Summary
Drosophila es un modelo experimental ampliamente utilizado adecuado para la detección de medicamentos con posibles aplicaciones para la terapia oncológica. Aquí, describimos el uso de fenotipos de color ocular variegados Drosophila como un método para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina.
Abstract
La drosofilia es un excelente organismo modelo que se puede utilizar para detectar compuestos que podrían ser útiles para la terapia oncológica. El método descrito aquí es un método in vivo rentable para identificar compuestos que promueven la heterocromatina mediante el uso de Drosophila. La cepa DX1 de la Drosophila, con un fenotipo de color de ojos variado que refleja las extensiones de la formación de heterocromatina, proporcionando así una herramienta para una prueba de drogas que promueve la heterocrocina. En este método de cribado, la variegación ocular se cuantifica en función de la superficie de pigmentación roja que ocupa partes del ojo y se puntua en una escala de 1 a 5. El método de cribado es sencillo y sensible y permite probar compuestos in vivo. La detección de medicamentos con este método proporciona una manera rápida y económica de identificar medicamentos que promueven la heterocromatina que podrían tener efectos beneficiosos en las terapias contra el cáncer. La identificación de compuestos que promueven la formación de heterocromatina también podría conducir al descubrimiento de mecanismos epigenéticos del desarrollo del cáncer.
Introduction
La heterocrocritina es una forma condensada de ADN que desempeña un papel central en la expresión génica, en la regulación de la segregación cromosómica durante la división celular y en la protección contra la inestabilidad del genoma1. Se ha considerado que la heterocromía es un regulador de la represión génica y para proteger la integridad cromosómica durante la mitosis celular2,3. Se asocia con la di- y trimetilación de la histona H3 lisina 9 (H3K9me) durante el compromiso de linaje4,5. Además, el reclutamiento de proteínas cromodominio de la proteína 1 de la heterocromía (HP1) también se considera asociado con la heterocromía y la represión epigenética de la expresión génica6. Estas proteínas son componentes esenciales y marcadores de la formación de heterocromatina.
Dado que la inestabilidad genómica permite a las células adquirir alteraciones genéticas que promueven la carcinogénesis, la heterocrocina es cada vez más reconocida en el desarrollo del cáncer y puede ser dirigida para el tratamiento del cáncer7,8. Actualmente, no hay medicamentos que estén bien establecidos para ayudar a la formación de heterocromatina. Aquí, presentamos un método simple y rápido pero eficiente para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina. El cribado se realiza mediante el tratamiento de Drosophila con una biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas. Este método aprovecha un fenotipo de color de ojo variado en la cepaDrosophila DX1que está influenciado por los niveles de heterocromatina. Las moscas DX1 contienen una matriz en tándem de siete transgenes P[lac-w], que tienen la expresión/depresión variada dependiendo de la heterocromatización, por lo tanto, el grado de variegación en el color de los ojos refleja el nivel de heterocrocromatina. Específicamente, el aumento de la heterocromatina podría ser detectado por la creciente proporción de color ocular variado (ojo blanco). Por el contrario, la disminución de la heterocrocina se detectaría por la creciente proporción de la expresión transgénica P[lac-w] (ojo rojo)9,10,11,12.
Por lo tanto, aprovechamos este sistema de transgénesis Drosophila que produce un fenotipo de color ocular variado ya que su expresión está directamente correlacionada con la cantidad de heterocrocina presente. Tras el descubrimiento de compuestos que se sospecha que promueven la formación de heterocromatina, podemos confirmar esta sospecha utilizando otros métodos como la mancha occidental. Estas sustancias promotoras de heterocromatina pueden desarrollarse aún más para ensayos clínicos en pacientes en el futuro.
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Protocol
1. Preparación de la biblioteca de medicamentos
- Identificar y preparar una biblioteca de medicamentos para ser examinado utilizando el disolvente adecuado a la concentración deseada (por ejemplo, 10 mM en DMSO).
NOTA: Un ejemplo específico de una biblioteca de medicamentos es el Programa de Terapéutica del Desarrollo (DTP) Set III del Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Los compuestos de este conjunto se proporcionan como 20 l a 10 ml en 100% DMSO en dos placas de fondo en U de 96 pocillos y se almacenan a -20 oC. Los mapas de la placa NCI, y los datos químicos básicos de cada medicamento se pueden encontrar en los siguientes sitios web:
Número de placa NCI 4740
Número de placa NCI 4741
2. Pantalla para detectar medicamentos que promueven la heterocromatina usando Drosophila
-
Drosophila Estrategia de cría (Figura 1A)
- Día 1: Cruz tres w1118/Y; DX1/CyO moscas macho y tres o más moscas vírgenes w1118 hembra en un vial de alimentos de 25 mm x 95 mm con 9 ml de medios alimenticios Drosophila estándar (receta Bloomington). Configure tres viales de réplica para cada medicamento y un control para la pantalla.
NOTA: Las moscas DX1 fueron amablemente proporcionadas por James Birchler (Universidad de Missouri)9,13. - Día 2 y Día 3: Permita que las moscas pongan huevos durante 2 días a temperatura ambiente (22oC).
- Día 4: Use una ráfaga corta deCO2 de gas para anestesiar a las moscas madre y deshacerse de las moscas principales en una "morgue de moscas" (una botella que contiene 70% de alcohol).
- Día 1: Cruz tres w1118/Y; DX1/CyO moscas macho y tres o más moscas vírgenes w1118 hembra en un vial de alimentos de 25 mm x 95 mm con 9 ml de medios alimenticios Drosophila estándar (receta Bloomington). Configure tres viales de réplica para cada medicamento y un control para la pantalla.
- Alimente los medicamentos a Drosophila para su detección.
- Diluir cada compuesto de fármaco de la población original (20 ml a 10 mM en DMSO 100% en placas de fondo u de PP de 96 pocillos) a una concentración final de 10 M con 33% de DMSO en agua. Use 33% DMSO en agua sin ningún medicamento como control.
NOTA: Algunos medicamentos son poco solubles en agua y se disolvieron en DMSO. 100% DMSO es tóxico para las moscas. El 33% es tolerable. - Día 4: Pipeta de 60 ml de una solución de drogas de 10 m o control sobre la parte superior de los alimentos con mosca. En este punto, asegúrese de que las moscas madre han sido removidas y hay huevos de mosca y larvas de primera estrella arrastrándose en la comida.
- Día 6: Repetir el pipeteo de 60 ml de la misma solución de medicamentos de 10 m al vial de alimentos.
NOTA: Dado que se añadieron medicamentos en los alimentos con mosca, el alimento de la superficie superior contiene una concentración de casi 10 m y el alimento inferior no se pudo penetrar completamente. Todas las moscas ponen huevos en la parte superior de la comida y comen la parte superior de la superficie de los alimentos.
- Diluir cada compuesto de fármaco de la población original (20 ml a 10 mM en DMSO 100% en placas de fondo u de PP de 96 pocillos) a una concentración final de 10 M con 33% de DMSO en agua. Use 33% DMSO en agua sin ningún medicamento como control.
- Observe y puntúe los cambios de color de los ojos.
- Dos días después de que las moscas F1 emergen (aproximadamente en el día 14), examine las moscas. Utilice una ráfaga corta de CO2 para anestesiar las moscas F1 y retire las moscas de su vial en una almohadilla de disección porosa con CO2 sin sumergir desde debajo de un papel de filtro.
- Inspeccione las moscas de esta almohadilla bajo un microscopio de disección. Examine toda la mosca e identifique todo w1118/Y; DX1/+ machos heterocigotos por su falta del fenotipo dominante de ala rizada CyO.
- Puntuar el color de los ojos de cada uno de los w1118/Y; DX1/+ macho heterocigoto vuela en una escala de 1 a 5(Figura 1B). El porcentaje de color de ojos blancos se calificó de la siguiente manera:
1. <5% rojo área de superficie total del ojo disperso
2. 6% - 25% manchas rojas manchas manchas superficie total
3. 26% - 50% manchas rojas manchas manchas superficie total
4. 51% - 75% manchas rojas manchas manchas superficie total
5. >75% manchas rojas de la superficie total del ojo
NOTA: Alternativamente, homogeneice las cabezas volantes en 100% de metanol y utilice un espectrómetro para medir la pigmentación ocular a 450 nm. Seleccione sólo machos porque PEV es más pronouced en DX1 machos. Puntuar más de 10 machos en cada vial. - Calcular el índice de color medio de todos los machos de cada vial puntuado. Realizar triplicados para cada compuesto(Figura 1C).
NOTA: Dado que el color de los ojos varía según la edad, este es un paso sensible al tiempo. El color de los ojos debe calcularse a la misma edad – 2 días de edad. Por lo general >10 moscas deben ser puntuados en cada vial. - Para confirmar que los compuestos efectivamente promueven la formación de heterocromatina, utilice una técnica diferente como la hincha occidental para validar (Figura 1G).
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Representative Results
Este protocolo se utilizó con éxito para detectar compuestos que promueven la formación de heterocrofina en Drosophila,que es un sistema in vivo eficiente y de bajo costo para el desarrollo de fármacos(Figura 1). Hemos examinado una biblioteca de fármacos de molécula pequeña, Oncology Set III, que se compone de 97 medicamentos oncológicos autorizados por la FDA, utilizando la cepa DX1 de Drosophila melanogaster (Figura 1B). Los resultados de un medicamento significativo se representaron en un gráfico de barras(Figura 1C,D). Según el ensayo de cribado, el metotrexato (4-aminopteroylglutamic acid), que se codifica como E7 en la biblioteca, causó la mayor variedad en la cepa DX1, lo que sugiere que el metotrexato podría ser el fármaco de promoción de heterocromatina más prometedor para la terapia dirigida al cáncer futuro(Figura 1E,F). Para confirmar aún más que esto está probando efectivamente los compuestos que promueven la formación de heterocromatina, los datos de la mancha occidental muestran que la proteína asociada a la formación de heterocrocritina H3K9me3 está regulada(Figura 1G),verificando aún más que el metotrexato podría ser el fármaco que promueve la heterocrofina más prometedor.
Figura 1: Una ilustración de la detección de drogas en Drosophila. (A) Metodología de la pantalla Drosophila. Una visión general del esquema para el cribado de compuestos que promueven la heterocromatina mediante el uso del modelo Drosophila. Tres w1118/Y; Dx1/CyO machos y tres vírgenes w1118 se cruzan atemperatura ambiente. A continuación, retire las moscas adultas en el día cuatro y agregue 60 ml del medicamento de 10 m disuelto en 33% de solución de DMSO a la parte superior de la comida de mosca en el día cuatro y el día seis, respectivamente. 33% de solución DMSO se utilizó como un control. Se observó la relación de color de ojos (blanco a rojo) de la generación masculina F1. (B) Análisis y puntuación del fenotipo del color de los ojos. Imágenes representativas del color de los ojos que muestran un fenotipo variado. El porcentaje de variegación del color de los ojos fue clasificado como sigue: 1, 1-5% manchas rojas en la superficie total; 2, 6-25% manchas rojas en la superficie total; 3, 26-50% manchas rojas en la superficie total; 4, 51-75% manchas rojas en la superficie total; y 5, >75% manchas rojas en la superficie total. (Barra de escala a 200 m) (C) Cada fármaco se ensayó como los valores medios de tres experimentos independientes (desviación estándar). La barra roja muestra el control. (D) Resultados de la escala realizada en el medicamento E7 y control. Las diferencias entre E7 y los grupos de control se consideraron significativas si los valores P eran <0.05 (*) por la prueba t del estudiante (E) La estructura molecular de un compuesto químico que denominaE 7 utilizado en la biblioteca de fármacos de ejemplo. (F) Imágenes representativas de los ojos de mosca en E7 y grupo de tratamiento de control. (Barra de escala, 200 m) (G) La mancha occidental se realizó con anticuerpos específicos para H3K9me3, H3o -Tubulina utilizando la proteína total de larvas de3a instar sin o con tratamiento con metotrexato a las concentraciones indicadas. Esta cifra ha sido modificada de Loyola et al14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La heterocrocrotina es una forma condensada de ADN que desempeña un papel central en la regulación de la expresión génica. Cada vez es más reconocido en el cáncer y puede servir como un objetivo potencial para la terapia oncológica15,16,17,18. Compuestos de molécula pequeña se utilizan comúnmente en el desarrollo de fármacos debido a las ventajas en la fabricación, preservación, y el metabolismo en los cuerpos humanos. Para identificar compuestos de moléculas pequeñas que promueven la heterocrocritina, se diseñó y presentó un método eficiente utilizando la cepaDrosophila DX1,que ha demostrado afectar el color ocular de las moscas de una manera dependiente de la heterocrocritina(Figura 1).
Nuestro protocolo de cribado es un sistema in vivo simple, económico y fácil de seguir para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, una limitación de la estrategia de cribado es determinar una concentración efectiva de fármacos. La mosca de la fruta hembra pone sus huevos en la superficie de la mosca semisólida. Para el tratamiento farmacológico, pipeteamos la solución de drogas a la superficie de los alimentos, que se supone que contiene una concentración predeterminada. Sin embargo, dado que diferentes fármacos podrían tener diferentes eficiencias en la difusión de la parte inferior de los alimentos, no se garantiza que la concentración de drogas sea consistente debajo de la superficie o hacia el fondo de los alimentos. A 10 m de concentración, rara vez se observó letalidad en larvas tratadas con cualquiera de los fármacos de la biblioteca que examinamos. Sin embargo, la mayoría de los fármacos causaron una letalidad severa a las larvas a una concentración de 100 M, lo que sugiere que la concentración de fármacos también podría considerarse como un factor importante para la pantalla.
Aquí, notamos que las repeticiones en tándem como las utilizadas aquí pueden desencadenar PEV por un mecanismo que difiere en algunos aspectos de lo que se ve en la heterocrocina pericéntrica. Un fármaco que afecta a PEV durante el desarrollo embrionario y larvario (la prueba descrita aquí) sólo identificará fármacos que impacten el mantenimiento de la heterocromatina en células somáticas y no identificará fármacos que impacten en la formación inicial de heterocromatina, que probablemente ocurra durante el blastodermo (ciclos nucleares 10-14). Sin embargo, esto podría ser un ensayo útil para una pantalla de inicio rápido.
Este protocolo es fiable y rentable debido a la sensibilidad de este cúmulo transgénico (DX1) a la formación de heterocromatina, reflejada por la cantidad de pigmentación roja presente en el ojo. Además, la corta vida útil de Drosophila hace que este protocolo sea más eficiente que otros organismos modelo como el pez cebra o las células humanas. Si bien es probable que haya un sistema genético reportero presente en el pez cebra que sea igual de sensible a los niveles de heterocrocromatina, su vida útil es mucho más larga que Drosophila y tardaría más en obtener resultados. Además, el uso de células humanas no sería posible ya que este protocolo se centra específicamente en el uso de cambios fenotípicos de la regulación epigenética para determinar los niveles de heterocromatina. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método in vivo eficiente para determinar qué molécula de fármaco pequeño podría servir potencialmente como candidato para suprimir oncogenes en terapias contra el cáncer. Mientras que el método de detección de fármacos Drosophila es un enfoque lento para identificar compuestos en comparación con algunos métodos de cribado in vitro, es relativamente sensible y nos permite probar compuestos in vivo. En combinación con el método de cribado celular, que es relativamente barato, fácil de realizar y es de alto rendimiento, el método de cribado Drosophila también podría utilizarse para confirmar los golpes como un método suplementario.
En resumen, con un interés en identificar compuestos para la investigación posterior y apuntar a la heterocrocina para la terapia oncológica, aunque el mecanismo en el que esto está ocurriendo aún no se entiende completamente, se realizó una pantalla simple con el fin de identificar medicamentos que promueven la heterocromatina. Descubrir una concentración baja en la que un medicamento puede promover la formación de heterocromatina podría ofrecer tratamientos más únicos que pueden resultar en menos efectos secundarios en comparación con los tratamientos de quimioterapia modernos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a J. Birchler, E. Bach y el Bloomington Drosophila Stock Center por varias cepas drosophila; el Programa de Terapéutica del Desarrollo del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) para la Biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas; Estudiantes de pregrado de la UCSD incluyendo Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza y Alex Chávez. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por una beca de investigación de la American Thoracic Society a J.L. y financiación de NIH: R01GM131044 a W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
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