Summary
Drosophila er en mye brukt eksperimentell modell egnet for screening av legemidler med potensielle anvendelser for kreftbehandling. Her beskriver vi bruken av Drosophila spraglete øyefarge fenotyper som en metode for screening av småmolekylforbindelser som fremmer heterochromatindannelse.
Abstract
Drosophila er en utmerket modell organisme som kan brukes til å screene forbindelser som kan være nyttig for kreftbehandling. Metoden som er beskrevet her er en kostnadseffektiv in vivo metode for å identifisere heterochromatin-fremme forbindelser ved hjelp av Drosophila. Den Drosophila DX1 DX1 stamme, har en spraglete øyendels fenotype som gjenspeiler omfanget av heterochromatin formasjon, og dermed gi et verktøy for en heterochromatin-fremme narkotika skjerm. I denne screeningmetoden kvantifiseres øyevariasjon basert på overflatearealet av rød pigmentering som opptar deler av øyet og scores på en skala fra 1 til 5. Screeningmetoden er enkel og følsom og gjør det mulig å teste forbindelser in vivo. Narkotikascreening ved hjelp av denne metoden gir en rask og rimelig måte å identifisere heterochromatinfremmende legemidler som kan ha gunstige effekter i kreftterapeutiske midler. Identifisere forbindelser som fremmer dannelsen av heterochromatin kan også føre til oppdagelsen av epigenetiske mekanismer for kreftutvikling.
Introduction
Heterochromatin er en kondensert form for DNA som spiller en sentral rolle i genuttrykk, i å regulere kromosomsegregering under celledeling, og i å beskytte mot genom ustabilitet1. Heterochromatin har blitt ansett for å være en genundertrykkelse regulator og for å beskytte kromosom integritet under celle mitose2,3. Det er forbundet med di- og tri-metylering av histone H3 lysine 9 (H3K9me) under avstamning forpliktelse4,5. Videre anses rekruttering av heterochromatin Protein 1 (HP1) kromodomainproteiner også å være forbundet med heterochromatin og epigenetisk undertrykkelse av genuttrykk6. Disse proteinene er viktige komponenter og markører for heterochromatindannelse.
Siden genomisk ustabilitet gjør det mulig for celler å skaffe genetiske endringer som fremmer karsinogenese, blir heterochromatin mer anerkjent i kreftutvikling og kan være målrettet for kreftbehandling7,8. For tiden er det ingen stoffer som er godt etablert i å bistå heterokromatindannelse. Her presenterer vi en enkel og rask, men effektiv metode for screening av småmolekylforbindelser som fremmer heterochromatindannelse. Screeningen gjøres ved å behandle Drosophila med et bibliotek med småmolekylmedisiner. Denne metoden drar nytte av en spraglete øyfarge fenotype i DX1Drosophila-stammen som påvirkes av heterochromatinnivåer. DX1 fluer inneholder en tandem rekke av syv P [lac-w] transgenes, som har variert uttrykk / depresjon avhengig av heterochromatinization, derfor, omfanget av variegation i øyenfargen gjenspeiler heterochromatin nivå. Spesielt kan økende heterochromatin oppdages av den økende andelen av spraglete øyenfarge (hvitt øye). Tvert imot vil avtagende heterokromatin oppdages av den økende andelen av P[lac-w] transgene uttrykket (røde øyne)9,10,11,12.
Derfor drar vi nytte av dette Drosophila transgene systemet som produserer en spraglete øyendelsfenotype siden uttrykket er direkte korrelert til mengden heterochromatin tilstede. Ved oppdagelsen av forbindelser som mistenkes for å fremme heterochromatindannelse, kan vi bekrefte denne mistanken ved hjelp av andre metoder som vestlig blot. Disse heterokromatinfremmende stoffene kan videreutvikles for kliniske studier hos pasienter i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av legemiddelbibliotek
- Identifiser og klargjør et legemiddelbibliotek som skal screenes ved hjelp av passende løsemiddel ved ønsket konsentrasjon (f.eks. 10 mM i DMSO).
MERK: Et spesifikt eksempel for et legemiddelbibliotek er Oncology Set III fra National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Forbindelser i dette settet leveres som 20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i to 96-brønn PP U-bunnplater og lagret ved -20 °C. NCI Plate kart, og de grunnleggende kjemiske data for hvert stoff kan bli funnet på følgende nettsteder:
NCI-nummer 4740
NCI-nummer 4741
2. Skjerm for heterochromatin-fremme narkotika ved hjelp av Drosophila
-
Drosophila (andre rom) Avlsstrategi (Figur 1A)
- Dag 1: Kryss tre w1118/Y; DX1/ CyO mannlige fluer og tre eller flere jomfru w1118 hunn flyr i en 25 mm x 95 mm mat hetteglass med 9 ml standard Drosophila mat media (Bloomington oppskrift). Sett opp tre replikering hetteglass for hvert stoff og en kontroll for skjermen.
MERK: DX1 fluer ble vennlig levert av James Birchler (University of Missouri)9,13. - Dag 2 og dag 3: La fluene legge egg i 2 dager ved romtemperatur (22 °C).
- Dag 4: Bruk en kort serie co2 gass for å bedøve foreldrene fluer og kast foreldrene fluer i en "fly likhus" (en flaske som inneholder 70% alkohol).
- Dag 1: Kryss tre w1118/Y; DX1/ CyO mannlige fluer og tre eller flere jomfru w1118 hunn flyr i en 25 mm x 95 mm mat hetteglass med 9 ml standard Drosophila mat media (Bloomington oppskrift). Sett opp tre replikering hetteglass for hvert stoff og en kontroll for skjermen.
- Mate medisiner til Drosophila for screening.
- Fortynn hver legemiddelforbindelse fra den opprinnelige bestanden (20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i 96-brønn PP U-bunnplater) til en 10 μM endelig konsentrasjon med 33% DMSO i vann. Bruk 33% DMSO i vann uten noe stoff som kontroll.
MERK: Noen stoffer er dårlig løselig i vann og ble oppløst i DMSO. 100% DMSO er giftig for fluer. 33% er utholdelig. - Dag 4: Pipette 60 μL av en 10 μM legemiddelløsning eller kontroll på toppen av flymat. På dette punktet, sørg for at de overordnede fluene er fjernet og det er flyegg og kryper første-instar larver på maten.
- Dag 6: Gjenta pipettering 60 μL av samme 10 μM legemiddelløsning til hetteglasset med mat.
MERK: Siden narkotika ble lagt på flymaten, inneholder toppoverflaten mat nesten 10 μM konsentrasjon og bunnmaten kan ikke trenges helt inn. Alle fluene legger egg på mattoppen og spiser toppmat.
- Fortynn hver legemiddelforbindelse fra den opprinnelige bestanden (20 μL ved 10 mM i 100% DMSO i 96-brønn PP U-bunnplater) til en 10 μM endelig konsentrasjon med 33% DMSO i vann. Bruk 33% DMSO i vann uten noe stoff som kontroll.
- Vær oppmerksom på og score øyenfargeendringer.
- To dager etter at F1-fluene dukker opp (omtrent på dag 14), undersøke fluene. Bruk et kort utbrudd av CO2 for å bedøve F1-fluene og fjern fluene fra hetteglasset til en porøs dissekeringspute med CO2 som nipper gjennom fra under et filterpapir.
- Inspiser fluene på denne puten under et disseksjonsmikroskop. Undersøk hele fluen og identifiser alle w1118/Y; DX1/+ heterozygous hanner ved deres mangler CyO dominerende krøllete vinge fenotype.
- Score øyenfargen på hver av w1118/ Y; DX1/+ heterozygous hannen flyr på en skala fra 1 til 5 (Figur 1B). Prosentandelen av hvit øyenfarge ble vurdert som følger:
1. <5% rødt spredt øye totalt overflateareal
2. 6% - 25% røde flekker øye total overflateareal
3. 26% - 50% røde flekker øye total overflateareal
4. 51% - 75% røde flekker øye total overflateareal
5. > 75% røde flekker øye total overflateareal
MERK: Alternativt kan du homogenisere flyhoder i 100% metanol og bruke et spektrometer for å måle øyepigmentering ved OD 450 nm. Velg bare menn fordi PEV er mer pronouced i DX1 menn. Score mer enn 10 menn i hvert hetteglass. - Beregn gjennomsnittlig fargeindeks for alle hannene fra hvert hetteglass scoret. Utfør triplicates for hver forbindelse (figur 1C).
MERK: Siden øyenfargen varierer med alderen, er dette et tidsfølsomt trinn. Øyenfargen skal beregnes i samme alder – 2 dager gammel. Vanligvis > 10 fluer bør scores i hvert hetteglass. - For å bekrefte at forbindelsene faktisk fremmer heterochromatindannelse, bruk en annen teknikk som vestlig blotting for å validere (figur 1G).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble vellykket brukt til å screene forbindelser som fremmer heterochromatindannelse i Drosophila, som er et effektivt og rimelig in vivo-system for narkotikautvikling (Figur 1). Vi screenet et lite molekyl legemiddelbibliotek, Oncology Set III, som består av 97 FDA autoriserte onkologi medisiner, ved hjelp av DX1-stammen av Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultatene for et betydelig legemiddel var representert i en stolpegraf (figur 1C,D). Ifølge screeninganalysen forårsaket metotreksat (4-aminopteroylglutamic acid), som er kodet som E7 i biblioteket, mest varierti DX1-stammen, noe som tyder på at metotreksat kan være det mest lovende heterokromatinfremmende stoffet for fremtidig kreftmålrettet behandling (Figur 1E,F). For ytterligere å bekrefte at dette faktisk tester forbindelsene som fremmer heterochromatindannelse, viser vestlige blotdata at heterochromatindannelse assosiert protein H3K9me3 er upregulert (Figur 1G), og bekrefter ytterligere at metotreksat kan være det mest lovende heterokromatinfremmende stoffet.
Figur 1: En illustrasjon av legemiddelscreeningen i Drosophila. (A) Drosophila skjerm metodikk. En oversikt over ordningen for heterochromatin-fremme forbindelser screening ved hjelp av Drosophila modell. Tre w1118/Y; DX1/CyO hanner og tre jomfru w1118 krysses ved romtemperatur. Deretter fjerner du de voksne fluene på dag fire og legger til 60 μL av 10 μM-stoffet oppløst i 33% DMSO-løsning til toppen av flymaten på henholdsvis dag fire og dag seks. 33 % DMSO-løsning ble brukt som en kontroll. Øyenfarge (hvit til rød) forholdet mellom F1 mannlige generasjon ble observert. (B) Eye color fenotype analyse og score. Representative bilder av øyenfarge som viser spraglete fenotype. Prosentandelen av variegation øyenfarge ble vurdert som følgende: 1, 1-5% røde flekker i totalt overflateareal; 2, 6-25% røde flekker i totalt overflateareal; 3, 26-50% røde flekker i totalt overflateareal; 4, 51-75% røde flekker i totalt overflateareal; og 5, > 75% røde flekker i totalt overflateareal. (Skala bar = 200 μm) (C) Hvert legemiddel ble analyset som gjennomsnittlige verdier fra tre uavhengige eksperimenter ± s.d. (standardavvik). Rød stolpe viser kontrollen. (D) Resultater av skalaen utført i stoffet E7 og kontroll. Forskjeller mellom E7 og kontrollgrupper ble ansett som signifikante hvis P-verdier var <0,05 (*) av Studentens t-test. (E) Den molekylære strukturen til en kjemisk forbindelse som betegnet E7 som ble brukt i eksempelet ser på legemiddelbiblioteket. (F) Representative bilder av fly øynene i E7 og kontroll behandlingsgruppe. (Skalabar, 200 μm) (G) Den vestlige flekken ble utført med antistoffer som er spesifikke for H3K9me3,H3eller α-Tubulin ved hjelp av 3rd instar larver totalt protein uten eller med metotreksatbehandling ved de angitte konsentrasjonene. Dette tallet er endret fra Loyola et al14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterochromatin er en kondensert form for DNA som spiller en sentral rolle i reguleringen av genuttrykk. Det blir stadig mer anerkjent i kreft og kan tjene som et potensielt mål for kreftbehandling15,16,17,18. Småmolekylforbindelser brukes ofte i legemiddelutvikling på grunn av fordeler ved produksjon, bevaring og metabolisme i menneskelige organer. For å identifisere heterochromatinfremmende småmolekylforbindelser ble en effektiv metode designet og presentert ved hjelp av DX1Drosophila-stammen, som har vist seg å påvirke fluenes øyenfarge på en heterochromatinavhengig måte (figur 1).
Vår screeningprotokoll er et enkelt, billig og lett å følge in vivo-systemet for narkotikautvikling. En begrensning av screeningstrategien er imidlertid å bestemme en effektiv legemiddelkonsentrasjon. Den kvinnelige fruktfluen legger eggene på overflaten av den halvfaste flymaten. For medikamentbehandling rører vi legemiddelløsningen til overflaten av maten, som skal inneholde en forhåndsbestemt konsentrasjon. Men siden forskjellige stoffer kan ha forskjellige effektiviteter i å spre seg til bunnen av maten, er legemiddelkonsentrasjonen ikke garantert å være konsekvent under overflaten eller mot bunnen av maten. Ved 10 μM konsentrasjon ble dødelighet sjelden observert hos larver behandlet med noen av stoffene i biblioteket vi screenet. Imidlertid forårsaket de fleste stoffene alvorlig dødelighet for larver ved 100 μM konsentrasjon, noe som tyder på at legemiddelkonsentrasjon også kan betraktes som en viktig faktor for skjermen.
Her merker vi at tandem repetisjoner som de som brukes her kan utløse PEV med en mekanisme som avviker i noen henseender fra det som er sett i perisentrisk heterochromatin. Et stoff som påvirker PEV under embryonisk og larval utvikling (testen beskrevet her) vil bare identifisere legemidler som påvirker vedlikehold av heterochromatin i somatiske celler og vil ikke identifisere legemidler som påvirker den første dannelsen av heterochromatin, som mest sannsynlig oppstår under blastoderm (kjernefysiske sykluser 10-14). Likevel kan dette være en nyttig analyse for en rask startskjerm.
Denne protokollen er pålitelig og kostnadseffektiv på grunn av følsomheten til denne transgeneklyngen (DX1) til heterochromatindannelse, reflektert av mengden rød pigmentering som finnes i øyet. I tillegg gjør den korte levetiden til Drosophila denne protokollen mer effektiv enn andre modellorganismer som sebrafisk eller menneskelige celler. Mens det sannsynligvis kan være en reporter gensystem til stede i sebrafisk som er like følsom for heterochromatin nivåer, deres levetid er mye lengre enn Drosophila og ville ta lengre tid å få resultater. I tillegg, ved hjelp av menneskelige celler ville ikke være mulig siden denne protokollen spesielt fokuserer på å bruke fenotypiske endringer fra epigenetisk regulering for å bestemme heterochromatin nivåer. Dermed gir denne protokollen en effektiv in vivo-metode for å avgjøre hvilket lite legemiddelmolekyl som potensielt kan tjene som kandidat for å undertrykke onkogenes i kreftterapeutiske midler. Mens Drosophila narkotika screening metoden er en langsom tilnærming til å identifisere forbindelser sammenlignet med noen in vitro screening metoder, det er relativt følsomt og tillater oss å teste forbindelser in vivo. I kombinasjon med cellescreeningsmetoden, som er relativt billig, lett å utføre og er høy gjennomstrømning, kan Drosophila screening metoden også brukes til å bekrefte treff som en supplerende metode.
Oppsummert, med interesse for å identifisere forbindelser for videre forskning og målretting heterokromatin for kreftbehandling, selv om mekanismen der dette skjer er ennå ikke fullt ut forstått, ble en enkel skjerm utført for å identifisere heterochromatin-fremme narkotika. Oppdage en lav konsentrasjon der et stoff kan fremme heterochromatin dannelse kan tilby mer unike behandlinger som kan resultere i færre bivirkninger sammenlignet med moderne kjemoterapi behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker J. Birchler, E. Bach og Bloomington Drosophila Stock Center for ulike Drosophila stammer; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for Oncology Set småmolekyl etlegemiddelbibliotek; UCSD lavere studenter inkludert Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, og Alex Chavez. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av et forskningsstipend fra American Thoracic Society til J.L. og finansiering fra NIH: R01GM131044 til W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
