Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

En screeningmetode til identifikation af heterokratinfremmende stoffer ved hjælp af Drosophila

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

Drosophila er en udbredt eksperimentel model egnet til screening narkotika med potentielle ansøgninger om kræftbehandling. Her beskriver vi brugen af Drosophila brogede øjenfarvefænotyper som en metode til screening af små molekyleforbindelser, der fremmer heterochromatindannelse.

Abstract

Drosophila er en fremragende model organisme, der kan bruges til at screene forbindelser, der kan være nyttige for kræftbehandling. Den metode, der er beskrevet her, er en omkostningseffektiv in vivo-metode til at identificere heterochromatinfremmende forbindelser ved hjælp af Drosophila. Den Drosophila's DX1 stamme, der har en broget øjenfarve fænotype, der afspejler omfanget af heterochromatin dannelse, hvilket giver et værktøj til en heterochromatin-fremmende stof skærm. I denne screeningmetode kvantificeres øjenvariegationen baseret på overfladearealet af rød pigmentering, der besætter dele af øjet og scores på en skala fra 1 til 5. Screeningsmetoden er ligetil og følsom og giver mulighed for at teste forbindelser in vivo. Drug screening ved hjælp af denne metode giver en hurtig og billig måde at identificere heterochromatin-fremme lægemidler, der kunne have gavnlige virkninger i kræft terapeutiske. Identifikation af forbindelser, der fremmer dannelsen af heterochromatin kan også føre til opdagelsen af epigenetiske mekanismer for kræft udvikling.

Introduction

Heterochromatin er en kondenseret form for DNA, der spiller en central rolle i genekspression, i reguleringen kromosom adskillelse under celledeling, og i at beskytte mod genom ustabilitet1. Heterochromatin anses for at være en genundertrykkelsesregulator og for at beskytte kromosomintegriteten under cellemitose2,3. Det er forbundet med di- og tri-methylering af histon H3 lysin 9 (H3K9me) under afstamning engagement4,5. Desuden anses rekruttering af heterokratinprotein 1 (HP1) chromodomain proteiner også for at være forbundet med heterochromatin og epigenetisk undertrykkelse af genekspression6. Disse proteiner er væsentlige komponenter og markører for heterochromatin dannelse.

Da genomisk ustabilitet gør det muligt for celler at erhverve genetiske ændringer, der fremmer carcinogenese, heterochromatin bliver mere anerkendt i kræftudvikling og kan målrettes til kræftbehandling7,8. I øjeblikket er der ingen lægemidler, der er veletablerede i at bistå heterochromatin dannelse. Her præsenterer vi en enkel og hurtig, men effektiv metode til screening af små molekyleforbindelser, der fremmer heterochromatindannelse. Screeningen sker ved at behandle Drosophila med et bibliotek af små-molekyle medicin. Denne metode udnytter en broget øjenfarve fænotype i DX1Drosophila stamme, der er påvirket af heterochromatin niveauer. DX1 fluer indeholder en tandem vifte af syv P [lac-w] transgenes, som har den brogede udtryk / depression afhængigt af heterochromatinization, derfor omfanget af variegation i øjenfarven afspejler heterochromatin niveau. Specifikt, stigende heterochromatin kunne påvises ved den stigende andel af brogede øjenfarve (hvide øjne). Tværtimod vil faldende heterochromatin blive påvist ved den stigende andel af P[lac-w] transgene ekspressionen (røde øjne)9,10,11,12.

Derfor udnytter vi dette Drosophila transgene system, der producerer en broget øjenfarve fænotype, da dens udtryk er direkte korreleret med mængden af heterochromatin til stede. Ved opdagelsen af forbindelser, der mistænkes for at fremme heterochromatin dannelse, Vi kan bekræfte denne mistanke ved hjælp af andre metoder såsom vestlige blot. Disse heterochromatinfremmende stoffer kan videreudvikles til kliniske forsøg med patienter i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Drug bibliotek forberedelse

  1. Identificer og forbered et lægemiddelbibliotek, der skal screenes med passende opløsningsmiddel ved den ønskede koncentration (f.eks. 10 mM i DMSO).
    BEMÆRK: Et specifikt eksempel for et lægemiddel bibliotek er Onkologi Set III fra National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Forbindelser i dette sæt leveres som 20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i to 96-brønd PP U-bundplader og opbevares ved -20 °C. NCI Plate kort, og de grundlæggende kemiske data for hvert stof kunne findes på følgende hjemmesider:
    NCI-nummerplade 4740
    NCI-nummerplade 4741

2. Skærm for heterochromatin-fremme nde stoffer ved hjælp af Drosophila

  1. Drosophila (Drosophila) Avlsstrategi (Figur 1A)
    1. Dag 1: Kryds tre w1118/Y; DX1/CyO hanflyver og tre eller flere jomfruw1118 hunflyver i et 25 mm x 95 mm madhætteglas med 9 ml standard Drosophila madmedier (Bloomington opskrift). Konfigurer tre replikate hætteglas for hvert lægemiddel og en kontrol til skærmen.
      BEMÆRK: DX1 fluer blev venligt leveret af James Birchler (University of Missouri)9,13.
    2. Dag 2 og Dag 3: Lad fluerne lægge æg i 2 dage ved stuetemperatur (22 °C).
    3. Dag 4: Brug en kort eksplosion af CO2 gas til at bedøve forældrene flyver og bortskaffe moderselskabet flyver i en "flyve lighus" (en flaske, der indeholder 70% alkohol).
  2. Feed narkotika til Drosophila til screening.
    1. Hver lægemiddelforbindelse fortyndes fra den oprindelige bestand (20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i 96-brønd PP U-bundplader) til en 10 μM slutkoncentration med 33% DMSO i vand. Brug 33% DMSO i vand uden noget lægemiddel som kontrol.
      BEMÆRK: Nogle lægemidler er dårligt opløselige i vand og blev opløst i DMSO. 100% DMSO er giftigt for fluer. 33% er tåleligt.
    2. Dag 4: Pipette 60 μL af en 10 μM lægemiddelopløsning eller kontrol på toppen af fluemad. På dette tidspunkt, sikre, at forældrene flyver er blevet fjernet, og der er flueæg og kravlende første-instar larver på maden.
    3. Dag 6: Gentag pipettering 60 μL af samme 10 μM lægemiddelopløsning på madhætteglasset.
      BEMÆRK: Da der blev tilsat lægemidler til fluemaden, indeholder den øverste overflademad næsten 10 μM koncentration, og de nederste fødevarer kunne ikke gennemtrænges fuldt ud. Alle fluer lægge æg på fødevaretoppen og spise den øverste overflade mad.
  3. Observere og score øjenfarve ændringer.
    1. To dage efter F1 fluer dukke op (ca. på dag 14), undersøge fluer. Brug en kort burst co2 til at bedøve F1 fluerne og fjern fluerne fra deres hætteglas på en porøs dissekeringspude med CO2, der nipper igennem fra undersiden af et filterpapir.
    2. Undersøg fluerne på denne pude under et dissektionsmikroskop. Undersøg hele flyve og identificere alle w1118/ Y; DX1/+ heterozygote hanner ved deres manglende CyO dominerende krøllet vinge fænotype.
    3. Score øjenfarven på hver af de w1118/Y; DX1/+ heterozygote handyr flyver på en skala fra 1 til 5 (Figur 1B). Procentdelen af hvide øjne farve blev bedømt som følger:
      1. <5% rød spredt øje samlede overfladeareal
      2. 6% - 25% røde pletter øje samlede areal
      3. 26% - 50% røde pletter øje samlede areal
      4. 51% - 75% røde pletter øje samlede areal
      5. >75% røde pletter øje samlede overfladeareal
      BEMÆRK: Alternativt kan fluehoveder homogeniseres i 100% methanol og bruge et spektrometer til at måle øjenpigmentering ved OD 450 nm. Vælg kun hanner, fordi PEV er mere pronouced hos DX1 hanner. Score mere end 10 hanner i hvert hætteglas.
    4. Beregn den gennemsnitlige farve indeks for alle hannerne fra hvert hætteglas scoret. Udfør treeksemplarer for hver forbindelse (Figur 1C).
      BEMÆRK: Da øjenfarven varierer med alderen, er dette et tidsfølsomt trin. Øjenfarven skal beregnes på samme alder – 2 dage gammel. Normalt > 10 fluer skal scores i hvert hætteglas.
    5. For at bekræfte, at forbindelserne faktisk fremmer heterochromatindannelse, skal du bruge en anden teknik såsom vestlig blotting til at validere (figur 1G).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol blev med succes brugt til at screene forbindelser, der fremmer heterochromatindannelse i Drosophila, som er et effektivt og billigt in vivo-system til udvikling af lægemidler (figur 1). Vi screenet en lille molekyle stof bibliotek, Oncology Set III, som er sammensat af 97 FDA autoriserede onkologi medicin, ved hjælp af DX1 stamme af Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultaterne for et signifikant lægemiddel var repræsenteret i en søjlegraf (Figur 1C,D). Ifølge screening assay, methotrexat (4-aminopteroylglutamic syre), som er kodet som E7 i biblioteket, forårsagede den mest variation i DX1 stamme, tyder på, at methotrexat kunne være den mest lovende heterochromatin-fremmende stof til fremtidig kræft målrettet behandling (Figur 1E, F). For yderligere at bekræfte, at dette faktisk tester de forbindelser, der fremmer heterochromatindannelse, viser vestlige blot data, at heterochromatindannelse associeret protein H3K9me3 er upregulated (Figur 1G), yderligere kontrol af, at methotrexat kunne være det mest lovende heterochromatin-fremmende stof.

Figure 1
Figur 1: En illustration af narkotika screening i Drosophila. (A) Drosophila skærm metode. En oversigt over ordningen for heterochromatin-fremmende forbindelser screening ved hjælp af Drosophila model. Tre w1118/Y; DX1/CyO hanner og tre jomfruw1118 krydses ved stuetemperatur. Fjern derefter de voksne fluer på dag fire og tilsæt 60 μL af det 10 μM-lægemiddel, der er opløst i 33% DMSO-opløsning, til toppen af fluemaden på henholdsvis dag fire og dag seks. 33% DMSO-løsning blev brugt som kontrol. Øjenfarven (hvid til rød) forholdet mellem F1 mandlige generation blev observeret. (B) Øjenfarve fænotype analyse og score. Repræsentative billeder af øjenfarve, der viser brogede fænotype. Procentdelen af variegation øjenfarve blev bedømt som følgende: 1, 1-5% røde pletter i det samlede areal; 2, 6-25% røde pletter i det samlede areal; 3, 26-50% røde pletter i det samlede areal; 4, 51-75% røde pletter i det samlede areal; og 5, >75% røde pletter i det samlede overfladeareal. (Skalabjælke = 200 μm) (C) Hvert lægemiddel blev identificeret som middelværdierne fra tre uafhængige forsøg ± s.d. (standardafvigelse). Rød bjælke viser kontrolelementet. (D) Resultater af skalaen udført i narkotika E7 og kontrol. Forskelle mellem E7 og kontrolgrupper blev anset for signifikante, hvis P-værdier blev <0,05 (*) af Student's t-Test. (E) Den molekylære struktur af en kemisk forbindelse, der kaldes E7, der anvendes i eksemplet narkotika biblioteket. (F) Repræsentative billeder af flueøjnene i E7 og kontrolbehandlingsgruppen. (Skalabjælke, 200 μm) (G) Den vestlige blot blev udført med antistoffer, der er specifikke for H3K9me3,H3eller α-Tubulin ved at anvende det samlede protein med 3rd instar-larver uden eller med methotrexatbehandling ved de angivne koncentrationer. Dette tal er blevet ændret fra Loyola et al14. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heterochromatin er en kondenseret form for DNA, der spiller en central rolle i reguleringen af genekspression. Det bliver stadig mere anerkendt i kræft og kan tjene som et potentielt mål for kræftbehandling15,16,17,18. Små molekyle forbindelser er almindeligt anvendt i udviklingen af lægemidler på grund af fordele i fremstilling, konservering, og stofskifte i menneskelige kroppe. For at identificere heterochromatinfremmende små molekyleforbindelser blev en effektiv metode designet og præsenteret ved hjælp af DX1Drosophila-stammen, som har vist sig at påvirke fluernes øjenfarve på en heterochromatinafhængig måde (figur 1).

Vores screening protokol er en enkel, billig og nem at følge in vivo system til udvikling af lægemidler. En begrænsning af screeningsstrategien er imidlertid at fastlægge en effektiv lægemiddelkoncentration. Den kvindelige frugtflue lægger sine æg på overfladen af den halvfaste fluemad. Til lægemiddelbehandling, vi pipet lægemidlet løsning til overfladen af maden, som formodes at indeholde en forudbestemt koncentration. Men da forskellige lægemidler kan have forskellige effektivitetsgevinster i at sprede sig til bunden af fødevaren, er lægemiddelkoncentrationen ikke garanteret at være konsekvent under overfladen eller mod bunden af fødevaren. Ved koncentrationen på 10 μM blev dødelighed sjældent observeret hos larver, der blev behandlet med nogen af de lægemidler i det bibliotek, vi screenede. Men de fleste af stofferne forårsagede alvorlig dødelighed for larverne ved 100 μM koncentration, hvilket tyder på, at lægemiddelkoncentrationogså kunne betragtes som en vigtig faktor for skærmen.

Her bemærker vi, at tandem gentagelser som dem, der anvendes her kan udløse PEV ved en mekanisme, der adskiller sig i nogle henseender fra den, der ses i pericentrisk heterochromatin. Et lægemiddel, der påvirker PEV under embryonale og larve udvikling (testen beskrevet her) vil kun identificere lægemidler, der påvirker vedligeholdelsen af heterochromatin i somatiske celler og vil ikke identificere lægemidler, der påvirker den oprindelige dannelse af heterochromatin, som højst sandsynligt opstår under blastoderm (nukleare cyklusser 10-14). Ikke desto mindre, dette kunne være en nyttig analyse for en hurtig start skærm.

Denne protokol er pålidelig og omkostningseffektiv på grund af følsomheden af denne transgene klynge (DX1) til heterochromatin dannelse, afspejles af mængden af rød pigmentering til stede i øjet. Desuden gør drosophilas korte levetid denne protokol mere effektiv end andre modelorganismer såsom zebrafisk eller humane celler. Mens der sandsynligvis kan være en reporter gensystem til stede i zebrafisk, der er lige så følsomme over for heterochromatin niveauer, deres levetid er meget længere end Drosophila og ville tage længere tid at opnå resultater. Desuden, ved hjælp af humane celler ville ikke være muligt, da denne protokol specifikt fokuserer på at bruge fænotypiske ændringer fra epigenetiske regulering til at bestemme heterochromatin niveauer. Således, denne protokol giver en effektiv in vivo metode til at afgøre, hvilke små lægemiddel molekyle potentielt kunne tjene som en kandidat til at undertrykke onkogener i kræft terapeutiske. Mens Drosophila drug screening metode er en langsom tilgang til at identificere forbindelser i forhold til nogle in vitro screening metoder, det er relativt følsomt og giver os mulighed for at teste forbindelser in vivo. I kombination med cellescreeningsmetoden, som er relativt billig, nem at udføre og er høj gennemløb, kan Drosophila-screeningmetoden også bruges til at bekræfte hits som en supplerende metode.

Sammenfattende, med en interesse i at identificere forbindelser til yderligere forskning og målretning heterochromatin til kræftbehandling, selv om den mekanisme, hvori dette sker, er endnu ikke fuldt forstået, en simpel skærm blev udført for at identificere heterochromatinfremmende lægemidler. Opdage en lav koncentration, hvor et lægemiddel kan fremme heterochromatin dannelse kunne tilbyde mere unikke behandlinger, der kan resultere i færre bivirkninger i forhold til moderne kemoterapi behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker J. Birchler, E. Bach og Bloomington Drosophila Stock Center for forskellige Drosophila stammer; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for Onkologi Set små-molekyle stof bibliotek; UCSD bachelorstuderende, herunder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza og Alex Chavez. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af et forskningstilskud fra American Thoracic Society til J.L. og finansiering fra NIH: R01GM131044 til W.X.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Tags

Genetik heterochromatin tumor undertrykkelse små-molekyle forbindelser narkotika screening heterochromatin-fremme nde stof cellespredning Drosophila larver Drosophila celler voksen Drosophila position-effekt variegation
En screeningmetode til identifikation af heterokratinfremmende stoffer ved hjælp af <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter