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Genetics

Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

Drosophila é um modelo experimental amplamente utilizado adequado para o rastreamento de medicamentos com aplicações potenciais para a terapia do câncer. Aqui, descrevemos o uso de fenótipos de cor dos olhos variegated drosophila como um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina.

Abstract

Drosophila é um excelente organismo modelo que pode ser usado para testar compostos que podem ser úteis para a terapia do câncer. O método descrito aqui é um método econômico in vivo para identificar compostos promotores de heterocromatina usando Drosophila. A cepa DX1 da Drosophila, tendo um fenótipo de cor dos olhos variegated que reflete as extensões da formação de heterocromatina, fornecendo assim uma ferramenta para uma tela de drogas promotora de heterocromatina. Neste método de triagem, a variegação ocular é quantificada com base na área superficial da pigmentação vermelha ocupando partes do olho e é pontuada em uma escala de 1 a 5. O método de triagem é simples e sensível e permite testar compostos in vivo. O rastreamento de medicamentos usando este método fornece uma maneira rápida e barata de identificar drogas promotoras de heterocromatina que poderiam ter efeitos benéficos na terapêutica do câncer. Identificar compostos que promovam a formação de heterocromatina também pode levar à descoberta de mecanismos epigenéticos do desenvolvimento do câncer.

Introduction

Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na expressão genética, na regulação da segregação do cromossomo durante a divisão celular, e na proteção contra a instabilidade do genoma1. A heterocromatina tem sido considerada um regulador de repressão genética e para proteger a integridade do cromossomo durante a mitose celular2,3. Está associada à di e trimetilação da histona H3 lysina 9 (H3K9me) durante o compromisso de linhagem4,5. Além disso, o recrutamento de proteína heterocromatina 1 (HP1) proteínas de cromodomínio também é considerado associado com heterocromatina e repressão epigenética da expressão genética6. Essas proteínas são componentes essenciais e marcadores da formação de heterocromatina.

Uma vez que a instabilidade genômica permite que as células adquiram alterações genéticas que promovam a carcinogênese, a heterocromatina está se tornando mais reconhecida no desenvolvimento do câncer e pode ser direcionada para o tratamento do câncer7,8. Atualmente, não existem drogas bem estabelecidas para auxiliar a formação de heterocromatina. Aqui, apresentamos um método simples e rápido, mas eficiente, para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina. A triagem é feita tratando Drosophila com uma biblioteca de drogas de pequenas moléculas. Este método aproveita um fenótipo de cor dos olhos variegated na cepa DX1Drosophila que é influenciada pelos níveis de heterocromatina. As moscas DX1 contêm uma matriz tandem de sete transgenes P[lac-w], que têm a expressão variegated/depressão dependendo da heterocromatização, portanto, a extensão da variegação na cor dos olhos reflete o nível de heterocromatina. Especificamente, o aumento da heterocromatina poderia ser detectado pela proporção crescente da cor variegated dos olhos (olho branco). Pelo contrário, a diminuição da heterocromatina seria detectada pela proporção crescente da expressão transgênica P[lac-w] (olho vermelho)9,,10,,11,12.

Portanto, aproveitamos este sistema transgênico drosophila que produz um fenótipo de cor dos olhos variegated, uma vez que sua expressão está diretamente correlacionada com a quantidade de heterocromatina presente. Após a descoberta de compostos suspeitos de promover a formação de heterocromatina, podemos confirmar essa suspeita usando outros métodos, como a mancha ocidental. Essas substâncias promotoras da heterocromatina podem ser desenvolvidas para ensaios clínicos em pacientes no futuro.

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Protocol

1. Preparação da biblioteca de drogas

  1. Identifique e prepare uma biblioteca de medicamentos para ser examinada usando solvente apropriado em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mM em DMSO).
    NOTA: Um exemplo específico para uma biblioteca de medicamentos é o Conjunto de Oncologia III do Programa de Terapêutica de Desenvolvimento (DTP) do Instituto Nacional de Câncer (NCI). Os compostos deste conjunto são fornecidos como 20 μL a 10 mM em 100% DMSO em duas placas de fundo de bpp de 96 poços e armazenados a -20 °C. Os mapas nci plate, e os dados químicos básicos de cada droga podem ser encontrados nos seguintes sites:
    Placa NCI número 4740
    Placa NCI número 4741

2. Tela para drogas promotoras de heterocromatina usando Drosophila

  1. Drosophila Estratégia de reprodução (Figura 1A)
    1. Dia 1: Cruze três w1118/Y; DX1/CyO moscas machos e três ou mais fêmeas virgens w1118 moscas em um frasco alimentar de 25 mm x 95 mm com 9 mL de mídia alimentar drosophila padrão (receita Bloomington). Configure três frascos de réplica para cada droga e um controle para a tela.
      NOTA: As moscas DX1 foram gentilmente fornecidas por James Birchler (Universidade do Missouri)9,13.
    2. Dia 2 e Dia 3: Deixe as moscas colocarem ovos por 2 dias à temperatura ambiente (22 °C).
    3. Dia 4: Use uma pequena rajada de gás CO2 para anestesiar as moscas-dos-pais e descartar as moscas-dos-pais em um "necrotério voador" (uma garrafa contendo 70% de álcool).
  2. Ração de drogas para Drosophila para triagem.
    1. Diluir cada composto da droga do estoque original (20 μL a 10 mM em 100% DMSO em placas de fundo de 96 poços PP U) para uma concentração final de 10 μM com 33% de DMSO em água. Use 33% de DMSO na água sem qualquer droga como controle.
      NOTA: Algumas drogas são pouco solúveis em água e foram dissolvidas em DMSO. 100% DMSO é tóxico para moscas. 33% é tolerável.
    2. Dia 4: Pipeta 60 μL de uma solução de droga de 10 μM ou controle sobre o topo da comida de mosca. Neste ponto, certifique-se de que as moscas-dos-pais foram removidas e há ovos de mosca e larvas de primeira estrela rastejando na comida.
    3. Dia 6: Repita a pipetação de 60 μL da mesma solução de 10 μM para o frasco de alimentos.
      NOTA: Uma vez que as drogas foram adicionadas ao alimento de mosca, o alimento de superfície superior contém quase 10 μM de concentração e o alimento inferior não poderia ser totalmente penetrado. Todas as moscas colocam ovos na parte superior da comida e comem os alimentos de superfície superior.
  3. Observe e marque mudanças na cor dos olhos.
    1. Dois dias após as moscas da F-1 surgirem (aproximadamente no dia 14), examine as moscas. Use uma pequena rajada de CO2 para anestesiar as moscas de F1 e remover as moscas de seu frasco em uma plataforma de dissecção porosa com CO2 tomando por baixo de um papel filtro.
    2. Inspecione as moscas nesta almofada um microscópio de dissecção. Examine toda a mosca e identifique todas as w1118/Y; Machos dX1/+ heterozigosos por não ter o fenótipo de asa encaracolada dominante cyo.
    3. Marcar a cor dos olhos de cada um dos w1118/Y; DX1/+ heterozigos machos voam em uma escala de 1 a 5(Figura 1B). A porcentagem da cor dos olhos brancos foi classificada da seguinte forma:
      1. <5% de superfície total do olho espalhado vermelho
      2. 6% - 25% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      3. 26% - 50% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      4. 51% - 75% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      5. >75% manchas vermelhas área total da superfície do olho
      NOTA: Alternativamente, homogeneize cabeças de mosca em 100% de metanol e use um espectrômetro para medir a pigmentação dos olhos em 450 nm. Selecione apenas os machos porque o PEV é mais pronoucado em machos DX1. Marque mais de 10 machos em cada frasco.
    4. Calcular o índice médio de cor de todos os machos de cada frasco pontuado. Realizar triplicados para cada composto(Figura 1C).
      NOTA: Uma vez que a cor dos olhos varia com a idade, este é um passo sensível ao tempo. A cor dos olhos deve ser calculada na mesma idade – 2 dias de idade. Normalmente >10 moscas devem ser pontuadas em cada frasco.
    5. Para confirmar que os compostos realmente promovem a formação de heterocromatina, use uma técnica diferente, como a mancha ocidental para validar (Figura 1G).

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Representative Results

Este protocolo foi usado com sucesso para tela de compostos que promovem a formação de heterocromatina em Drosophila, que é um sistema in vivo eficiente e de baixo custo para o desenvolvimento de medicamentos (Figura 1). Examinamos uma biblioteca de medicamentos de pequenas moléculas, oncology set III, que é composta de 97 medicamentos de oncologia autorizados pela FDA, usando a cepa DX1 de Drosophila melanogaster (Figura 1B). Os resultados de uma droga significativa foram representados em um gráfico de barras (Figura 1C,D). De acordo com o ensaio de triagem, o metotrexato (4-aminopteroylglutamic acid), que é codificado como E7 na biblioteca, causou a maior variegação na cepa DX1, sugerindo que o metotrexato pode ser o mais promissor medicamento que promove a heterocromatina para futuraterapia-alvo do câncer (Figura 1E,F). Para confirmar ainda mais que este é realmente o teste dos compostos que promovem a formação de heterocromatina, os dados da mancha ocidental mostram que a formação de heterocromatina associada à proteína H3K9me3 é upregulada (Figura 1G), verificando ainda mais que o metotrexato pode ser a droga mais promissora que promove a heterocromatina.

Figure 1
Figura 1: Uma ilustração da triagem de medicamentos em Drosophila. (A)Metodologia da tela drosophila. Uma visão geral do esquema de triagem de compostos promotores de heterocromatina usando o modelo drosophila. Três w1118/Y; DX1/CyO machos e três virgens w1118 são cruzados à temperatura ambiente. Em seguida, remova as moscas adultas no quarto dia e adicione 60 μL da droga de 10 μM dissolvida em solução DMSO de 33% para o topo da comida de mosca no quarto dia e no sexto dia, respectivamente. 33% da solução DMSO foi utilizada como controle. A cor dos olhos (branco para vermelho) da geração masculina de F1 foi observada. (B) Análise do fenótipo da cor dos olhos e pontuação. Imagens representativas da cor dos olhos mostrando fenótipo variegated. O percentual de cor dos olhos de variegação foi classificado como: 1, 1-5% manchas vermelhas na área total da superfície; 2, 6-25% manchas vermelhas na área total da superfície; 3, 26-50% manchas vermelhas na área total da superfície; 4, 51-75% manchas vermelhas na área total da superfície; e 5, >75% de manchas vermelhas na área total da superfície. (Barra de escala = 200 μm) (C) Cada droga foi ensaio como os valores médios de três experimentos independentes ± s.d. (desvio padrão). A barra vermelha mostra o controle. (D) Resultados da escala realizada na droga E7 e controle. As diferenças entre e7 e grupos de controle foram consideradas significativas se os valores P foram <0,05 (*) pelo teste t de Student. (E) A estrutura molecular de um composto químico que denominava E7 usado na biblioteca de medicamentos por exemplo. (F) Imagens representativas dos olhos de mosca no E7 e do grupo de tratamento de controle. (Barra de escala, 200 μm) (G) A mancha ocidental foi realizada com anticorpos específicos para H3K9me3, H3, ou α-Tubulina utilizando a proteína total de larvasinstar 3 sem ou com tratamento de metotrexato nas concentrações indicadas. Esta figura foi modificada a partir de Loyola et al14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Heterocromatina é uma forma condensada de DNA que desempenha um papel central na regulação da expressão genética. Está se tornando cada vez mais reconhecida no câncer e pode servir como um alvo potencial para a terapia do câncer15,16,17,18. Compostos de pequenas moléculas são comumente usados no desenvolvimento de drogas devido a vantagens na fabricação, preservação e metabolismo em corpos humanos. Para identificar compostos de pequenas moléculas promotores da heterocromatina, um método eficiente foi projetado e apresentado usando a cepa DX1Drosophila, que tem sido comprovadamente afetada a cor dos olhos das moscas de forma dependente da heterocromatina(Figura 1).

Nosso protocolo de triagem é um sistema simples, barato e fácil de seguir in vivo para o desenvolvimento de medicamentos. No entanto, uma limitação da estratégia de triagem é determinar uma concentração eficaz de drogas. A mosca fêmea coloca seus ovos na superfície da comida de mosca semi-sólida. Para o tratamento medicamentoso, nós pipetamos a solução da droga para a superfície do alimento, que é suposto conter uma concentração predeterminada. No entanto, uma vez que diferentes drogas poderiam ter diferentes eficiências na difusão para o fundo do alimento, a concentração de drogas não é garantida para ser consistente abaixo da superfície ou em direção ao fundo do alimento. Na concentração de 10 μM, a letalidade raramente era observada em larvas tratadas com qualquer uma das drogas na biblioteca que examinamos. No entanto, a maioria das drogas causou letalidade severa às larvas em concentração de 100 μM, sugerindo que a concentração de drogas também poderia ser considerada como um fator importante para a tela.

Aqui, notamos que repetições em conjunto como as usadas aqui podem desencadear pev por um mecanismo que difere em alguns aspectos do visto na heterocromatina pericêntrica. Uma droga que impacta o PEV durante o desenvolvimento embrionário e larval (o teste descrito aqui) só identificará drogas que impactam a manutenção da heterocromatina em células somáticas e não identificará drogas que impactam a formação inicial de heterocromatina, que provavelmente ocorre durante blastoderme (ciclos nucleares 10-14). No entanto, este pode ser um teste útil para uma tela de partida rápida.

Este protocolo é confiável e econômico devido à sensibilidade deste aglomerado transgênico(DX1)à formação de heterocromatina, refletida pela quantidade de pigmentação vermelha presente no olho. Além disso, a curta vida útil da Drosophila torna este protocolo mais eficiente do que outros organismos modelos, como zebrafish ou células humanas. Embora provavelmente possa haver um sistema genético de repórteres presente em zebrafish que é tão sensível aos níveis de heterocromatina, sua vida útil é muito maior do que Drosophila e levaria mais tempo para obter resultados. Além disso, o uso de células humanas não seria possível, uma vez que este protocolo se concentra especificamente no uso de alterações phenotípicas da regulação epigenética para determinar os níveis de heterocromatina. Assim, este protocolo fornece um método in vivo eficiente para determinar qual pequena molécula de fárba poderia potencialmente servir como um candidato para suprimir oncogenes na terapêutica do câncer. Embora o método de triagem de drogas Drosophila seja uma abordagem lenta para identificar compostos quando comparado com alguns métodos de triagem in vitro, ele é relativamente sensível e nos permite testar compostos in vivo. Em combinação com o método de triagem celular, que é relativamente barato, fácil de executar e é de alto desempenho, o método de triagem drosophila também poderia ser usado para confirmar hits como um método suplementar.

Em resumo, com interesse em identificar compostos para novas pesquisas e direcionar a heterocromatina para a terapia do câncer, embora o mecanismo em que isso está ocorrendo ainda não seja totalmente compreendido, uma tela simples foi realizada a fim de identificar drogas promotoras de heterocromatina. Descobrir uma baixa concentração na qual uma droga pode promover a formação de heterocromatina poderia oferecer tratamentos mais únicos que podem resultar em menos efeitos colaterais em comparação com os tratamentos de quimioterapia modernos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a J. Birchler, E. Bach e ao Bloomington Drosophila Stock Center por várias cepas de Drosophila; o Programa de Terapêutica de Desenvolvimento do Instituto Nacional do Câncer (NCI) para a biblioteca de medicamentos de pequenas moléculas do Instituto Nacional do Câncer (INCa); Estudantes de graduação da UCSD, incluindo Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza e Alex Chavez. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por uma bolsa de pesquisa da American Thoracic Society para J.L. e financiamento do NIH: R01GM131044 para W.X.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

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Genética Edição 157 heterocromatina supressão de tumores compostos de pequenas moléculas triagem de drogas droga promotora de heterocromatina proliferação celular larvas de Drosophila, células drosophila, drosophilaadulta variegação de efeito de posição
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Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

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