Summary
果蝇是一种广泛使用的实验模型,适用于筛选具有癌症治疗潜在应用的药物。在这里,我们描述了使用果蝇变眼色表型作为筛选小分子化合物,促进异构素形成的方法。
Abstract
果蝇是一种极好的模型有机体,可用于筛选可能对癌症治疗有用的化合物。这里描述的方法是一种具有成本效益的体内方法,通过使用果蝇来识别异血素促进化合物。果蝇的DX1菌株,具有一种品种化的眼睛颜色表型,反映异色素形成的程度,从而提供一个工具,促进异种素促进药物筛选。在筛选方法中,根据占据眼睛部分的红色色素沉着的表面面积对眼睛的变异进行量化,以1至5的刻度进行评分。筛选方法简单明了,允许在体内测试化合物。使用这种方法进行药物筛选为识别异色素促进药物提供了一种快速而廉价的方法,这些药物可能对癌症治疗产生有益的影响。确定促进异构素形成的化合物也可能导致癌症发育的表观遗传机制的发现。
Introduction
异色素罗马丁是一种浓缩的DNA形式,在基因表达、调节细胞分裂期间的染色体分离以及防止基因组不稳定1中起核心作用。异色素素被认为是一种基因抑制调节剂,在细胞线粒度22,33期间保护染色体完整性。它与系系承诺,4、5期间组蛋白H3Lysine 9(H3K9me)的二甲基化有关。4此外,使用异色素1(HP1)色域蛋白也被认为与异质素和基因表达表观遗传抑制有关6。这些蛋白质是异色素形成的基本成分和标记物。
由于基因组不稳定使细胞获得促进致癌的基因改变,异色素素在癌症开发中越来越被识别,并可能成为癌症治疗的目标77,8。8目前,没有一种药物在协助异色素形成方面得到证实。在这里,我们提出了一种简单而快速而有效的方法来筛选促进异构素形成的小分子化合物。筛查是通过用小分子药物库治疗果蝇来完成的。此方法利用受异质色素水平影响的DX1果蝇菌株中多变的眼睛颜色表型。DX1苍蝇包含七个P_lac-w]转基因的串联阵列,这些基因具有根据异质化的变异表达/抑郁,因此,眼睛颜色的变异程度反映了异色素水平。具体来说,增加异质素可以通过变色眼色(白眼)的比例上升来检测。相反,减少异构素将被P[lac-w]转基因表达(红眼)9、10、11、1210,11,12的比例上升所检测9。
因此,我们利用这种多嗜血细胞系统,产生一种变幻的眼部颜色表型,因为它的表达与目前异质素的量直接相关。一旦发现怀疑促进异构素形成的化合物,我们可以用其他方法,如西方斑点来证实这种怀疑。这些促进异种素的物质将来可以进一步开发,供患者进行临床试验。
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Protocol
1. 药物库准备
- 识别并准备药物库,在所需浓度(例如DMSO中为10 mM)使用适当的溶剂进行筛选。
注:药物库的一个具体示例是国家癌症研究所 (NCI) 发育治疗计划 (DTP) 的肿瘤集 III。在两个96孔PP U底板中,100%DMSO中的化合物在1000%DMSO中作为20μL提供,并储存在-20°C。NCI 板地图和每种药物的基本化学数据可在以下网站上找到:
NCI 板号 4740
NCI 板号 4741
2. 使用果蝇促进药物的异种色素促进药物的筛选
-
德罗索菲拉育种策略 (图 1A)
- 第1天:交叉三w1118/Y;DX1/CyO雄性苍蝇和三只或更多处女w1118母苍蝇在 25 毫米 x 95 毫米食品小瓶与 9 mL 的标准果蝇食品介质 (布卢明顿食谱).为每个药物设置三个复制小瓶,为屏幕设置一个控制。
注:DX1苍蝇由詹姆斯·伯克勒(密苏里大学)提供,9,13。 - 第2天和第3天:允许苍蝇在室温下产卵2天(22°C)。
- 第4天:使用短时间的CO2气体麻醉母蝇,并在"苍蝇停尸房"(含有70%酒精的瓶子)中处理母蝇。
- 第1天:交叉三w1118/Y;DX1/CyO雄性苍蝇和三只或更多处女w1118母苍蝇在 25 毫米 x 95 毫米食品小瓶与 9 mL 的标准果蝇食品介质 (布卢明顿食谱).为每个药物设置三个复制小瓶,为屏幕设置一个控制。
- 向果蝇喂食药物进行筛查。
- 将每种药物化合物从原始库存(在 96 孔 PP U 底板中 100% DMSO 中的 10mM 时 20 μL)稀释为 10 μM 最终浓度,水中 33% DMSO。在水中使用 33% 的 DMSO,无需任何药物作为控制。
注:有些药物在水中溶解不良,溶解在DMSO中。100% DMSO 对苍蝇有毒。33% 是可以容忍的。 - 第4天:移液器60μL的10μM药物溶液或控制到苍蝇食品的顶部。此时,确保母蝇已被移除,并且食物上有飞蛋和爬行的第一颗星幼虫。
- 第6天:重复移液60μL的相同10μM药物溶液的食物小瓶。
注:由于药物被添加到苍蝇食物中,表层食物含有近10μM浓度,底部食物不能完全渗透。所有的苍蝇在食物顶部产卵,吃表面的食物。
- 将每种药物化合物从原始库存(在 96 孔 PP U 底板中 100% DMSO 中的 10mM 时 20 μL)稀释为 10 μM 最终浓度,水中 33% DMSO。在水中使用 33% 的 DMSO,无需任何药物作为控制。
- 观察和评分眼睛颜色的变化。
- F1苍蝇出现两天后(大约在第14天),检查苍蝇。使用短时间的 CO2来麻醉 F1 苍蝇,并将苍蝇从小瓶中取出到多孔解剖垫上,CO2从滤纸下方吸穿。
- 在解剖显微镜下检查此垫上的苍蝇。检查整个苍蝇,识别所有w1118/Y;DX1/+异种雄性,他们缺乏CyO占主导地位的卷曲翼表型。
- 评分每个w1118/Y 的眼睛颜色;DX1/+异质雄蝇的尺度为1至5(图1B)。白眼颜色的百分比评分如下:
1. <5% 红色散射眼总表面积
2. 6% - 25% 红斑眼睛总表面积
3. 26% - 50% 红斑眼睛总表面积
4. 51% - 75% 红斑眼睛总表面积
5. >75% 红斑眼睛总表面积
注:或者,将飞头均匀地用于 100% 甲醇,并使用光谱仪测量 OD 450 nm 处的眼睛色素沉着。只选择男性,因为 PEV 在 DX1 男性中更代词。得分超过10名男性在每个小瓶。 - 计算每个小瓶评分的所有男性的平均颜色指数。对每种化合物执行三联(图1C)。
注:由于眼睛颜色随年龄而变化,这是一个时间敏感的步骤。眼睛的颜色应在同一年龄 = 2 天大时计算。通常 >10 苍蝇应在每个小瓶中得分。 - 为了证实这些化合物确实促进异构素的形成,使用不同的技术,如西方印迹来验证(图1G)。
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Representative Results
该协议成功地用于筛选促进异构素在果蝇形成的化合物,这是一个高效和低成本的体内药物开发系统(图1)。我们筛选了一个小分子药物库,肿瘤集III,这是由97FDA授权肿瘤药物组成,使用DX1菌株的果蝇黑色素气酸(图1B)。一种重要药物的结果在条形图中(图1C,D)中表示。根据筛选测定,甲氨酰胺酸(4-氨基异乙酰谷氨基酸),在库中编码为E7,导致DX1菌株中变化最多,表明甲氨酰胺可能是未来癌症靶向治疗最有前途的异丙胺素促进药物(图1E,F)。为了进一步证实这确实是在测试促进异构素形成的化合物,西方印布数据显示,异丙胺素形成相关蛋白H3K9me3是向上调节(图1G),进一步验证甲氨酰胺可能是最有前途的异丙胺素促进药物。
图1:果蝇药物筛查的例证。(A)果蝇屏幕方法论。使用果蝇模型进行异种素促进化合物筛选方案概述。三w1118/Y;DX1/CyO雄性和三个处女w1118在室温下交叉。然后,在第四天去除成年苍蝇,并在第四天和第六天分别在苍蝇食物顶部加入溶解在33%DMSO溶液中的10μM药物的60μL。33% DMSO 解决方案用作控制。观察到F1男性一代的眼色(白色与红色)比例。(B) 眼睛颜色表型分析和评分。具有代表性的眼色图像,显示可变现象型。变色率为: 1,1-5% 红斑在总表面积;2、6-25%的红点在总表面积;3、总表面积26-50%的红点;4、51-75%的红点在总表面积;和 5,>75% 的红点在总表面积。(刻度条 = 200 μm)(C) 每种药物被测定为三个独立实验的平均值 =s.d.(标准差)。红色条形显示控件。(D) 药物 E7 和控制中执行的量表结果。如果学生t-Test的P值为<0.05(*),则E7和对照组之间的差异被认为是显著的。(F) E7 中飞眼的代表性图像和控制治疗组。(刻度杆,200 μm)(G) 西方斑点是使用H3K9me3、H3或β-Tubulin特有的抗体进行的,使用第3颗instar幼虫总蛋白,而不在指示浓度下进行甲氨蝶酯处理。这个数字是从洛约拉等人14号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
异色素罗马丁是一种浓缩的DNA形式,在调节基因表达中起着核心作用。它在癌症中越来越被认识,并可能成为癌症治疗的潜在目标15,16,17,18。15,16,17,18由于人体在制造、保存和代谢方面的优势,小分子化合物在药物开发中常有。为了识别促进异种素的小分子化合物,使用DX1果蝇菌株设计并提出了一种有效的方法,该菌株已被证明以依赖异种素的方式影响苍蝇的眼睛颜色(图1)。
我们的筛选协议是一种简单、廉价且易于遵循的体内药物开发系统。然而,筛选策略的一个局限性是确定有效的药物浓度。雌性果蝇在半固体苍蝇食物的表面产卵。对于药物治疗,我们将药物溶液移至食物表面,该溶液应含有预定浓度。然而,由于不同的药物在扩散到食物底部的效率可能不同,药物浓度不能保证在食物表面以下或向食物底部保持一致。在10μM浓度下,在我们筛选的库中用任何药物处理的幼虫很少观察到杀伤力。然而,大多数药物在100μM浓度下对幼虫造成严重杀伤力,这表明药物浓度也可以被视为屏幕的一个重要因素。
在这里,我们注意到串联重复,如这里使用的机制,在某些方面不同于在近心异色素。在胚胎和幼虫发育期间影响PEV的药物(此处描述的测试)将只识别影响体细胞中异激素维持的药物,并且不会识别影响异构素初始形成的药物,最有可能发生在爆炸期间(核循环10-14)。尽管如此,对于快速启动屏幕来说,这可能是一个有用的测定。
由于这种转基因簇(DX1) 对异质色素形成的敏感性,这种协议是可靠且具有成本效益的,这反映在眼睛中的红色色素沉着量中。此外,果蝇的寿命较短,使这种协议比其他模型生物(如斑马鱼或人类细胞)更有效。虽然斑马鱼中可能存在一个对异色素也一样敏感的报告基因系统,但它们的寿命比果蝇长得多,而且需要更长的时间才能获得结果。此外,使用人体细胞是不可能的,因为该协议专门侧重于使用表皮变化从表观遗传调控来确定异质素水平。因此,该协议提供了一种有效的体内方法,以确定哪些小药物分子可能作为抑制癌症治疗中肿瘤基因的候选药物。虽然与一些体外筛选方法相比,果蝇药物筛选方法是一种缓慢识别化合物的方法,但它相对敏感,使我们能够在体内测试化合物。结合细胞筛选方法,这是相对便宜,易于执行,吞吐量高,果蝇筛选方法也可以用来确认命中作为补充方法。
总之,为了确定用于进一步研究的化合物和针对癌症治疗的异色素素,尽管尚未完全理解发生这种情况的机制,但进行了一个简单的筛选,以确定异色素素促进药物。发现低浓度的药物可以促进异构素的形成可以提供更独特的治疗,可能导致减少副作用相比,现代化疗治疗。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
我们感谢J.伯克勒,E.巴赫和布卢明顿果蝇股票中心的各种果蝇菌株;国家癌症研究所(NCI)肿瘤集小分子药物库的发展治疗方案;UCSD本科生包括艾米·张、泰西克·你、杰西卡·辛格-班加、雷切尔·梅扎和亚历克斯·查韦斯。本出版物中报道的研究得到了美国胸腔学会对J.L.的研究资助和NIH的资助:R01GM131044到W.X.L.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
Methotrexate | NCI drug library | ||
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).