Summary
Biz psödomonas aeruginosa sürüleri bakteriyofaj (faj) ve antibiyotik stres bir flatbed belge tarayıcı kullanarak yanıt yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmler üretmek için basit bir yöntem detay. Bu prosedür, sürü dinamiklerini izlemek için hızlı ve basit bir yöntemdir ve diğer bakteri türlerinin hareketliliğini ve büyümesini incelemek için uyarlanabilir.
Abstract
Swarming Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia colidahil olmak üzere birçok bakteri türlerinde gözlenen yüzey hareketliliği bir şeklidir. Burada, yoğun bakteri popülasyonları, saat boyunca karakteristik tendril şekilli topluluklarda büyük mesafeler boyunca hareket eder. Swarming orta nem, nem ve besin içeriği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere duyarlıdır. Buna ek olarak, antibiyotik veya bakteriyofaj (faj) tarafından stresli P. aeruginosa gözlenen kolektif stres yanıtı, stres içeren alana yaklaşan sürüleri iter. Burada açıklanan yöntemler, sürücürün nasıl kontrol altına alınabildiğini ele adamaktadır. Düz yataklı belge tarayıcısı kullanarak sürü dinamiklerini ve kolektif stres tepkisini yüksek zamansal çözünürlükle izlemek ve sürülerin nicel analizini nasıl derleyip gerçekleştirebileceğimizi açıklamak için basit bir yöntem sıyoruz. Bu basit ve uygun maliyetli yöntem, sürünün hassas ve iyi kontrollü bir şekilde ölçülmesini sağlar ve diğer plaka bazlı büyüme tahlillerine ve bakteri türlerine de genişletilebilir.
Introduction
Swarming antibiyotik direnci ve ev sahibi1virülans faktörlerin üretimini artırır koordine bakteriyel hareketlilik kolektif bir şeklidir1 ,2,3. Bu çok hücreli davranış akciğerlerde epitel zarları kapsayan mukoza katmanları benzer yarı katı yüzeylerde oluşur4,5. Biyosürfamaddeler genellikle yüzeylerde yüzey gerilimi aşmak için kalabalık popülasyonlar tarafından üretilen ve bunların üretimi karmaşık hücre-hücre sinyal sistemleri tarafından düzenlenir, ayrıca çoğunluk algılama olarak bilinen6,7,8. Bakteri birçok tür sürü yeteneğine sahiptir, Pseudomonas aeruginosadahil, Staphylococcus aureus, ve Escherichia coli9,10,11,12. Bakteriler tarafından oluşturulan sürü desenleri çeşitlidir ve besin bileşimi, gözeneklilik ve nem13,14dahil olmak üzere yüzey tabakasının fiziksel ve kimyasal özelliklerinden etkilenir. Yüzey özelliklerine ek olarak, büyüme sıcaklığı ve ortam nemi sürü dinamiği çeşitli yönlerini etkiler, swarming oranı ve desenleri de dahil olmak üzere12,13,14,15. Sürüleri etkileyen büyüme değişkenleri, deneysel tekrarlanabilirliği ve sonuçları yorumlama yeteneğini etkileyen zorluklar yaratır. Burada, zaman atlamalı görüntüleme yoluyla bakteri sürülerinin dinamiklerini izlemek için basit bir standart yöntemi tanımlıyoruz. Yöntem, swarming ilerlemesini önemli ölçüde etkileyen kritik büyüme koşullarının nasıl kontrol edilebildiğini açıklar. Geleneksel sürü analizi yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu hızlandırılmış görüntüleme yöntemi, uzun süreler boyunca ve yüksek çözünürlükte aynı anda birden fazla sürünün hareketliliğini izlemeyi sağlar. Bu hususlar, sürülerin izlenmesinden elde edilebilen verilerin derinliğini artırır ve sürüleri etkileyen faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırır.
P. aeruginosa swarming üretimi ve rhamnolipidler ve 3-(3-hidroksyalkanoyloxy) alkanoik asitlerinçevreye,6,16salınımı ile kolaylaştırılır. Faj virüsü ile antibiyotik veya enfeksiyon alt öldürücü konsantrasyonları stres giriş sürüleri organizasyonu etkiler. Özellikle, Bu stresler P. aeruginosa prosing molekül 2-heptyl-3-hidroksi-4-kinolon, ayrıca Pseudomonas quinolone sinyal (PQS) 17 olarak bilinen serbest bırakmak için neden17,18. İki sürü popülasyonu içeren sürü tahlillerinde, strese bağlı popülasyon tarafından üretilen PQS, işlenmemiş sürüleri stres içeren alana girmekten uzaklaştırır(Şekil 1). Bu toplu stres tepkisi yakındaki tehditler hakkında P. aeruginosa uyarır bir tehlike iletişim sinyal sistemi oluşturur18,19. P. aeruginosaüzerinde stresin etkileri , kolektif stres yanıtı aktivasyonu, ve sürülerin itme burada açıklanan hızlandırılmış görüntüleme yöntemi kullanılarak görselleştirilebilir. Burada açıklanan protokol nasıl açıklanabilir: (1) swarming için agar plakaları hazırlamak, (2) kültür P. aeruginosa tahliller iki tür (geleneksel swarming tahliller veya toplu stres tepkisi tahlilleri) (Şekil 1), (3) zaman atlamalı görüntüleri elde, ve (4) görüntüleri derlemek ve analiz etmek için ImageJ kullanın.
Kısaca, P. aeruginosa bir gecede kültürden bir sürü agar plaka ortasında tespit edilirken P. aeruginosa faj ile enfekte veya antibiyotik ile tedavi uydu pozisyonlarında tespit edilir. P. aeruginosa sürüsünün ilerlemesi, nem le ilgili 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir tüketici belgesi nde yassı bir tarayıcıda izlenir. Tarayıcı, genellikle 16-20 saat boyunca, düzenli aralıklarla plakaları tarayan bir yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yöntem, altı 10 cm'ye kadar sürühalinde eşzamanlı zaman atlamalı videolar verir. Görüntüler filmlerhalinde derlenir ve sürülerin strese bağlı popülasyonlar tarafından itilmesi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Farklı sürü deneyleri arasında tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için özel önem verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. P. aeruginosa Swarming Time-lapse Görüntüleme için Swarming Agar Plakaları Hazırlanması
- 500 mL çift distile suya 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4ve 2,5 g NaCl ekleyerek cam2şişede 5x M8 minimum ortam 1 L hazırlayın. Sıvı ortamı oda sıcaklığında sterilize etmek ve depolamak için son hacmi ilave ddH2O. Otoklav ile 1 L'ye ayarlayın.
- 50 mL ddH'da 24,6 g MgSO4•7H2O ekleyerek cam şişeye 100 mL21 MMg MgSO4 (magnezyum sülfat)2hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- 50 mLddH2 O. Sterilize etmek için ek ddH2O. Otoklav ile son hacmi 100 mL'ye ayarlayarak cam şişede %20 casamino asitlerin 100 mL'sini hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
- 50 mL ddH2O'na 20 gr glikoz ekleyerek cam şişede %20 glikozun 100 mL'sini hazırlayın.2 Oda sıcaklığında saklayın.
- 10 swarming agar plakası yapmak için 100 mL ddH2O'ya 1 g agar ekleyin ve 250 mL Erlenmeyer şişesinde ek ddH2O ile son hacmi 160 mL'ye ayarlayın. Otoklavlama ile sterilize edin.
- Otoklavlamadan hemen sonra, agar çözeltisini 15 dakika boyunca 55 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Agar çözeltisini su banyosundan çıkarın ve 40 mL 5x M8 minimum ortam, 200 μL 1 M MgSO4,2 mL %20 glikoz ve 5 mL %20 casamino asit15. Karıştırmadan hemen sonra adım 1.6'ya geçin.
NOT: Son konsantrasyonlar %0.5 agar, 1 mM MgSO4, %0.2 glikoz ve %0.5 casamino asitlerdir.
- Tutarlı hacim için 25 mL pipet kullanarak, 10 cm çapındaki Petri kabı başına 20 mL'lik sürü halindeki agar çözeltisini ekleyin.
NOT: Hacim agarın kuruma süresini ve nem içeriğini etkilediği için agar çözeltisinin sabit hacmi önemlidir. Swarming agar plakaları yaparken kabarcıklar kaçının. - Oda sıcaklığında tezgah üzerinde 1 saat kapakları ile tek bir yığın halinde swarming agar plakaları yerleştirerek agar katılaşmak için izin verin. Bir sonraki adımdan önce odanın bağıl nemini %40-50 1 saate düşürmek için nem gidericisini açın.
- Oda sıcaklığında % 40-50 bağıl nem ile 300 ft3/dk bir laminar akış kaputunda kapakları kapalı ek bir 30 dakika için swarming agar plakaları kuru. Laminar akış kaputuna yüz koyarak kapakların iç kuru. 4 °C'de 24 saate kadar agar plakalarını saklayın.
- Siyah 10 cm Petri çanak kapakları zımpara kağıdı ile kapağın içini yumuşatarak görüntüleme için hazırlayın. Kapakları bir ambalaj kutusunun içine koyun ve ambalaj kutusunu kimyasal bir kaputun altına yerleştirin. Siyah sprey boya kullanarak kapakların içine püskürtün. Kapakların kurumasını bekleyin.
NOT: Siyah kapaklar ek denemeler için yeniden kullanılabilir. Kapakların tarama sırasında ışığı yansıtmaması için boyanması önemlidir.
2. P. aeruginosa ve Kaplama Koşullarıbüyüme
- 400 mL ddH2O'na 10 g LB-Miller toz karışımı ekleyerek 400 mL lysogeny suyu (LB) hazırlayın. % 2 LB-agar Petri yemekleri için, agar ek 8 g ekleyin. Otoklav sterilize etmek.
- 10 cm çapında Petri yemekleri içine erimiş LB-agar orta 20 mL dökün ve onları bir gecede oda sıcaklığında katılaşmak için izin. Sıvı ortamı oda sıcaklığında ve agar plakalarını 4 °C'de saklayın.
- -80 °C'de steril halkalar veya ahşap çubuklar kullanılarak saklanan dondurulmuş bir stoktan LB-agar Petri kabında Seri P. aeruginosa. Petri kabını bir gecede baş aşağı 37 °C'de kuluçkaya yatırın. LB-agar plakasını 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Petri kabından steril bir döngü veya tahta çubukla tek bir koloni seçin, 2 mL LB ortama aşılayın ve kültürü bir gecede doygunluğa (16-18 saat) 37 °C'de 100 rpm'de silindir tambur setinde kuluçkaya yatırın.
- Pipet 5 μL adım 2.4 bir P20 pipet ve nokta kullanarak bir p20 pipet ve nokta bir açıyla pipet ucu yaklaşarak (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı üzerinde, ilk durağıaşağı borulama ve sadece sıvı damla ile agar dokunmadan(Şekil 1B).
- Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Farklı sürü halindeki agar plakaları arasında sürekli olarak spot konumlandırmak için bir şablon kullanın (Ek Şekil S1).
- Geleneksel sürü tahlilleri için yalnızca orta noktayı kullanın ve adım 2.8'e atlayın. Kolektif stres yanıtı tahlilleri için adım 2.6 (faj enfeksiyonu için) veya adım 2.7 (antibiyotik stres için) devam edin.
- Faj enfeksiyonu için, p. aeruginosa'nın gecelik kültürünün 30 μL'sini adım 2.4'ten 6 μL 1 x 1012 pfu/mL faj DMS3vir20ile karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
- Pipet 6 μL P. aeruginosa-faj karışımı adım 2.6 bir P20 pipet ve nokta kullanarak 6 eşit uzaklıkta uydu pozisyonları nda 2.8 cm yarıçaplı konsantrik daire bir açıyla boru ucu yaklaşarak Petri çanak merkezli (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı nın üzerinde, ilk durağıaşağı borulama ve sadece sıvı damla ile agar dokunmadan (Şekil 1C).
- Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Tutarlılık için kaplama şablonu kullanın (Ek Şekil S1). Adım 2.8'e geçin.
- Antibiyotik tedavileri için, 30 μL gecelik kültür P. aeruginosa adım 2.4 ile 6 μL 3 mg /mL gentamisin, 100 mg/mL kanamisin veya 7.5 μL 100 mg/mL fosfomycin'i karıştırın. Hemen bir sonraki adıma geçin.
- Pipet 6 μL antibiyotik tedavi P. aeruginosa adım 2.7 bir P20 pipet ve nokta kullanarak 6 eşit uzaklıkta uydu pozisyonları nda 2.8 cm yarıçapı konsantrik daire üzerinde çanak merkezi hakkında pipet ucu yaklaşarak (10-45 °) 2.5 cm tespit alanı üzerinde pipet ucu, ilk durağı aşağı borulama ve sadece damla sıvı ile agar dokunmadan (DŞekil).
- Agar zarar olarak boru ucu ile agar dokunmaktan kaçının. Tutarlılık için kaplama şablonu kullanın (Ek Şekil S1). Adım 2.8'e geçin.
- Açık Petri kabı kapaklarını 1.9 basamaklı siyah kapaklarladeğiştirin (Şekil 2A).
- Nemi %75'te tutmak için 37 °C'de 10 L su banyosu ile 37 °C'de bir kuvözde bulunan bir tarayıcıya sürühalindeki agar plakalarını yerleştirin(Şekil 1E, Şekil 2B).
DİkKAT: Sürühalindeki agar plakaları üzerindeki benekli hücreleri rahatsız etmeyin. Plakaları her zaman yukarı yaslayın.
3. Tarayıcı ile Görüntü Edinme
- Düz yataklı belge tarayıcısının 40-60 cm yukarısına siyah mat kumaş takarak Petri yemeklerinin ortam aydınlatmasını azaltın. Fermuar bağları kullanarak emniyete alalar (Şekil 2B).
- Tarayıcı bir tarama yazılımı ve otomatik komut dosyası yazılımı kullanılarak kontrol edilecektir.
- Tarama yazılımında, Ana Sayfa Modu 'nu(Şekil 3A)seçin. Görüntü Türüaltında Renk'i seçerek renkli görüntüler yakalayın. Görüntü kalitesini ayarlamak için Hedef Altındaki Diğer'i seçin ve Çözünürlüğü 300 dpi'ye ayarlayın. Hedef Boyutuiçin Orijinal'i seçerek görüntüler için standart boyutu koruyun. Standart görüntü kalitesi için tüm seçenekleri Görüntü Ayarlamaları altında işaretsiz bırakın.
NOT: Hedef Boyutu varsayılan olarak Orijinal olarak ayarlanır. Hedef Boyutu için diğer seçenekleri seçmek için önce Önizleme'yi tıklatın.
- Tarama yazılımında, Ana Sayfa Modu 'nu(Şekil 3A)seçin. Görüntü Türüaltında Renk'i seçerek renkli görüntüler yakalayın. Görüntü kalitesini ayarlamak için Hedef Altındaki Diğer'i seçin ve Çözünürlüğü 300 dpi'ye ayarlayın. Hedef Boyutuiçin Orijinal'i seçerek görüntüler için standart boyutu koruyun. Standart görüntü kalitesi için tüm seçenekleri Görüntü Ayarlamaları altında işaretsiz bırakın.
- Dosya Kaydet Ayarlarını(Şekil 3A)açmak için Scan'ın sağındaki klasör simgesine tıklayarak görüntülerin kaydetme yolunu ayarlayın.
- Konum altında Diğer'i seçerek görüntüleri kaydetmek için klasör hedefini seçin ve Gözat'atıklayın. Görüntüleri kaydetmek için bir klasör seçin.
- Önek metin kutusundaki görüntüleri adlandırın. Görüntüler için sıralama sırasına başlamak için Başlangıç Numarası 001'i ayarlayın. Resim Biçimi altında Yaz için JPEG (*.jpg) seçerek dosya biçimini JPEG'e ayarlayın ve Ayrıntılariçin ayarlamak için Seçenekler'e tıklayın. Sıkıştırma Düzeyini 16'ya, Kodlamayı Standart'a ayarlayarak görüntü biçimi kalitesini ayarlayın ve Embed ICC Profilini denetleyin. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın (Şekil 3B).
- İlk seçeneği işaretsiz bırakın ("Aynı ada sahip dosyaların üzerine yazılsın") ve sonraki 3 seçeneği işaretleyin ("Bir sonraki taramadan önce bu iletişim kutusunu göster", "Taramadan sonra resim klasörünü aç", ve "Taramadan sonra Sayfa Ekle iletişim kutusunu göster"). Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın
- Önizleme'ye tıklayarak görüntü kalitesini kontrol edin. Önizleme penceresi görüntülenir ve Tsk simgesi işlevsel hale gelir (Şekil 3C).
- Görüntü edinimi otomatikleştirmek için komut dosyası yazılımını kullanın. Sağlanan komut dosyası, 30 dakika aralıklarla Dosya Kaydet Ayarları penceresinde Tsam penceresinde Scan'a ve Tamam'a tıklar.
- Görev'e tıklayarak komut dosyasını alma | hem Single_scan.tsk hem de Idle_scanning.tsk'yı (EK Dosya 1 ve 2olarak sağlanan TSK dosyaları) içe aktarın ve seçin. Bkz. Şekil 3D.
NOT: Single_scan.tsk, Scan penceresindeki Tbm'yi tarayıp Dosya Yı Kaydet penceresinde tamam düğmesine tıklar. Idle_scanning.tsk aktivSingle_scan.tsk her 30 dk. Bir Idle_scanning.tskaktivasyon değiştirerek tbmkasyon frekansı değiştirebilirsiniz. - Hem Boşta tarama (içe aktarılan) hem de Tek tarama (içe aktarılan)seçeneğini seçerek 30 dk aralıklarla otomatik taramayı etkinleştirin , Boşta tarama (içe aktarılan)sağ tıklayarak ve Etkin'e soltıklayarak (Şekil 3D, Ek Şekil S2).
NOT: Otomatik tarama, kullanıcı komut dosyasını el ile durdurana kadar çalışır. Komut dosyasını durdurmak için Boşta tarama (içe aktarılan) seçeneğini, Boşta tarama (içe aktarılan) seçeneğinisağ tıklatın ve Etkin'esol tıklatın. Onay işareti kaldırılır.
- Görev'e tıklayarak komut dosyasını alma | hem Single_scan.tsk hem de Idle_scanning.tsk'yı (EK Dosya 1 ve 2olarak sağlanan TSK dosyaları) içe aktarın ve seçin. Bkz. Şekil 3D.
4. Hızlandırılmış Görüntülerin Derlenmesine ve Sürü Repulsion'un Ölçülmesi
- ImageJ'i kullanarak film düzenleme ve görüntü analizi gerçekleştirin.
- Tüm taranmış görüntüleri Dosya'ya tıklayarak ImageJ'e aktarın | İthalat | Görüntü Sırası ve görüntüleri seçin. Sıra Seçenekleri penceresinde, görüntüleri renkli tutmak için RGB'ye Dönüştür'ü işaretleyin. Görüntü sayısı, seçilen görüntü sayısını gösterir.
- Özgün boyutu korumak için klasördeki ilk resimden başlamak için görüntüyü 1'de başlatın ve görüntüleri %100 ölçekleyin. Sanal yığını işaretlenmemiş olarak kullanın. Tamam'ı tıklatın ve resimlerin yüklenmesini bekleyin (Şekil 4A).
- Video sıkıştırma düzeyini Düzenleme 'ye tıklayarak 100'e ayarlama | Seçenekler | Giriş/Çıkış... ve JPEG kalitesini 100'e ayarlayın.
- Dosyayı .avi olarak dosyaya tıklayarak kaydet | Olarak Kaydet | AVI. Sıkıştırmayı JPEG'e ve Kare Hızı'nı 5 fps'ye ayarlayın(Şekil 4B). .avi zaman atlamasını istenilen klasöre kaydedin.
- Sürü itme mesafelerini ölçmek için ImageJ'deki sürü döneminin sonuna doğru bir görüntü açın. Dosyaya Tıklayın | Görüntüyü açın ve seçin. Analiz et ' e tıklayarak ölçeği ayarlama | Ölçek ve ayar Mesafeyi piksellerde 118' e, Bilinen uzaklığı 1'e, Piksel en boy oranını 1,0'a ve uzunluk birimini cm'ye ayarla (Şekil 4C). Global'i kontrolsüz bırakın. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın.
- Düz simgesine tıklayın ve uydu konumundaki koloninin merkezinden kalabalık nüfusun kenarına kadar ölçün. Analiz'i Seçin | Ölçümlerle yeni bir pencere nin görünmesini sağlamak için ölçün (Uzunluk) (Şekil 4D).
NOT: Yakınlaştırmak için "+" ve uzaklaştırmak için "-" kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
P. aeruginosabüyümek için adımlar, hücreleri stres, ve görüntü swarming agar plakaları Şekil 1temsil edilmektedir. Biz 37 ° c gecede LB suyu 2 mL bir LB-agar plaka bir LB-agar plaka vahşi tip P. aeruginosa UCBPP-PA14 suşu tek bir koloni aşılanmış ve swarming agar plaka merkezinde 5 μL tespit. Bu plakanın hızlandırılmış görüntüleme merkezinde bir koloni şeklinde ilk büyüme ortaya koymaktadır ve daha sonra koloniden radyal tendrils yayılıyor(Video 1). Kolektif stres tepkisi tahlilleri için, merkezde P. aeruginosa tespit ek olarak, aynı gecede kültürün 30 μL 6 μL ile karıştırılır 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir veya 6 μL 3 mg/mL gentamisin 5:1 ve 6 μL oranında uydu pozisyonlarında tespit edilir. Sürüler, sürüler agar plakalarının merkezinden çevreye doğru hareket eder ve fajlarla enfekte olmuş bakteriler tarafından yayılan bir stres sinyali ile püskürtülürler(Video 2, sol üst tabaka üstü) veya gentamisin ile tedavi edilirler (Video 2, sağ üst plaka). Fajlar(Video 2, sol alt plaka) veya gentamisin(Video 2, sağ alt plaka) uydu pozisyonlarında tek başına tespit edilen bu alanlardan kaçınmak için kalabalık popülasyonlara neden olmaz.
Şekil 1: P. aeruginosa sürü swarming tsay ve kolektif stres tepkisi şeması. (A) P. aeruginosa hücreleri bir gecede (16-18 h'den Yaklaşık 1,5'te OD600'e kadar) LB suyunda 37 °C'de ve(B)swarming agar plakasının ortasında tespit edilir. Gece kültürleri ile karıştırılır (C) fajlar veya (D) antibiyotikler ve toplu stres yanıtı tahlilleri için uydu pozisyonlarında tespit. (E) 37 °C'de 16-18 saat boyunca 30 dk aralıklarla tarayıcıda 6 plakaya kadar görüntülenir. 18 saat sonra, P. aeruginosa sürülü popülasyonlar kaçınmak (F) faj ile enfekte hücreleri veya (G) hücreleri antibiyotik ile tedavi (gentamycin). (H) P. aeruginosa popülasyonları sürü halinde ki agar plakası üzerinde akın eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kuluçka makinesinin içindeki tarayıcı kurulumu. (A) Bölüm 1'de inşa edilmiş siyah Petri kabı kapakları. Bu kapaklar, ışık yansımalarını azaltmak ve şeffaf Petri kabı kapaklarının yerine tarama sırasında kullanılır. (B) Düz yataklı belge tarayıcısı 37 °C'de bir kuluçka setine yerleştirilir. Tarayıcıya siyah kapaklı altı plaka yerleştirilir (sol daki resim). Siyah mat kumaş daha fazla yansımaları ve başıboş ışık (sağ görüntü) azaltmak için tarayıcı üzerinde 60 cm rafa takılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tarama ve otomatik komut dosyası yazılımı kullanarak flatbed belge tarayıcısından otomatik görüntü edinimi. (A) Ana Scan penceresinin ekran görüntüsü. Görüntü türü (Renk) ve Çözünürlük seçimi (300 dpi). Kırmızı kare, Dosya Kaydet Ayarları penceresini açmak için klasör simgesini gösterir. Önizleme düğmesine basılabilir, ancak Tscan düğmesine basın. (B) Görüntüleri kaydetmek, görüntüleri adlandırmak ve görüntülerin biçimini seçmek (solda) için klasör hedefini ayarlamak için Dosya Kaydet Ayarları penceresinin ekran görüntüsü. Eklenti Ayarları penceresi görüntü biçimi kalitesini ayarlamak için kullanılır (sağda). ( C )Önizleme'yetıkladıktan sonra Tscan penceresinin ekran görüntüsü. Önizleme alındıktan sonra Tbmb'in titreme düğmesi tıklanabilir. Program artık komut dosyası yazılımı (Materials) kullanılarak otomatikleştirilebilmiştir. (D) Otomasyon komut dosyalarını almak için kullanılan Alma düğmesini gösteren komut dosyası yazılım pencerelerinin ekran görüntüsü (solda). Single_scan.tsk ve Idle_scanning.tsk alındıktan sonra, bunlar ana pencerede (sağda) görev olarak görünür. Her iki görevi de seçtikten ve sağ tıklattıktan sonra Etkin düğmesi görüntülenir. Sol tıklatma Etkinleştir komut dosyalarını 30 dk aralıklarla (sağda) otomatik olarak tarıyorum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ImageJ kullanarak sürü kaçınma görüntü analizi. (A) Hızlandırılmış tarayıcı görüntülerinden görüntü dizisini alma adımları. Dosyaya Tıklayarak | İthalat | Ana ImageJ penceresindeki Görüntü Sırası (solda) Sıra Seçenekleri penceresini (sağda) getirir ve taranmış tüm görüntüleri açar. Kırmızı kare, görüntüleri RGB biçiminde yüklemek için işaretlenen seçeneği gösterir. Diğer tüm seçenekler varsayılan olarak bırakılır. (B) Hızlandırılmış videoyu AVI formatında kaydetme adımları. Dosya Seçme | Olarak Kaydet | AVI, Save'i AVI penceresi olarak getiriyor. Sıkıştırma JPEG ve Kare Hızı 5 fps olarak ayarlanır. (C) Görüntüler için ölçek birimlerinin ayarlanması. Analiz'i Seçme | Ölçek'i Ayarla penceresini getirin. 300 dpi görüntü için uygun ölçek 118 piksel/cm.(D) Kalabalık popülasyonlardan kaçınma ölçümüdür. Sarı bir çizgi tendrils kenarına stresli kolonilerin merkezinden çizilir. Analiz'i Seçme | Ölçü, Sonuçlar etiketli yeni bir pencerede satırın uzunluğunu bildirir. Ctrl + M, menü öğelerini seçmeden ölçümü gerçekleştiren bir klavye kısayoludur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: P. aeruginosatemsilcisi sürüleri . P. aeruginosa swarming popülasyonlar üzerinde (A) kuru, (B) normal, (C) nemli, ve (D) ekstra nemli. Kuru sürü agar plakaları P. aeruginosa sürü oranını inhibe ve tendrils sayısını azaltmak. Nemli swarming agar plakaları büyük tendrils oluşumuna neden olur. Ekstra nemli koşullar altında, tendrils swarming agar plakaları boyunca düzensiz form. Laminar akış kaputunda ve ortam nemindeki kuruma süreleri, swarming plaka nem içeriği üzerinde önemli etkilere sahiptir. Tabaklar 10 cm Petri yemekleri dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Sürü hızlandırılmış film. Yabani tip P. aeruginosa swarming plakanın merkezinde tespit edildi ve 22 saat boyunca tarayıcı üzerinde görüntülendi. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: Kolektif stres tepkisinin hızlandırılmış filmi. Yabani tip P. aeruginosa swarming plakanın merkezinde tespit edildi. Uydu konumları ayrıca (üst-sol) faj veya (sağ üst) gentamisin ile karıştırılan P. aeruginosa ile tespit edildi veya sadece (alt-sol) faj veya (sağ alt) gentamisin ile tespit edildi. Beyaz noktalar lekelerin merkezini gösterir. Plakalar 16 saat boyunca görüntülendi. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Ek Şekil S1: P. aeruginosa hücrelerini tespit etmek için kaplama şablonu. Orta siyah nokta 5 μL gecede P. aeruginosa kültürünün tespit alanını temsil eder. İç dairenin yarıçapı plakanın merkezinden 2,8 cm uzaklıktadır. İç daire ve dış daire boyunca düz çizgiler arasındaki kesişme stresli P. aeruginosa6 μL tespit alanı gösterir , faj enfekte veya antibiyotik tedavi hücreleri. Dış daire 10 cm Petri kabının çevresini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Komut dosyası yazılımı kullanarak düzenli olarak tarama yapmaya başlamak için makro komutları. (A) Single_scan.tsk'daki makro komutları imleci Tarama penceresinde Tarama penceresine taşır, Tarama'yı tıklatir, Dosya Kaydet Ayarları penceresinde Tamam'a taşınır ve Tamam'a tıklar. (B) 30 dk aralıklarla tarası yapılmasını emreder. Görev Idle_scanning.tsk Single_scan.tsk başlar ve 30 dk aralıklarla etkinleştirmek için ayarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, agar plakaları sürühalindeki değişkenliği en aza indirmeye ve P. aeruginosa swarming ve strese yanıt veren hızlandırılmış görüntüleri elde etmek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem sağlamaya odaklanır. Bu prosedür, ortam kompozisyonu ve büyüme koşulları uyarlayarak görüntü diğer bakteri sistemleri uzatılabilir. P. aeruginosaiçin , Her ne kadar M9 veya FAB minimal orta sürücünü ikna etmek için kullanılabilir16,21, burada sunulan protokol casamino asitler ile M8 orta kullanır, glikoz, ve magnezyum sülfat6. P. aeruginosa sürüsi, demir bulunabilirliği ve amino asitler22,,23, 24,24gibi besin kaynakları gibi orta bileşimlere duyarlıdır. Bu nedenle, agar plakaları swarming için medya seçimi swarming hareketlilik atayarak önemli bir yönünü göstermektedir.
Açık bir laboratuvar alanında nem ve sıcaklık kontrolü sürü tahlillerinin tutarlılığı için en büyük zorluklardan birini temsil eder. Mevsimsel değişiklikler, sürü halindeki agar plakaları nemdeki değişkenliğe katkıda bulunur ve bu da sürü desenlerini önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, en uygun plaka kalitesini sağlamak için bağıl nemin sürekli kontrolü gereklidir. Laminar akış kaputunun altındaki sürü halindeki agar plakalarını kurutmadan 1 saat önce nem gidericinin başlatılması bağıl nemi %45'e kadar kontrol ederek kuruma süresini 30 dakikaya kadar tutacaktır. Ortam nemi kontrol edilemiyorsa, kuruma süresini artırmak nemli ortamları telafi etmek için potansiyel basit bir çözümdür. Sürü sırasında, agar plakalarının kurumasını önlemek için bağıl nem 37 °C kuluçka makinesinde %70'te kalmalıdır. Kuvözdeki kapaksız bir su kutusu su deposu olarak hizmet verebilir. Kuru swarming agar plakaları, kalabalık popülasyonların ilerlemesini yavaşlatır ve nemli plakalar geniş tendril yapısına neden olurken tendrilsayısını azaltır(Şekil 5A–C). Ekstra nemli swarming agar plakaları açık tendril oluşumunu önlemek ve dalları düzensiz bir desen(Şekil 5D)yayılmasına neden olur. Burada açıklanan yöntem plakalar üzerinde sürü tutarlılığı sağlayacak sürekli nemli bir ortam korumak için kullanılabilir(Şekil 5B, Video 1). Ayrıca, plaka boyutu ve agar kalınlığı plaka nem istinat bir rol oynamaktadır. Biz 10 cm çapında Petri yemekleri kullandık ve tutarlılık sağlamak için plaka başına 20 mL swarming agar çözeltisi ekledik. Hacimleri ölçmeden plaka dökülmesi önerilmez. Sürü testini etkileyen birçok değişken nedeniyle, titreyi yerel laboratuvar koşullarına optimize etmeyi öneriyoruz ve tutarlı ve karşılaştırılabilir sürü desenlerini gözlemlemek için ayrı plaka lar üzerinde birden fazla biyolojik kopya gerçekleştirmenin önemini vurguluyoruz.
Zaman atlamalı görüntüleme yönteminin swarming hareketliliği kaydetmenin avantajı, sürüleri rahatsız etmeye gerek kalmadan hareketliliğin ilerlemesini gözlemleyebilme yeteneğidir. Yöntemimiz, aynı anda aynı koşullar altında 6 plakanın zaman atlamalarını oluşturur ve bu da birden fazla suşun, çoklu deneysel koşulların veya biyolojik kopyaların eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için hem kontrollü bir ortam sağlar. Her plaka üzerinde altı uydu pozisyonunun kullanılması ayrıca istatistiksel analizi kolaylaştırır ve ImageJ kullanımı sürühalinde ki repulsion'un sayısallaştırılmasını sağlar.
Burada açıklanan prosedür P. aeruginosaalt popülasyonları arasındaki etkileşimi incelemek için basit bir yöntemdir: sağlıklı bir kalabalık nüfus ve stresli hücreler. DMS3vir ve gentamisin ötesinde, fajlar ek türleri, antibiyotikler, ve rakip bakteri veya mantarlar stres sinyal çalışması için kullanılabilir. Bu yöntem P. aeruginosa swarming hareketliliği üzerinde duruluyor olsa da, S. aureus ve E. coli gibi diğer bakteri türleri de swarming desenleri sergiler, ancak10,11. Ortam bileşimlerini ve plaka koşullarını optimize ederek, bu yöntem sürü, bakteriyel suşlar arasındaki swarming etkileşimleri ve stres tepkilerini analiz etmek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., ve N.M.H-K. taslağı yazdı ve gözden geçirdi. Deneyleri tüm yazarlar tasarladı. J.-L.B. deneyleri ve analizleri yaptı. Bu çalışma NIH ödülü K22AI112816 ve R21AI139968 a.s. ve University of California tarafından desteklenmiştir. N.M.H-K. Lundbeck Bursları R220-2016-860 ve R251-2017-1070 tarafından desteklenmiştir. Fon, eserin yayına sunulması kararında hiçbir rol sahip değillerdi. Beyan etmek için rekabet eden bir çıkarımız yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
