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Genetics

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

Drosophila ist ein weit verbreitetes experimentelles Modell, das für das Screening von Medikamenten mit potenziellen Anwendungen für die Krebstherapie geeignet ist. Hier beschreiben wir die Verwendung von Drosophila-Variegated-Augenfarbphänotypen als Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Drosophila

Abstract

Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu überprüfen, die für die Krebstherapie nützlich sein könnten. Die hier beschriebene Methode ist eine kostengünstige In-vivo-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen mit Drosophila. Die DX1-Sorte der Drosophila, die einen bunten Augenfarb-Phänotyp hat, der die Ausdehnungen der Heterochromatin-Bildung widerspiegelt und damit ein Werkzeug für einen heterochromatinfördernden Wirkstoff-Bildschirm bietet. Bei dieser Screening-Methode wird die Augenvariegation auf der Grundlage der Oberfläche der roten Pigmentierung quantifiziert, die Teile des Auges einnimmt, und auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Das Screening-Verfahren ist einfach und empfindlich und ermöglicht die Prüfung von Verbindungen in vivo. Arzneimittel-Screening mit dieser Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Heterochromatin fördernde Medikamente zu identifizieren, die positive Auswirkungen in Krebstherapeutika haben könnten. Die Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung von Heterochromatin fördern, könnte auch zur Entdeckung epigenetischer Mechanismen der Krebsentwicklung führen.

Introduction

Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Genexpression, bei der Regulierung der Chromosomensegregation während der Zellteilung und beim Schutz vor Genominstabilität1spielt. Heterochromatin gilt als Regulierer für die Genrepression und zum Schutz der Chromosomenintegrität bei der Zellmitose2,3. Es ist mit der Di- und Tri-Methylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me) während der AbstammungSverpflichtung4,5verbunden. Darüber hinaus wird die Rekrutierung von Chromodomain-Proteinen von Heterochromatin Protein 1 (HP1) auch als mit Heterochromatin und epigenetischer Unterdrückung der Genexpression6assoziiert. Diese Proteine sind wesentliche Bestandteile und Marker der Heterochromatinbildung.

Da die genomische Instabilität es Zellen ermöglicht, genetische Veränderungen zu erwerben, die die Karzinogenese fördern, wird Heterochromatin in der Krebsentwicklung immer stärker anerkannt und kann für dieKrebsbehandlung7,8ins Visier genommen werden. Derzeit gibt es keine Medikamente, die gut etabliert sind bei der Unterstützung der Heterochromatin-Bildung. Hier präsentieren wir eine einfache und schnelle und dennoch effiziente Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Das Screening erfolgt durch die Behandlung von Drosophila mit einer Bibliothek von kleinmolekularen Medikamenten. Diese Methode nutzt einen bunten Augenfarben-Phänotyp in der DX1Drosophila-Sorte, der von Heterochromatin-Spiegeln beeinflusst wird. DX1-Fliegen enthalten ein Tandem-Array von sieben P[lac-w]-Transgenen, die je nach Heterochromatinisierung die bunte Expression/Depression aufweisen, daher spiegelt das Ausmaß der Variegation in der Augenfarbe den Heterochromatinspiegel wider. Insbesondere konnte das zunehmende Heterochromatin durch den steigenden Anteil der bunten Augenfarbe (weißes Auge) nachgewiesen werden. Im Gegenteil, abnehmendes Heterochromatin würde durch den steigenden Anteil der P[lac-w] Transgenexpression (rotes Auge)9,10,11,12erkannt.

Daher nutzen wir dieses Drosophila-Transgensystem, das einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, da seine Expression direkt mit der Menge an Heterochromatin korreliert. Bei der Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, können wir diesen Verdacht mit anderen Methoden wie Western Blot bestätigen. Diese heterochromatinfördernden Substanzen können in Zukunft für klinische Studien bei Patienten weiterentwickelt werden.

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Protocol

1. Vorbereitung der Drogenbibliothek

  1. Identifizieren und vorbereiten Sie eine Arzneimittelbibliothek, die mit geeignetem Lösungsmittel in einer gewünschten Konzentration (z. B. 10 mM in DMSO) untersucht werden soll.
    HINWEIS: Ein spezifisches Beispiel für eine Arzneimittelbibliothek ist das Onkologie-Set III des National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Verbindungen in diesem Set werden als 20 l bei 10 mM in 100% DMSO in zwei 96-Well PP U-Bodenplatten geliefert und bei -20 °C gelagert. Die NCI Plate Karten und die grundlegenden chemischen Daten der einzelnen Medikamente können auf den folgenden Websites gefunden werden:
    NCI-Kennzeichen 4740
    NCI-Kennzeichen 4741

2. Bildschirm für Heterochromatin fördernde Medikamente mit Drosophila

  1. Drosophila Zuchtstrategie (Abbildung 1A)
    1. Tag 1: Kreuz drei w1118/Y; DX1/CyO männliche Fliegen und drei oder mehr jungfräuliche w1118 weibliche Fliegen in einem 25 mm x 95 mm Lebensmittel-Fläschchen mit 9 ml Standard Drosophila Food Media (Bloomington Rezept). Richten Sie drei Replizien-Fläschchen für jedes Medikament und eine Steuerung für den Bildschirm ein.
      HINWEIS: DX1 Fliegen wurden freundlicherweise von James Birchler (University of Missouri)9,13zur Verfügung gestellt.
    2. Tag 2 und Tag 3: Lassen Sie die Fliegen Eier für 2 Tage bei Raumtemperatur (22 °C) legen.
    3. Tag 4: Verwenden Sie einen kurzen Ausbruch vonCO2-Gas, um die Elternfliegen zu beächen und die Elternfliegen in einer "Fliegen-Leichenhalle" (eine Flasche mit 70% Alkohol) zu entsorgen.
  2. Füttern Sie Medikamente zu Drosophila für das Screening.
    1. Verdünnen Sie jede Wirkstoffverbindung aus dem ursprünglichen Bestand (20 l bei 10 mM in 100% DMSO in 96-well PP U-Bodenplatten) auf eine Endkonzentration von 10 m mit 33 % DMSO in Wasser. Verwenden Sie 33% DMSO in Wasser ohne Medikament als Kontrolle.
      HINWEIS: Einige Medikamente sind in Wasser schlecht löslich und wurden in DMSO gelöst. 100% DMSO ist toxisch für Fliegen. 33 % sind tolerierbar.
    2. Tag 4: Pipette 60 l einer 10-M-Medikamentenlösung oder Kontrolle auf der Oberseite von Fliegenfutter. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass die Elternfliegen entfernt wurden und es Fliegeneier und kriechende First-instar-Larven auf dem Futter gibt.
    3. Tag 6: Wiederholen Sie die Pipettierung von 60 l der gleichen 10-M-Medikamentenlösung auf die Lebensmitteldurchstechflasche.
      HINWEIS: Da dem Fliegenfutter Medikamente zugesetzt wurden, enthält die obere Oberfläche eine Konzentration von fast 10 m und die Grundnahrung konnte nicht vollständig durchdrungen werden. Alle Fliegen legen Eier auf die Nahrungsplatte und fressen die obere Oberfläche Nahrung.
  3. Beobachten und bewerten Sie Augenfarbe Änderungen.
    1. Zwei Tage nach dem Auftauchen der F1-Fliegen (ungefähr am 14. Tag) untersuchen Sie die Fliegen. Verwenden Sie einen kurzen Ausbruch von CO2, um die F1-Fliegen zu beanästhesieren und die Fliegen aus ihrer Durchstechflasche auf ein poröses Sezieren pad mit CO2 zu entfernen, das unter einem Filterpapier durchnippt.
    2. Inspizieren Sie die Fliegen auf diesem Pad unter einem Seziermikroskop. Untersuchen Sie die gesamte Fliege und identifizieren Sie alle w1118/Y; DX1/+ heterozygotmännchen Männchen, da sie den CyO-dominanten lockigen Flügelphänotyp fehlten.
    3. Score die Augenfarbe der einzelnen w1118/Y; DX1/+ heterozygote männliche Fliegen auf einer Skala von 1 bis 5 (Abbildung 1B). Der Prozentsatz der weißen Augenfarbe wurde wie folgt bewertet:
      1. <5% rotes gestreutes Auge Gesamtfläche
      2. 6% - 25% rote Flecken Augen Gesamtfläche
      3. 26% - 50% rote Flecken Augen Gesamtfläche
      4. 51% - 75% rote Flecken Augen Gesamtfläche
      5. >75% rote Flecken Augen Gesamtfläche
      HINWEIS: Alternativ können Sie Fliegenköpfe in 100% Methanol homogenisieren und ein Spektrometer verwenden, um die Augenpigmentierung bei OD 450 nm zu messen. Wählen Sie nur Männer, weil PEV mehr pronouced in DX1 Männchen. Erzielen Sie mehr als 10 Männer in jeder Durchstechflasche.
    4. Berechnen Sie den mittleren Farbindex aller Männchen aus jeder durchstecherten Durchstechflasche. Führen Sie Triplicate für jede Verbindung durch (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Da die Augenfarbe mit dem Alter variiert, ist dies ein zeitsensitiver Schritt. Die Augenfarbe sollte im gleichen Alter berechnet werden – 2 Tage alt. Normalerweise sollten >10 Fliegen in jeder Durchstechflasche gewertet werden.
    5. Um zu bestätigen, dass die Verbindungen tatsächlich die Heterochromatinbildung fördern, verwenden Sie eine andere Technik wie Western Blotting, um zu validieren (Abbildung 1G).

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Representative Results

Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Verbindungen zu untersuchen, die die Heterochromatinbildung in Drosophilafördern, das ein effizientes und kostengünstiges In-vivo-System für die Arzneimittelentwicklung ist (Abbildung 1). Wir haben eine kleinmolekulare Arzneimittelbibliothek, Oncology Set III, untersucht, die aus 97 von der FDA zugelassenen Onkologie-Medikamenten besteht, mit dem DX1-Stamm von Drosophila melanogaster (Abbildung 1B). Die Ergebnisse für ein signifikantes Medikament wurden in einem Balkendiagramm dargestellt (Abbildung 1C,D). Nach dem Screening-Test verursachte Methotrexat (4-Aminopteroylglutaminsäure), das in der Bibliothek als E7 kodiert ist, die größte Variegation im DX1-Stamm, was darauf hindeutet, dass Methotrexat das vielversprechendste Heterochromatin-fördernde Medikament für die zukünftige Krebszieltherapie sein könnte (Abbildung 1E,F). Um weiter zu bestätigen, dass dies tatsächlich die Verbindungen zur Förderung der Heterochromatinbildung testet, zeigen westliche Blotdaten, dass das mit der Heterochromatinbildung assoziierte Protein H3K9me3 hochreguliert ist (Abbildung 1G), was weiter bestätigt, dass Methotrexat das vielversprechendste Heterochromatin fördernde Medikament sein könnte.

Figure 1
Abbildung 1: Eine Abbildung des Drogenscreenings in Drosophila. (A) Drosophila-Bildschirmmethodik. Eine Übersicht über das Schema für das Screening von Heterochromatin fördernden Verbindungen mithilfe des Drosophila-Modells. Drei w1118/Y; DX1/CyO Männchen und drei jungfräuliche w1118 werden bei Raumtemperatur gekreuzt. Entfernen Sie dann die erwachsenen Fliegen an Tag vier und fügen Sie 60 L des 10-M-Medikaments, das in 33% DMSO-Lösung gelöst ist, an Tag vier bzw. Tag sechs an die Spitze des Fliegenfutters zu bringen. 33% DMSO-Lösung wurde als Steuerung verwendet. Das Augenfarbe (weiß zu rot) Verhältnis der Männlichen Generation F1 wurde beobachtet. (B) Augenfarbe Phänotyp Analyse und Punktzahl. Repräsentative Bilder der Augenfarbe, die einen bunten Phänotyp zeigen. Der Prozentsatz der Variegation Augenfarbe wurde wie folgt bewertet: 1, 1-5% rote Flecken in der Gesamtfläche; 2, 6-25% rote Flecken in der Gesamtfläche; 3, 26-50% rote Flecken in der Gesamtfläche; 4, 51-75% rote Flecken in der Gesamtfläche; und 5, >75% rote Flecken in der Gesamtfläche. (Skala Bar = 200 m) (C) Jedes Medikament wurde als Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten (Standardabweichung) untersucht. Rote Leiste zeigt das Steuerelement an. (D) Ergebnisse der Skala, die im Medikament E7 durchgeführt wird, und Kontrolle. Unterschiede zwischen E7 und Kontrollgruppen wurden als signifikant angesehen, wenn P-Werte durch Student es t-Test <0.05 (*) waren. (E) Die molekulare Struktur einer chemischen Verbindung, die E7 in der Beispiel-Arzneimittelbibliothek verwendet. (F) Repräsentative Bilder der Fliegenaugen in E7 und Kontrollbehandlungsgruppe. (Skala Bar, 200 m) (G) Der Western-Blot wurde mit Antikörpern durchgeführt, die speziell für H3K9me3,H3, oder '-Tubulin unter Verwendung des3. Instar-Larven-Gesamtproteins ohne oder mit Methotrexat-Behandlung in den angegebenen Konzentrationen verwendet wurden. Diese Zahl wurde von Loyola et al14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt. Es wird immer mehr bei Krebs erkannt und kann als potenzielles Ziel für die Krebstherapie dienen15,16,17,18. Kleinmolekulare Verbindungen werden häufig in der Arzneimittelentwicklung aufgrund von Vorteilen bei der Herstellung, Konservierung und Stoffwechsel in menschlichen Körpern verwendet. Um heterochromatinfördernde Kleinmolekülverbindungen zu identifizieren, wurde eine effiziente Methode entwickelt und vorgestellt, die mit dem DX1Drosophila-Stamm entwickelt und vorgestellt wurde, der nachweislich die Augenfarbe von Fliegen in einer Heterochromatin-abhängigen Weise beeinflusst(Abbildung 1).

Unser Screening-Protokoll ist ein einfaches, kostengünstiges und einfach zu verfolgendes In-vivo-System für die Arzneimittelentwicklung. Eine Einschränkung der Screening-Strategie besteht jedoch darin, eine effektive Arzneimittelkonzentration zu bestimmen. Die weibliche Fruchtfliege legt ihre Eier auf die Oberfläche des halbfesten Fliegenfutters. Für die medikamentöse Behandlung pfeifen wir die Arzneimittellösung an die Oberfläche des Lebensmittels, die eine vorbestimmte Konzentration enthalten soll. Da jedoch verschiedene Medikamente unterschiedliche Effizienzen bei der Streuung auf den Boden des Lebensmittels aufweisen können, ist die Wirkstoffkonzentration nicht garantiert konsistent unter der Oberfläche oder in Richtung des Bodens des Lebensmittels. Bei einer Konzentration von 10 m wurde die Letalität selten bei Larven beobachtet, die mit einem der Medikamente in der von uns untersuchten Bibliothek behandelt wurden. Die meisten Medikamente verursachten jedoch schwere Letalitäten der Larven bei einer Konzentration von 100 m, was darauf hindeutet, dass die Drogenkonzentration auch als wichtiger Faktor für den Bildschirm angesehen werden könnte.

Hier stellen wir fest, dass Tandemwiederholungen, wie sie hier verwendet werden, PEV durch einen Mechanismus auslösen können, der sich in einigen Hinsichten von dem in perizentrischem Heterochromatin unterscheidet. Ein Medikament, das PEV während der embryonalen und Larvenentwicklung beeinflusst (der hier beschriebene Test) wird nur Medikamente identifizieren, die die Aufrechterhaltung von Heterochromatin in somatischen Zellen beeinflussen, und keine Medikamente identifizieren, die die Anfangsbildung von Heterochromatin beeinflussen, die höchstwahrscheinlich während des Blastoderms auftritt (Kernzyklen 10-14). Dennoch könnte dies ein nützlicher Test für einen schnellen Startbildschirm sein.

Dieses Protokoll ist zuverlässig und kostengünstig aufgrund der Empfindlichkeit dieses Transgenclusters (DX1) gegenüber der Heterochromatinbildung, die sich in der Menge der roten Pigmentierung im Auge widerspiegelt. Darüber hinaus macht die kurze Lebensdauer von Drosophila dieses Protokoll effizienter als andere Modellorganismen wie Zebrafische oder menschliche Zellen. Während es wahrscheinlich ein Reporter-Gensystem in Zebrafischen vorhanden sein könnte, die genauso empfindlich auf Heterochromatin-Spiegel ist, ist ihre Lebensdauer viel länger als Drosophila und würde länger dauern, um Ergebnisse zu erhalten. Darüber hinaus wäre die Verwendung menschlicher Zellen nicht möglich, da sich dieses Protokoll speziell auf die Verwendung von phänotychen Veränderungen aus der epigenetischen Regulation konzentriert, um Den Heterochromatinspiegel zu bestimmen. Somit bietet dieses Protokoll eine effiziente In-vivo-Methode, um zu bestimmen, welches kleine Wirkstoffmolekül potenziell als Kandidat für die Unterdrückung von Onkogenen in Krebstherapeutika dienen könnte. Während die Drosophila-Arzneimittel-Screening-Methode ein langsamer Ansatz zur Identifizierung von Verbindungen im Vergleich zu einigen In-vitro-Screening-Methoden ist, ist es relativ empfindlich und ermöglicht es uns, Verbindungen in vivo zu testen. In Kombination mit der Zell-Screening-Methode, die relativ kostengünstig, einfach durchzuführen ist und einen hohen Durchsatz hat, könnte das Drosophila-Screening-Verfahren auch verwendet werden, um Treffer als ergänzende Methode zu bestätigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem Interesse an der Identifizierung von Verbindungen für die weitere Forschung und der Ausrichtung auf Heterochromatin für die Krebstherapie, obwohl der Mechanismus, in dem dies auftritt, noch nicht vollständig verstanden ist, ein einfacher Bildschirm durchgeführt wurde, um Heterochromatin fördernde Medikamente. Die Entdeckung einer niedrigen Konzentration, bei der ein Medikament die Heterochromatinbildung fördern kann, könnte einzigartigere Behandlungen bieten, die im Vergleich zu modernen Chemotherapien zu weniger Nebenwirkungen führen können.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken J. Birchler, E. Bach und dem Bloomington Drosophila Stock Center für verschiedene Drosophila-Sorten; das National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD Studenten wie Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza und Alex Chavez. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium der American Thoracic Society an J.L. und die Finanzierung durch NIH: R01GM131044 an W.X.L. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Genetik Ausgabe 157 Heterochromatin Tumorsuppression kleinmolekulare Verbindungen Arzneimittelscreening Heterochromatin förderndes Medikament Zellproliferation Drosophilalarven, Drosophilazellen, erwachsene Drosophila,Positions-Wirkungsvariegation
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Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

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