginosa se facilita a través de la producción y liberación de ácidos rhamnolipids y 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic en el área circundante6,16. La introducción del estrés a partir de concentraciones subletales de antibióticos o infección por el virus del fago afecta la organización de enjambres. En particular, estas tensiones inducen a P. aeruginosa a liberar la molécula de sensibilidad de quórum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolona, también conocida como la señal de quinolona Pseudomonas (PQS)17,18. En los ensayos de enjambres que contienen dos poblaciones de enjambres, los PQS producidos por la población inducida por el estrés repele que los enjambres no tratados entren en el área que contiene la tensión (Figura 1). Esta respuesta de estrés colectivo constituye un sistema de señalización de comunicación de peligro que advierte a P. aeruginosa sobre amenazas cercanas18,,19. Los efectos del estrés en P. aeruginosa, la activación de la respuesta de estrés colectivo y la repulsión de enjambres se pueden visualizar utilizando el método de imagen de lapso de tiempo descrito aquí. El protocolo descrito aquí explica cómo: (1) preparar placas de agar para enjambre, (2) cultivo P. aeruginosa para dos tipos de ensayos (ensayos de enjambre tradicionales o ensayos de respuesta de estrés colectivo)(Figura 1), (3) adquirir imágenes de lapso de tiempo, y (4) utilizar ImageJ para compilar y analizar las imágenes.

Brevemente, P. aeruginosa de un cultivo nocturno se ve en medio de una placa de agar enjambre, mientras que P. aeruginosa que están infectados con fago o tratados con antibióticos son vistos en las posiciones del satélite. La progresión del enjambre de P. aeruginosa se supervisa en un escáner de cama plana de documentos de consumo que se coloca en una incubadora de 37 oC regulada por humedad. El escáner está controlado por un software que escanea automáticamente las placas a intervalos regulares durante el período de crecimiento del enjambre, normalmente de 16 a 20 h. Este método produce videos simultáneos de lapso de tiempo de hasta seis placas de enjambre de 10 cm. Las imágenes se compilan en películas y la repulsión de enjambres por poblaciones inducidas por el estrés se cuantifica mediante el uso de software ImageJ disponible libremente. Se presta especial atención a garantizar la coherencia y reproducibilidad entre los diferentes experimentos de enjambre.

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Protocol

1. Preparación de placas de agar enjambre para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging

  1. Preparar 1 L de 5x M8 medios mínimos en una botella de vidrio añadiendo 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4y 2,5 g de NaCl en agua de doble destilación de 500 ml (ddH2O). Ajuste el volumen final a 1 L con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar y almacenar medios líquidos a temperatura ambiente.
  2. Preparar 100 ml de 1 M MgSO4 (sulfato de magnesio) en una botella de vidrio añadiendo 24,6 g de MgSO4•7H2O en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.
  3. Preparar 100 ml de 20% de ácidos casamino en una botella de vidrio añadiendo 20 g de ácidos casamino en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.
  4. Preparar 100 ml de 20% de glucosa en un frasco de vidrio añadiendo 20 g de glucosa en 50 ml de ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Esterilizar por filtración con filtro de 0,22 m. Conservar a temperatura ambiente.
  5. Para hacer 10 placas de agar enjambre, añadir 1 g de agar en 100 ml de ddH2O y ajustar el volumen final a 160 ml con ddH2O adicional en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilice mediante autoclave.
    1. Inmediatamente después del autoclave, coloque la solución de agar en un baño de agua de 55 oC durante 15 minutos.
    2. Retire la solución de agar del baño de agua y añada 40 ml de 5x M8 medios mínimos, 200 ml de 1 M MgSO4, 2 ml de 20% de glucosa y 5 ml de ácidos casamino al 20%15. Continúe con el paso 1.6 inmediatamente después de la mezcla.
      NOTA: Las concentraciones finales son 0,5% agar, 1 mM MgSO4, 0,2% glucosa y 0,5% ácidos casamino.
  6. Usando una pipeta de 25 ml para un volumen constante, agregue 20 ml de la solución de agar enjambre por plato Petri de 10 cm de diámetro.
    NOTA: Un volumen fijo de solución de agar es importante, ya que el volumen afecta al tiempo de secado y al contenido de humedad del agar. Evite las burbujas al hacer las placas de agar enjambre.
  7. Deje que el agar se solidifique colocando las placas de agar enjambre en una sola pila con tapas puestas durante 1 h en el banco a temperatura ambiente. Encienda el deshumidificador para disminuir la humedad relativa de la habitación a 40-50% 1 h antes del siguiente paso.
  8. Seque las placas de agar enjambre durante 30 minutos adicionales con las tapas en una campana de flujo laminar a 300 pies3/min con 40-50% de humedad relativa a temperatura ambiente. Seque el interior de las tapas colocándolas boca arriba en la campana de flujo laminar. Almacene las placas de agar enjambre a 4 oC durante un máximo de 24 h.
  9. Prepare tapas negras de 10 cm petri para la toma de imágenes alisando el interior de la tapa con papel de lija. Coloque las tapas dentro de una caja de embalaje y coloque la caja de embalaje debajo de una campana química. Rocíe dentro de las tapas con pintura en aerosol negra. Deje que las tapas se sequen.
    NOTA: Las tapas negras se pueden reutilizar para experimentos adicionales. Es importante que las tapas estén pintadas para que no reflejen la luz durante el escaneo.

2. Crecimiento de las condiciones de P. aeruginosa y Plating

  1. Preparar 400 ml de caldo de lisógenia (LB) añadiendo 10 g de mezcla en polvo LB-Miller en 400 ml ddH2O. Para platos de Petri de 2% LB-agar, agregue 8 g de agar adicional. Autoclave para esterilizar.
  2. Vierta 20 ml de medio de agar LB fundido en platos Petri de 10 cm de diámetro y deje que se solidifiquen a temperatura ambiente durante la noche. Almacene los medios líquidos a temperatura ambiente y a garares a 4oC.
  3. Streak P. aeruginosa en un plato de Petri LB-agar a partir de un caldo congelado almacenado a -80 oC utilizando lazos estériles o palos de madera. Incubar la placa Petri boca abajo durante la noche a 37oC. Almacene la placa de agar LB a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
  4. Escoge una sola colonia de la placa Petri con un lazo estéril o palo de madera, inocularla en un medio LB de 2 ml e incubar el cultivo a la saturación durante la noche (16-18 h) a 37oC en un tambor de rodillos a 100 rpm.
  5. Pipeta de 5 l de cultivo nocturno del paso 2.4 utilizando un pipeta P20 y punto en el centro de la placa de agar enjambre acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10–45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con sólo la gota de líquido(Figura 1B).
    1. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla para colocar el punto constantemente a través de diferentes placas de agar enjambre(Figura suplementaria S1).
    2. Para los ensayos de enjambre tradicionales, utilice solo el punto central y vaya al paso 2.8. Para los ensayos de respuesta al estrés colectivo, continúen con el paso 2.6 (para la infección por fagos) o el paso 2.7 (para el estrés antibiótico).
  6. Para la infección por fago, mezcle 30 ml de cultivo nocturno de P. aeruginosa a partir del paso 2.4 con 6 l de 1 x10 12 pfu/ml de fago DMS3vir20. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
    1. Pipet a 6 l de la P. mezcla de aeruginosa-fago del paso 2.6 usando un pipeta P20 y punto en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm que se centra en la placa Petri acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la caída de líquido(Figura 1).C
    2. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.
  7. Para los tratamientos antibiótico, mezcle el cultivo nocturno de 30 ml P. aeruginosa del paso 2.4 con 6 ml de gentamicina de 3 mg/ml, 10 ml de kanamicina de 100 mg/ml o 7,5 ml de fosfomicina de 100 mg/ml. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
    1. Pipet 6 l de antibiótico tratado P. aeruginosa del paso 2.7 usando una pipeta P20 y spot en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm alrededor del centro de la antena acercándose a la punta del pipeteo en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de detección, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la gota de líquido).D
    2. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.
  8. Sustituya las tapas claras de la vajilla Petri por tapas negras hechas en el paso 1.9(Figura 2A).
  9. Coloque las placas de agar enjambre en un escáner en una incubadora a 37 oC con un baño de agua de 10 L para mantener la humedad al 75%(Figura 1E, Figura 2B).
    ADVERTENCIA: No moleste las células manchadas en las placas de agar enjambre. Mantenga las placas hacia arriba en todo momento.

3. Adquisición de imágenes con escáner

  1. Disminuya la iluminación ambiental de los platos Petri conectando tela mate negra a un estante de 40-60 cm por encima del escáner de documentos de base plana. Asegúrelo usando corbatas(Figura 2B).
  2. El escáner se controlará mediante un software de escaneo y un software de scripting automático.
    1. En el software de escaneado, seleccione Modo de inicio(figura 3A). Capture imágenes en color seleccionando Color en Tipo de imagen. Para establecer la calidad de imagen, seleccione Otro en Destino y ajuste la Resolución a 300 ppp. Mantenga el tamaño estándar de las imágenes seleccionando Original para Tamaño de destino. Deje todas las opciones en Ajustes de imagen desactivadas para obtener la calidad de imagen estándar.
      NOTA: Tamaño de destino se establece en Original de forma predeterminada. Para seleccionar otras opciones para Tamaño de destino, haga clic en Vista previa primero.
  3. Establezca la ruta de guardado de las imágenes haciendo clic en el icono de carpeta a la derecha de Escanear para abrir Configuración de guardado de archivos(Figura 3A).
    1. Seleccione el destino de la carpeta para guardar imágenes seleccionando Otro en Ubicación y haga clic en Examinar. Elija una carpeta para guardar las imágenes.
    2. Asigne un nombre a las imágenes en el cuadro de texto Prefijo. Establezca número de inicio 001 para comenzar la secuencia de nomenclatura de las imágenes. Establezca el formato de archivo en JPEG seleccionando JPEG (*.jpg) en Tipo en Formato de imagen y haga clic en Opciones para ajustar detalles. Establezca la calidad del formato de imagen ajustando El nivel de compresión a 16, Codificación a estándar y marque Incrustar perfil ICC. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana(Figura 3B).
    3. Deje la primera opción desactivada ("Sobrescribir cualquier archivo con el mismo nombre") y marque las 3 opciones siguientes ("Mostrar este cuadro de diálogo antes del siguiente escaneo", "Abrir carpeta de imagen después de escanear" y "Mostrar cuadro de diálogo Agregar página después de escanear"). Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana
    4. Compruebe la calidad de la imagen haciendo clic en Vista previa. Aparece la ventana de vista previa y el icono Escanear se vuelve funcional(Figura 3C).
  4. Utilice el software de scripting para automatizar la adquisición de imágenes. El script proporcionado hace clic en Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos a intervalos de 30 minutos.
    1. Importe el script haciendo clic en Tarea ( Task) Importe y seleccione Single_scan.tsk y Idle_scanning.tsk (archivos TSK proporcionados como archivos suplementarios 1 y 2). Vea la figura 3D.
      NOTA: Single_scan.tsk hace clic en el botón Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos. Idle_scanning.tsk activa Single_scan.tsk cada 30 minutos. Uno puede cambiar la frecuencia de escaneo cambiando la activación de Idle_scanning.tsk.
    2. Habilite el análisis automático a intervalos de 30 minutos seleccionando Análisis inactivo (importado) y Análisis único (importado),haciendo clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haciendo clic izquierdo en Habilitado (Figura 3D, Figura suplementaria S2).
      NOTA: El análisis automático se ejecuta hasta que el usuario detiene manualmente el script. Para detener el script, seleccione Análisis inactivo (importado),haga clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haga clic con el botón izquierdo en Habilitado. Se eliminará la marca de verificación.

4. Compilación de imágenes de lapso de tiempo y repulsión del enjambre de medición

  1. Realice la edición de imágenes y el análisis de imágenes con ImageJ.
  2. Importe todas las imágenes escaneadas a ImageJ haciendo clic en Archivo . Importación de la lista de importaciones Secuencia de imágenes y seleccione las imágenes. En la ventana Opciones de secuencia, active Convertir a RGB para mantener las imágenes en color. El número de imágenes indica el número de imágenes seleccionadas.
  3. Mantenga Iniciar imagen en 1 para empezar desde la primera imagen de la carpeta y Escalar imágenes al 100% para conservar el tamaño original de las imágenes. Deje la opción Usar pila virtual desactivada. Haga clic en Aceptar y espere a que se carguen las imágenes(Figura 4A).
  4. Establezca el nivel de compresión de vídeo en 100 haciendo clic en Editar . Opciones de la página de opciones de la Entrada/Salida... y ajuste la calidad JPEG a 100.
  5. Guarde el archivo como un archivo .avi haciendo clic en Archivo . Guardar como ? AVI. Ajuste la compresión a JPEG y la velocidad de fotogramas a 5 fps(Figura 4B). Guarde el lapso de tiempo .avi en la carpeta deseada.
  6. Para cuantificar las distancias de repulsión del enjambre, abra una imagen cerca del final del período de enjambre en ImageJ. Haga clic en Archivo ? Abra y seleccione la imagen. Ajustar la escala haciendo clic en Analizar ( Analizar) Establezca Escala y ajuste Distancia en píxeles a 118, Distancia conocida en 1, Relación de aspecto de píxeles en 1,0 y Unidad de longitud a cm ( Figura4C). Deje Global sin marcar. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
  7. Haga clic en el icono Recto y mida desde el centro de la colonia en la posición del satélite hasta el borde de la población enjambre. Seleccione Analizar (Analizar) Medida para hacer que aparezca una nueva ventana con las medidas (Longitud) (Figura 4D).
    NOTA: Utilice "+" para acercar el zoom y "-" para alejar.

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Representative Results

Los pasos para cultivar P. aeruginosa, estresar las células e imaginar las placas de agar enjambre se representan en la Figura 1. Inoculamos una sola colonia de cepas de tipo salvaje P. aeruginosa UCBPP-PA14 a partir de una placa de agar LB en 2 ml de caldo LB durante la noche a 37 oC y nos detectamos 5 oC en el centro de la placa de agar enjambre. Las imágenes de lapso de tiempo de esta placa revelan el crecimiento inicial en forma de colonia en el centro y luego la propagación de zarcillos radialmente desde la colonia (Video 1). Para los ensayos de respuesta al estrés colectivo, además de detectar P. aeruginosa en el centro, se mezclan 30 ml del mismo cultivo nocturno con 6 l de 1 x10 12 pfu/ml DMS3vir o 6 ml de 3 mg/ml de gentamicina en una proporción de 5:1 y 6 l de manchas en las posiciones de satélite. Los enjambres se mueven desde el centro de las placas de agar enjambre a la periferia y son repelidos por una señal de tensión emitida por las bacterias que fueron infectadas con fagos(Video 2,placa superior izquierda) o tratadas con gentamicina (Video 2, placa superior derecha). Phages(Video 2, placa inferior izquierda) o gentamicina(Video 2, placa inferior derecha) manchado solo en las posiciones del satélite no hacen que las poblaciones enjambres eviten estas áreas.

Figure 1
Figura 1: Esquema del ensayo de enjambre P. aeruginosa y respuesta al estrés colectivo. (A) Las células de P. aeruginosa se cultivan durante la noche (16-18 h a OD600 de aproximadamente 1.5) en caldo LB a 37 oC y (B) manchado en el medio de la placa de agar enjambre. Los cultivos nocturnos se mezclan con(C)fagos o (D) antibióticos y se detectan en las posiciones de los satélites para ensayos de respuesta al estrés colectivo. (E) Se utilizan hasta 6 placas en un escáner a intervalos de 30 minutos durante 16-18 h a 37 oC. Después de las 18 h, las poblaciones enjambre de P. aeruginosa evitan(F) células infectadas con fago o(G)células tratadas con antibióticos (gentamicina). (H) Poblaciones de P. aeruginosa se enjambre a través de la placa de agar enjambre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración del escáner dentro de la incubadora. (A) Tapas de vajilla Black Petri construidas en la sección 1. Estas tapas se utilizan durante el escaneo para reducir los reflejos de luz y reemplazar las tapas claras de la placa Petri. (B) El escáner de documentos de base plana se coloca en una incubadora a 37 oC. Se colocan seis placas con tapas negras en el escáner (imagen izquierda). Tejido mate negro se une al bastidor 60 cm por encima del escáner para reducir aún más los reflejos y la luz perdida (imagen derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Adquisición automatizada de imágenes desde el escáner de documentos de base plana utilizando el software de escaneo y scripting automático. (A) Captura de pantalla de la ventana principal de Scan. Selección de Tipo de imagen (Color) y Resolución (300 ppp). El cuadrado rojo indica el icono de carpeta para abrir la ventana Configuración de guardado de archivos. Tenga en cuenta que se puede pulsar el botón Vista previa, pero el botón Escanear está deshabilitado. (B) Captura de pantalla de la ventana Configuración de guardado de archivos para establecer el destino de la carpeta para guardar imágenes, nombrar las imágenes y elegir el formato de las imágenes (izquierda). La ventana Configuración de plug-in se utiliza para establecer la calidad del formato de imagen (derecha). (C) Captura de pantalla de la ventana Escanear después de hacer clic en Vista previa. Se puede hacer clic en el botón Escanear después de adquirir una vista previa. El programa ahora se puede automatizar utilizando el software de scripting (Materiales). (D) Captura de pantalla de las ventanas de software de scripting que indica el botón Importar utilizado para importar los scripts de automatización (izquierda). Una vez que se importan Single_scan.tsk y Idle_scanning.tsk, estos aparecen como tareas en la ventana principal (derecha). Después de seleccionar ambas tareas y hacer clic con el botón derecho en ellas, aparece el botón Habilitado. Al hacer clic izquierdo en Habilitar, se inician los scripts para escanear automáticamente a intervalos de 30 minutos (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de imagen de la evitación de enjambres utilizando ImageJ. (A) Pasos para importar una secuencia de imágenes de las imágenes del escáner de lapso de tiempo. Al hacer clic en El archivo de la página de archivos de la página de archivos de Importación de la lista de importaciones Secuencia de imágenes en la ventana principal de ImageJ (izquierda) abre la ventana Opciones de secuencia (derecha) y abre todas las imágenes escaneadas. El cuadrado rojo indica la opción marcada para cargar imágenes en formato RGB. Todas las demás opciones se dejan como predeterminadas. (B) Pasos para guardar el vídeo de lapso de tiempo en formato AVI. Selección de archivo ( Seleccionar archivo) Guardar como ? AVI abre la ventana Guardar como AVI. La compresión se establece en JPEG y la velocidad de fotogramas en 5 fps. (C) Ajuste de las unidades de escala de las imágenes. Selección de Analizar (Analizar) Configurar escala para abrir la ventana Establecer escala. Para imágenes de 300 ppp, la escala adecuada es de 118 píxeles/cm. (D) Medición de la evitación de poblaciones enjambres. Una línea amarilla se dibuja desde el centro de las colonias estresadas hasta el borde de los zarcillos. Selección de Analizar (Analizar) Medir informa de la longitud de la línea en una nueva ventana con la etiqueta Resultados. Ctrl + M es un método abreviado de teclado que realiza la medición sin seleccionar los elementos de menú. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Enjambres representativos de P. aeruginosa. P. aeruginosa enjambre poblaciones en saqueo en placas de agar enjambre que son (A) secas, (B) normal, (C) húmedas, y (D) extra húmedas. Las placas de agar enjambre seco inhiben la velocidad del enjambre de P. aeruginosa y reducen el número de zarcillos. Las placas de agar enjambre húmedo causan la formación de zarcillos grandes. En condiciones de humedad adicional, los zarcillos se forman de manera desigual a lo largo de las placas de agar enjambre. Los tiempos de secado en la campana de flujo laminar y la humedad ambiental tienen efectos significativos en el contenido de humedad de la placa de enjambre. Los platos son de 10 cm de platos Petri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Vídeo 1: Película de lapso de tiempo de enjambre. P. aeruginosa de tipo salvaje fueron vistos en el centro de la placa enjambre y fueron imágenes en el escáner en el transcurso de 22 h. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Video 2
Vídeo 2: Película de lapso de tiempo de la respuesta de estrés colectivo. P. aeruginosa de tipo salvaje fueron vistos en el centro de la placa enjambre. Las posiciones satelitales fueron manchadas con P. aeruginosa que se mezclan adicionalmente con fago (superior izquierda) o (superior derecha) gentamicina, o se vieron únicamente con fago (abajo a la izquierda) o (abajo a la derecha) gentamicina. Los puntos blancos indican el centro de las manchas. Las placas fueron imágenes en el transcurso de 16 h. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Supplementary Figure 1
Figura suplementaria S1: Plantilla de chapado para detectar células de P. aeruginosa. El punto negro medio representa el área de manchado de 5 l de cultivo de P. aeruginosa durante la noche. El radio del círculo interior está a 2,8 cm del centro de la placa. La intersección entre el círculo interior y las líneas rectas a través del círculo exterior indica el área de manchado de 6 l de Células estresadas de P. aeruginosa,células infectadas por fagos o células tratadas con antibióticos. El círculo exterior representa la circunferencia de 10 cm de plato Petri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 2
Figura suplementaria S2: Comandos de macro para iniciar periódicamente el análisis utilizando un software de scripting. (A) Los comandos de macro en Single_scan.tsk mueve el cursor a Escanear en la ventana Escanear, hace clic en Escanear, se mueve a Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos y hace clic en Aceptar. (B) Comandos para escanear en intervalos de 30 minutos. La tarea Idle_scanning.tsk inicia Single_scan.tsk y está configurada para activarse en intervalos de 30 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo se centra en minimizar la variabilidad en las placas de agar enjambre y proporcionar un método simple y de bajo costo para adquirir imágenes de lapso de tiempo de P. aeruginosa enjambre y responder al estrés. Este procedimiento se puede extender a la imagen de otros sistemas bacterianos mediante la adaptación de la composición de los medios y las condiciones de crecimiento. Para P. aeruginosa,aunque M9 o FAB medio mínimo se puede utilizar para inducir enjambre16,21, el protocolo presentado aquí utiliza medio M8 con ácidos casamino, glucosa, y sulfato de magnesio6. P. aeruginosa enjambre es sensible a la composición media como la disponibilidad de hierro y fuentes de nutrientes incluyendo aminoácidos22,,23,24. Por lo tanto, la selección de medios para placas de agar enjambre ilustra un aspecto importante de la motilidad enjambre.

El control de la humedad y la temperatura en un área de laboratorio abierta representa uno de los mayores desafíos para la consistencia de los ensayos de enjambres. Los cambios estacionales contribuyen a la variabilidad en la humedad de las placas de agar enjambre, lo que puede afectar significativamente los patrones de enjambre. Por lo tanto, se requiere un control constante de la humedad relativa para garantizar una calidad óptima de la placa. A partir del deshumidificador 1 h antes de secar las placas de agar enjambre bajo la campana de flujo laminar controlará la humedad relativa a un 45% constante, manteniendo el tiempo de secado a 30 min. Si no se puede controlar la humedad ambiental, aumentar el tiempo de secado es una posible solución simple para compensar ambientes húmedos. Durante el enjambre, la humedad relativa debe permanecer en el 70% en la incubadora de 37 oC para evitar que las placas de agar se sequen. Un cubo de agua sin acaparar en la incubadora puede servir como un depósito de agua. Las placas de agar enjambre seco ralentizan la progresión de las poblaciones enjambres y reducen el número de zarcillos, mientras que las placas húmedas causan una amplia estructura de zarcillos(Figura 5A–C). Las placas de agar enjambre extra húmedas evitan la formación de zarcillos claros y hacen que los zarcillos se propaguen en un patrón desigual(Fig. 5D). El método descrito aquí se puede utilizar para mantener un ambiente húmedo constante que garantizará la consistencia del enjambre en las placas(Figura 5B, Vídeo 1). Además, el tamaño de la placa y el grosor del agar juegan un papel en la retención de la humedad en la placa. Hemos utilizado platos Petri de 10 cm de diámetro y hemos añadido 20 ml de solución de agar enjambre por placa para garantizar la consistencia. No se recomienda verter placas sin medir volúmenes. Debido a las muchas variables que afectan al ensayo de enjambre, recomendamos optimizar el ensayo a las condiciones de laboratorio locales y subrayamos la importancia de realizar múltiples réplicas biológicas en lotes separados de placas para observar patrones de enjambre consistentes y comparables.

La ventaja del método de imagen de lapso de tiempo para registrar la motilidad enjambre es la capacidad de observar la progresión de la motilidad sin la necesidad de perturbar los enjambres. Nuestro método crea convenientemente lapsos de tiempo de 6 placas simultáneamente en las mismas condiciones, lo que proporciona un entorno controlado para la evaluación simultánea de múltiples cepas, múltiples condiciones experimentales o réplicas biológicas. El uso de seis posiciones satelitales en cada placa facilita además el análisis estadístico y el uso de ImageJ permite cuantificar la repulsión enjambre.

El procedimiento descrito aquí es un método simple para estudiar la interacción entre las subpoblaciones de P. aeruginosa:una población sana y células estresadas. Más allá de DMS3vir y gentamicina, se pueden utilizar tipos adicionales de fagos, antibióticos y bacterias u hongos competidores para estudiar la señalización del estrés. Aunque este método se centra en la motilidad enjambre de P. aeruginosa, otras especies bacterianas como S. aureus y E. coli también exhiben patrones de enjambre, pero requieren medios adaptados para enjambre10,,11. Al optimizar las composiciones de medios y las condiciones de las placas, este método se puede aplicar para analizar las interacciones enjambres y enjambres entre cepas bacterianas y las respuestas de tensión.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

J.-L.B., A.S., y N.M.H-K. escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores diseñaron los experimentos. J.-L.B. realizó los experimentos y análisis. Este trabajo fue apoyado por el premio NIH K22AI112816 y la concesión R21AI139968 a A.S. y por la Universidad de California. N.M.H-K. fue apoyado por las Becas Lundbeck R220-2016-860 y R251-2017-1070. Los funderos no tuvieron ningún papel en la decisión de presentar la obra para su publicación. No tenemos intereses que declarar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010 For LB-agar plate and swarming agar plate
Casamino acids BD Difco 223050 For swarming media
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose. For swarming media
Fosfomycin disodium salt Tokyo Chemical Industry F0889 Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Gentamycin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O
LB-Miller BD Difco 244620 For LB broth and LB-agar plates
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391 For swarming media
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 For 5x M8 media
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 For 5x M8 media
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373 For 5x M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab AFS27E.118 PA14 strain
DMS3vir O'Toole lab DMS3vir20 Bacteriophage
Supplies
Aluminium oxide sandpaper 3M 150 Fine For black lids
Black fabric Joann PRD7089 Black fabric
Black spray paint Krylon 5592 Matte Black For black lids
Erlenmeyer flask Kimax 26500 250 mL
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1,000 mL
8 inches zip ties Gardner Bender E173770 For attaching black matte fabric
Petri dishes (100 mm x 15 mm) Fisher FB0875712 100 mm x 15 mm polystyrene plates
Wooden sticks Fisher 23-400-102 For streaking and inoculating bacteria
Equipment
Autoclave Market Forge Industries STM-E For sterilizing reagents
25 mL pipette USA Scientific, Inc. 1072-5410 To pipet 20 mL for swarming agar plates
Dehumidifier Frigidaire FAD704DWD 70-pint For maintaing room relative humidity at about 45%
ImageJ NIH v1.52a Software for image analysis
Incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Isotemp waterbath Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C
Laminar flow hood The Baker Company SG603A For drying plates
P-20 pipet Gilson F123601 Spotting on swarming agar plates
Pipette Controller BrandTech accu-jet To pipet 20 mL for swarming agar plates
Roller Drum New Brunswick TC-7 For growth of bacteria at 100 rpm
Scanner Epson Epson Perfection V370 Photo Scanner for imaging plates
Scanner automation software RoboTask Lite v7.0.1.932 For 30 min internals imaging
Scanner image acquisition software Epson v9.9.2.5US Software for imaging plates

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References

  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
  3. Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
  4. Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  5. Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
  6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
  7. Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
  8. Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
  9. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  10. Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
  11. Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
  12. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  13. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
  14. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
  15. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
  16. Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  17. Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
  18. Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
  19. van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
  20. Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
  21. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
  22. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
  23. Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
  24. Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).

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Biología Número 159 Pseudomonas aeruginosa,enjambre comunicación de peligro bacteriano observación de quórum PQS estrés antibiótico bacteriófago
Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés
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Bru, J. L., Siryaporn, A.,… More

Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (159), e60915, doi:10.3791/60915 (2020).

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