Summary
翻译核糖体亲和纯化（TRAP）提供了以最少的器官和组织处理来解剖发育方案的可能性。该协议从绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚组细胞中产生高质量的RNA。下游分析工具（如 qRT-PCR 或 RNA-seq）可显示组织和细胞类型特定的表达特征。
Abstract
在本文中，我们给出了通过翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法和连续优化的低输入库制备从不同阿拉伯生物基系thaliana根细胞类型获取的翻译数据的实践说明。
作为起始材料，我们使用植物生产线，使用适当的促进剂，以细胞类型特定的方式表达GFP标记核糖蛋白RPL18。在免疫纯化和RNA提取之前，组织被卡扣冷冻，从而保持组织的完整性，同时允许以高时间分辨率执行时间序列研究。值得注意的是，细胞壁结构保持不变，这是替代程序的一个主要缺点，例如荧光激活细胞排序方法，依靠组织原面分离不同的细胞群。此外，无需像激光捕获微解剖技术那样组织固定，从而获得高质量的RNA。
然而，从细胞亚群的取样，仅分离多体相关RNA，严重限制了RNA的产生。因此，有必要应用足够灵敏的库制备方法，以便RNA-seq成功采集数据。
TRAP 为植物研究提供了理想的工具，因为许多开发过程都涉及与细胞壁相关和机械信号通路。利用促进剂瞄准特定细胞群，正在缩小器官和单细胞水平之间的差距，而单细胞水平又因分辨率小或成本非常高而受到影响。在这里，我们应用TRAP来研究侧根形成的细胞-细胞通信。
Introduction
在下一代测序技术日益应用的推动下，空间分辨率在发育生物学中可以增强。当代研究旨在解剖组织到专门的细胞类型，如果不是单细胞水平11，2，3，4。2,3,4为此，在过去五十年中，已设计了大量不同的方法（见图1A）5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。,14,,7,8,9,10,11,12,135,6 Figure 1A15
植物科学中的许多工具都是对动物研究首创的技术的适应。我们在此处详细介绍的方法不是这样。2005年，凭借蛋白质翻译的强势背景，贝利-塞雷斯实验室开始设计核糖蛋白，用于后续的亲和力纯化16。因此，它们可以避免耗时和劳动密集型的多体分析，这是基于超中心与蔗糖梯度，并用于评估翻译核糖体自20世纪60年代17，18。17,该方法自即被称为转化核糖体亲和纯化（TRAP）16。在成功的植物翻译研究后，Heiman19等人将其应用扩展到酵母20、果蝇21、异种鱼23、24。,2422
虽然模型系统的遗传改造是TRAP的先决条件，它将其应用限制在适应遗传转化的物种，人们可以同时利用这种异议，以针对特别感兴趣的细胞子集，否则极难从完整的组织/器官25（例如，在小鼠大脑中高度分支的树突状细胞或受感染的植物组织中的真菌催眠）。在植物中，所有细胞都通过细胞壁固定到位，形成静水骨架26的基础。为了将植物细胞从这个基质中释放出来，科学家要么通过激光捕获微切（LCM）27从周围组织中物理地切27出细胞，要么对细胞壁进行酶消化28。在后一个细胞中，所谓的正代，感兴趣的种群被荧光标记，可以通过荧光激活细胞分拣（FACS）7分离。7LCM通常需要将样品固定并嵌入蜡中，这最终会降低其RNA29的质量。基于FACS的方法产生高质量的RNA，但提供过程本身引入了基因表达的差异30和具有修饰和厚的继生细胞壁组织是出了名的难以治疗。此外，植物中的许多发育过程被认为是依靠机械传输的信号，因此细胞壁的完整性是最重要的31。两种方法，使用快捷方式，通过在核水平上操作来规避细胞分离，是荧光激活核分拣（FANS）和特定细胞类型（INTACT）标记的核分离。与TRAP一样，它们使用细胞类型特定的促进器来标记核，然后通过排序或拉下获得丰富，分别为,8，15。所有这些方法的一个主要挑战是从组织中的细胞子集获得足够的RNA材料。由于 TRAP 只捕获蜂窝 RNA 的一小部分，因此样本采集是一个相当大的瓶颈。因此，需要特别敏感的库准备协议来生成低输入量的高质量数据。
自建立以来，TRAP 要么与 DNA 微阵列结合使用，要么随着近年来测序成本的显著下降，RNA-seq 10、32、33 。10,32,33在Sablok等人34日回顾了许多研究问题。我们相信，在未来几年中，将会有更多的报告，因为结合不同的启动子来靶向特定的细胞类型时，该技术非常通用。最终，即使以可诱导的方式完成，也可以结合探测植物对许多生物和非生物应激因素的反应。此外，在没有稳定的转基因线的情况下，毛茸茸根表达系统也已成功用于在番茄和药质35，36,36中执行TRAP。
图1：翻译核糖体亲和力纯化（TRAP）补充了"经济学"分析组合。A.通过大量方法或组合，可以提高分析精度，甚至单细胞甚至亚细胞分辨率。该计划概述了目前在植物和动物领域可用的工具。细胞分辨率下的组织收集可以通过LCM或FACS等协议实现，然后与标准转录组或多体分析/翻译分析耦合。TRAP 和 INTACT 将组织捕获和 RNA 分离结合在一起，因为它们基于表上标记。然而，INTACT只样本细胞核，因此，构成转录分析的特殊情况。一个小兔子图标标记了动物领域新开发的方法：虽然SLAM-ITseq和Flura-seq依赖于在表达放任性酶的细胞中具有改性尿素碱的新生RNA的代谢靶向，Slide-seq使用带有DNA条形码的涂层玻璃幻灯片，在细胞范围内提供位置信息。APEX-seq 中遵循接近标记方法，在特定亚细胞隔间中对 RNA 进行采样。值得注意的是，分辨率提高通常需要生成转基因材料（星号），因此这些方法主要用于模型物种。TRAP 特别适用于涉及细胞壁 （CW） 或机械信号的植物科学研究，以及难以从其 CW 基质中释放的细胞物种。B. TRAP程序的详细湿实验室步骤：在不同细胞类型（如根内皮）中表达GFP标记核糖蛋白的幼苗在培养皿上生长7天，通过卡扣冷冻收获根料。在通过离心对碎片进行颗粒化之前，从均质原油提取物中采集总RNA控制样本。磁性抗GFP珠被添加到清除的提取物中，以执行免疫沉淀。孵化和三洗步骤后，通过酚-氯仿提取直接获得多体相关RNA（TRAP/多体RNA）。LCM：激光捕获微切解剖，FACS/FANS：荧光激活细胞/核分拣， APEX-seq：基于工程抗坏血剂过氧化物酶的方法，INTACT：特定细胞类型中标记的核分离，SLAM-ITseq：用于组织RNA代谢测序的THiol（SH）相关烷基化，Flura-seq：氟酸酯标记RNA测序（用Biorender.com创建）请点击这里查看这个数字的较大版本。
本文的目的是提供 TRAP 方法的详细说明，以突出显示关键步骤，并为可能的库准备方法提供指导。
通用 TRAP 实验将基本包括以下步骤（另见图1B）：（1）植物材料的准备，包括核糖体标记结构的克隆、转基因生产线的生产和选择、种子的生长和扩充、灭菌和电镀以及应力应用/处理（可选）和组织收获;（二）免疫纯化，包括组织均质化、清纯粗提取物、珠洗、免疫净化、洗涤步骤;（3） RNA提取和质量评估;（4） 图书馆准备。
阿拉伯植物根自引进示范植物37、38,38以来，一直是研究植物发展的示范系统。在这里，TRAP的应用在植物横向根开发的背景下被展示出来。在植物中，整个根系的建立依赖于这个程序的执行，因此对生物体39的生存非常重要。在Arabidopsis中，侧根起源于位于赛莱默血管旁边的围轮组织，因此被称为木质杆围轮（XPP;参见图2C）40。40一些XPP细胞，位于根的深处，获得一个创始人细胞的身份，并在局部荷尔蒙触发下，开始通过肿胀和分裂41开始增殖。然而，由于存在刚性细胞壁基质，这一过程对周围的组织施加机械应力。特别是，覆盖内皮受影响，因为它是在横向根生长轴42，43，4443,44的方式。42事实上，新形成的原体将不得不通过覆盖的内皮细胞（图2C2）生长，而皮层和表皮细胞只是被推到一边，使原体最终出现45，46。,46我们实验室最近的工作表明，内皮病正在积极推动适应围周期的增殖。靶点阻塞内皮激素信号足以抑制甚至第一分裂在XPP细胞47。因此，围周期-内皮斯通信是阿拉伯细胞横向根系发展的一个早期检查点。然而，不知道这个相声是如何进行的。为了解开这个谜团，我们选择了TRAP-seq方法来瞄准XPP和内皮细胞。为了丰富横向根程序中的细胞，我们通过外生应用辅助辛酸（1-naph甲酸，NAA）48来模拟荷尔蒙触发，同时允许暂时解决侧根形成48的初始阶段。
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Protocol
1. 转基因克隆、转基因生产线生产和选择
- 在适当的入口矢量中克隆所选择的启动子。使用基于重组的克隆方法（材料表），并使用pDONRP1-P249中基于重组的克隆重新组合pDONRP4-P1r.克隆RPL18（具有亲和力标记或荧光蛋白）。
- 使用 FAST-RED 选择盒50将包含RPL18的入口矢量与包含启动子的入口矢量在两个片段重组反应中合并到适当的目标矢量中，以方便直接选择转基因种子。
- 通过测序验证重组的病媒，并将其转化为合适、称职的农细菌。花浸阿拉伯植物和3-4周收获后，选择T1种子51。
- 使用显微镜识别表达良好的行，并根据多个独立行中报告的启动器活动验证表达模式。选择显示具有代表性的表达模式的线，并插入单个 T-DNA。这可能有助于减少沉默，并将有利于遗传交叉。
- 选择标记基因的同源基因T3后代。
2. 传播和灭菌
- 细胞类型特异性TRAP从每个根的有限数量的目标细胞中分离RNA。要生成所需的起始材料，应传播同源线。为此，使用标准生长条件，特别注重真菌生长控制。
注：如果无法获得单插入线，则在几代大种群中成批生长，以避免T-DNA引起的跨代沉默。 - 用一轮氯气和一轮70%的EtOH对大量阿拉伯化种子进行消毒。
- 将种子均匀地铺在 12 厘米 x 12 厘米方形培养皿（小于 0.3 mL 种子/板）上，并将其放入干燥器或其他合适的容器中。避免团状或堆形成，因为种子需要接触气体。在漂白剂和 HCl 体积下进行气体灭菌，报告为52： 100 mL 漂白剂 （13%）60 L 干燥器中具有 6 mL 的 Conc. HCl。在无菌容器中收集种子之前，请至少1小时进行脱泡。
注意：37% HCl 具有高度腐蚀性，需要小心处理。氯气是有毒的，使用烟气罩。 - 每盘取0.1 mL干式气体灭菌种子，并在室温下与灭菌溶液（70%EtOH，0.01% Tween）混合。孵育20分钟，切碎EtOH，用无菌H2O洗涤种子3-4次。
- 将浸泡的种子转移到50 mL管中，用无菌0.1%的龙gar稀释，每盘获得1 mL浸渍种子浆料（0.1 mL种子/1 mL浆）。
注：由于转基因整合事件，植物系可能容易受到不同的灭菌技术的影响;特别是EtOH孵育时间被发现是至关重要的。在我们手中，双灭菌步骤是必要的，以避免真菌污染在实验期间。当执行时间序列时，这一点尤其重要，因为单个时间点的污染会妨碍整个实验。很可能，根据当地的生长条件，并不总是需要双重灭菌。
- 将种子均匀地铺在 12 厘米 x 12 厘米方形培养皿（小于 0.3 mL 种子/板）上，并将其放入干燥器或其他合适的容器中。避免团状或堆形成，因为种子需要接触气体。在漂白剂和 HCl 体积下进行气体灭菌，报告为52： 100 mL 漂白剂 （13%）60 L 干燥器中具有 6 mL 的 Conc. HCl。在无菌容器中收集种子之前，请至少1小时进行脱泡。
3. 电镀
- 提前准备这些步骤。在实验所需的量中浇注 1⁄2 MS 板 （pH 5.8）， 加盖为 1% agar（每个样品/时点 20-30 个）。切割 1 mL 移液器尖端，用剃刀刀片将尖端直径放大至约 3-4 mm。高压提示。创建模板支架，用于用方形培养皿盖为每个板电镀三排种子。准备层状流量罩，提供无菌工作环境，并标记要处理的板。
注：如果同时处理许多板，彩色标签可以加快标签。 - 将空的 agar 板放入模板支架中，将 1 mL 浸埋种子均匀地分布到三行上。将加工的板放入层状流中，直到种子干燥（即粘在加面上）。不要让盘子变长，因为加盘也会干涸。
- 一旦种子足够干燥，关闭盖子，用微孔胶带密封每个板。在黑暗中将种子分层两天，在4°C下，然后把它们放入生长室。
4. 组织治疗（可选）
注：在此协议中，我们概述了合成辅助基因中NAA对阿拉伯蛋白酶根的外源处理。根据手头的实验问题，需要调整或完全省略此部分。
- 准备1.5 - 2厘米高、10厘米长的纸巾条。延长的孵育时间要求组织在使用前进行解剖。
- 从所有必须接受激素治疗的板中取出微孔胶带。在 1 L 液体中稀释 1 mL 10 mM NAA（溶解在 DMSO 中），对 1⁄2 MS 溶液（pH 5.8）进行自切除，并将纸巾浸泡在溶液中 （10 μM NAA）。
- 使用钳子将一条纸巾涂在每排根上。轻轻地用手指去除气泡。从盘子中倒出多余的液体，关闭盖子，用时间标记盘子。对于延长的孵育时间，将板放回生长室。
5. 收获
- 检索每个生物复制/时间点/处理的板。收集液氮在干净的Dewar容器和标签管（15或50 mL）为不同的组织样本。准备发泡胶支架。
注意：熟悉液氮处理程序（曝气、冻伤、潜在爆炸管）。 - 打开板，用钳子取出纸巾，小心不要从加面上分离根部。使用手术刀片，在单次确定的行程中沿射根结每行切割一次。清洁样品之间的刀片并频繁更换，以确保锐度。
- 使用钳子，沿每行的根部轻扫以收集它们三个捆绑包。抓住根部，将其倒入一个装满液氮的 50 mL 管中，以卡死。
注：不要试图将根部组装成致密的结构（如球），因为它们在下一步中很难磨碎。 - 继续所有构成一个样品的板（按孵育时间顺序），并倒出多余的液氮。使用管盖防止根部溢出。然后关闭盖子，收集德瓦尔容器中的所有管。将根组织储存在-80°C。
6. 免疫净化
注：此步骤旨在获得高质量的 TRAP/多体RNA。因此，严格遵循RNA处理的良好做法建议。在无菌工作台上执行本节中的所有步骤，并使用 RNase 去除溶液（材料表）清洁所有设备和实验室软件。当样品、冰块或其他未清洁的源受到污染时，戴上手套并立即更换。由于这是一个非常重要的方面，因此包括关于设备再利用的一节以及废物处理建议。
- 缓冲准备
- 根据表 1和高压灭菌器 （A） 准备库存解决方案或过滤器消毒 （*）。除非另有说明，否则溶剂为无无Nase水。
- 如表1所示，在各自的溶剂中溶解和分值二硫磷醇（DTT）、苯乙二硫芬基氟化物（PMSF）、环己烷（CHX）和氯霉素（CAM），并将其储存在-20°C。所有其他股票可以保持在室温。
- 预混合库存 - 与成分 1-4 用于洗涤缓冲液 （WB） 和 1-6 用于多体萃取缓冲液 （PEB） ） - 以避免每次萃取前耗时的缓冲混合。因此，仅在提取当天加入水和冷冻成分（7-10）。将预混合库存和无 RNase 水保持在 4 °C。
注：DTT浓度是Zanetti等人2005年报告的浓度的1/5，因为与GFP的nann相互作用对高DTT浓度敏感。
| 成分 | 库存浓度 | 为 50 mL 的 WB* 添加 mL 的体积 | 50 mL PEB 的体积以 mL 添加* | ||
| 1 | 三重奏，pH 9 | A | 2 米 | 5 | 5 |
| 2 | 氯化钾 | A | 2 米 | 5 | 5 |
| 3 | EGTA | A | 0.5 M | 2.5 | 2.5 |
| 4 | 毫克Cl2 | A | 1 米 | 1.75 | 1.75 |
| 5 | Pte | A | 20%（v/v） | 0 | 2.5 |
| 6 | 洗涤剂混合物 | A | 0 | 2.5 | |
| 补间 20 | 20%（v/v） | ||||
| 特里顿-X 100 | 20%（v/v） | ||||
| 布里杰-35 | 20% （v/v） | ||||
| 伊格帕尔 | 20%（v/v） | ||||
| 7 | DTT | ₳ | 0.5 M | 0.1 | 0.1 |
| 8 | PMSF | ₳ | 0.1 M （异丙醇） | 0.5 | 0.5 |
| 9 | 环氧西米德 | ₳ | 25毫克/米升（埃特霍） | 0.1 | 0.1 |
| 10 | 氯霉素 | ₳ | 50毫克/米升（EtOH） | 0.05 | 0.05 |
表1：缓冲组成和混合建议。给定库存浓度混合在给定量中的成分可产生 50 mL 的 WB 或 PEB。三酯：三酯-（羟基甲基）-氨基甲烷，EGTA：乙二醇-乙二醇（β-氨基乙醚）-N、N、N'-四乙酸、PTE：聚乙烯-（10）-三丁基乙醚，A：高压灭菌器，*：过滤器-灭菌;•使用无RNase水填充高达50 mL。
- 组织均质化/研磨
- 冷却离心机，将同质器和离心管放在冰上。解冻 DTT、PMSF、CHX 和 CAM 的等号。根据当天的要求（样品*）将50 mL管中的库存溶液中的PEB和WB混合，并在冰上冷却。
注：仅在使用前不久添加 PMSF，因为 PMSF 在水中的半衰程仅为 30 分钟。 - 在 Dewar 容器中准备大量液氮，并从 -80 °C 储存中检索组织样本。在标准实验室手套下方佩戴棉手套，以防止冷砂浆灼伤。将液氮倒入砂浆和虫子中，直到其足够冷，以便进行研磨。建议设计一个系统来区分迫击炮（标签或保持一定顺序）。
- 空组织样品进入砂浆并仔细研磨，直到所有材料都是白色粉末。如果需要，加入液氮以保持组织冻结或促进更好的研磨。
- 在样品中加入 5 mL PEB，并在缓冲液冻结前快速与粉末混合。当此示例解冻（不时混合）处理另一个样本时。
- 一旦混合物可以转移，将浆料倒入玻璃均质器中，并保持在冰上。再加2 mL PEB，冲洗砂浆并缠住，并将其添加到均质剂中的样品中。
注：避免完全液体样品，因为这允许RNA降解。 - 手动研磨浆料，直到提取物均匀。我们建议至少 4 到 5 次跳水。
注：可能需要一些额外的等待时间，以便泥浆进一步解冻。处理均质器需要一些勤奋。不要使用蛮力和小心吸力。如果不加考虑，这将导致均匀器的溢出、污染或破坏。 - 将粗根提取物倒入 50 mL 离心管中（保持冰）。
注：通常几个样品可以在转移前接地。需要平行处理磨削、转移和均质化。尽量快点工作，但不要匆忙;保持冷静。始终将均质样品保存在冰上。
- 冷却离心机，将同质器和离心管放在冰上。解冻 DTT、PMSF、CHX 和 CAM 的等号。根据当天的要求（样品*）将50 mL管中的库存溶液中的PEB和WB混合，并在冰上冷却。
- RNA 样本收集总量
- 将每个粗样品的 200 μL 等分转移到干净的微离心管（事先在冰上标记和冷却）。
- 继续RNA提取，如第7.1点和7.2点中TRAP样品的详细详细内容。当样品在离心机中清除时，执行这些步骤。
- 使用重新悬浮的总RNA进行DNase处理，以消除DNA污染，并使用商业试剂盒（材料表）清理反应。
注：总RNA萃取通常产生高浓度，样品需要大大稀释。我们建议通过敏感的Qubit协议测量稀释后的浓度。
- 清除原油提取物
- 将装有 6.2.7 样品的冰桶放在 16，000 x g和 4 °C 下，将其离心 15 分钟。
注：要平衡离心机，应相应地对样品进行配对。如果不能完全可能，请通过添加 PEB 调整一个样本。 - 将上清液倒入新鲜的离心管（事先在冰上冷却）和重复离心（15 分钟，16，000 x g和 4 °C）。此转移可在离心机旁边快速执行。
- 当原油萃取物清除时，开始清洗步骤 6.6 的 GFP-珠。
注：保留这个冰桶在摇床上摇动，但不要放回无菌的长凳上，因为它可能被污染。
- 将装有 6.2.7 样品的冰桶放在 16，000 x g和 4 °C 下，将其离心 15 分钟。
- 珠洗
- 阿利quot磁性 GFP-珠（#samples x 60 μL，材料表）成 1.5 mL 管。放在磁性支架上。收集珠子后，取出上清液。
- 加入 1 mL 的冷 WB，重新悬挂珠子并再次收集它们。丢弃洗涤缓冲液，用 1 mL 的 WB 重复一次。
- 最终，将 WB 中的珠子重新挂起到步骤 6.5.1 中使用的初始体积。
- 免疫纯化（IP）
- 离心后，立即将清除的上清液倒入标有15 mL的管中，并每样品加入60μL的洗珠。
- 将所有样品水平放入冰桶中，并将其放在摇床上。让混合物孵育2小时，以便将 GFP 标记的多体与珠子结合。
- 收集磁架上的珠子，用于 15 mL 管（冰上），并将 PMSF 添加到剩余的 PEB 中。丢弃上清剂。将大约 5 mL 的 PEB 倒入珠子，然后倾斜重新悬挂它们。与第 6.6.2 节中相同的设置中摇动样品 15 分钟。
- 使用 WB 重复洗场，总共 3 次洗（1 x PEB，2 个 WB）。在每次缓冲区交换之前，添加 PMSF。
- 将珠子收集在 1 mL 的 WB 中，并将其转移到 1.5 mL 管中。最后，在磁架上再收集一次珠子，并去除所有液体。关闭管子并保持冰，直到处理所有样品。
- 将样品运送到烟雾罩进行RNA提取。
- 废物处理和实验室用品的修复。
- 如果按照良好的实验室实践执行（参见第 2.2.1 节），灭菌程序会产生水性 NaCl 溶液。将氯气以及残留的 HCl 和漂白剂留在烟雾罩中。
- PEB 和 WB 处置：当 CHX 在高 pH 时分解，收集所有液体并带到 pH>9。处理卤化化学废物中的液体废物。所有固体（组织、血清学移液器、手套等）应作为化学废物处理。
- 分别收集含苯酚的液体以及酚类污染物质（提示、管和手套）。
- 用肥皂洗手砂浆、虫子和均质器（海绵和刷子），彻底冲洗。随后，在 >220 °C 下烘烤材料过夜。在处理前用锡箔包裹，或放入防热、覆盖的容器中。
- 用洗涤剂刷干净离心管，然后在烟罩中处理二乙丙酸酯（DEPC）。为此，将液体 DEPC 添加到去离子水中（1 mL DEPC 到 1 L 的 H2O），并通过摇动混合。将离心机管放在可分离的托盘上，以捕获溢出的 DEPC 水。将悬架倒入管中，离开 3 小时或过夜。DEPC 在后续的高压灭菌过程中分解。
注意：DEPC 是剧毒的。
7. RNA 提取和质量控制
- RNA 提取
- 将桌面离心机冷却至 4 °C。
- 在每个样品中加入1mL的酸碱-酚基试剂（材料表），倒置以重新悬浮珠子或总RNA浆，并在冰上孵育5分钟。不要旋涡！
- 加入200μL的氯仿，在冰上孵育3分钟。然后彻底涡旋样品。
- 为了帮助相分离，最大离心机。速度为10-15分钟，4°C。
- 标签 1.5 mL 低保留管 （材料表） 和等分 650 μL 异丙醇到每个。
- 小心地取上水相（约650 μL），并转移到制备的管与异丙醇。避免接触粉红色有机相。
- 在-20°C下一夜之间沉淀RNA。
注：建议将样品储存在异丙醇中，温度为-20°C或-80°C，并在需要时仅在水中溶解。水性RNA即使在-80°C下，在储存数周/数月时也会降解。
- RNA沉淀
- 将桌面离心机冷却至 4 °C。
- 使用无RNase水制备新鲜的 80% EtOH，并在 -20°C 下冷却（在 -80 °C 下 5 分钟有助于加快工艺速度）。
- 以最大速度离心样品（约13，000 x gg），30分钟，并丢弃上清液。颗粒将不可见，如此仔细移液，就好像它在那里。加入 1 mL 的冷 80% EtOH 并反转管一两次。
- 以最大速度再次离心30分钟，并重复洗涤，共洗涤两次。
- 向下旋转 2 分钟，用 10 μL 尖端去除所有残留的 EtOH。在室温下，将颗粒干燥 3-5 分钟（不要更多），并在 20 μL 无 Nase 水中重新悬浮。
- 将样品放在冰上，并尽快进行质量控制。继续将样品储存在-80°C。避免冻结-解冻循环。
- 根据制造商的建议，使用专用设备（材料表）进行质量控制。
8. 图书馆准备
- cDNA合成和放大与SMARTer v4超低输入RNA套件
- 计算每个样品的稀释，以4.75μL的体积计算1.5纳克的TRAP-RNA或总RNA。 在PCR管中执行所有反应，用无RNase水的新鲜等值点稀释样品。
- 根据制造商的建议，使用 1/2 反应体积执行所有步骤。使用 12-13 PCR 周期放大 cDNA。
- 通过添加 0.5 μL 的 10x 集塞缓冲液和 25 μL 的 SPRI 磁珠（材料表），清理 PCR。如果处理许多样品的液化缓冲液和珠子可以预混合。确保珠子在移液前均匀分散。
- 以全反应体积（17 μL的洗脱缓冲液）继续处理协议。不要让珠子干燥超过3分钟。过度干燥的样品可以通过延长的潜伏时间来挽救。
- 使用Qubit HS DNA试剂盒测量样品浓度。
注： SMARTer v4 套件可以容忍到 200 pg 输入。在无法确定库比特值（低于 250 pg，检测限制）的情况下，我们确实获得了库，该值具有 16 个周期 PCR。但是，有限的输入材料也可能产生不太复杂的库。
- 使用 Nextera XT DNA 库制备套件进行碎片和适配器连接 PCR
- 用无RNase水稀释cDNA，获得PCR管中的浓度为200皮克/μl，移液器浓度为1.25μL。
- 根据制造商执行所有步骤，其反应量为 1/4。使用 12 个 PCR 周期和兼容适配器放大 cDNA，用于属于一个测序池的样本。使用 Illumina 的索引套件 A 和 D，可以多路复用多达 384 个样本。
- 对于 PCR 清理添加 12.5 μL 的重新悬浮缓冲液和 22.5 μL 的 SPRI 磁珠（0.9 倍比）。用22μL的洗脱缓冲液对样品进行脱脂。
注：QC和池由测序公司（材料表）执行，因此不需要基于珠子的规范化。酶分片反应（标记）对材料输入非常敏感，因为每个酶只切割一次。因此，不要超过浓度建议。
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Representative Results
在质量评估方面，应探讨上述过程的几个中间步骤：植物中的表达模式验证、分离的多体层RNA的质量控制以及最终库。此外，还可以使用已知标记基因进行qRT-PCR，以确认对治疗条件的反应或微调实验条件。
GFP信号分布的共聚焦分析
为了检查内皮和XPP表达模式，我们通过共聚焦显微镜分析了pELTP：：：GFP-RPL18和pXPP：：GFP-RPL18的同源线。图 2A和图 2B显示了具有 GFP 信号（绿色）的代表植物，这些植物已用碘化物（洋红色）进行反染色，以勾勒出细胞壁。图 2A1中的横截面显示来自外部的第三个细胞层中的同心环，该环对应于内皮。内皮GFP信号在甲酸酶区（图2A2）上方开始，出现在细胞素和细胞核周围，与核糖体相对应。相反，XPP 线具有两个不同的极点，对应于 XPP（图2B1）。每个极点大约三个细胞从美星区上方开始，以显示 GFP 信号。因此，这两条线分别符合内皮和XPP的本地化模式（图2C）53。53
多体RNA验证
为了确定获得多体RNA的质量，我们使用两个自动电泳系统（材料表）进行质量控制测量，该系统使用μL输入量，还计算RNA完整性号（RIN）54。54专有算法将 RIN 值分配给每个电谱图 1 到 10 之间，是 RNA 质量（即降解）的可靠和可重复的测量 - 值越低，样品的降解程度就越低。图 3显示了我们从多体RNA获得的测量示例。大多数样本几乎没有显示任何明显的退化与RIN值范围从9-10，这是符合以前的报告55，56。55,任何不当处理，尤其是长时间高温（如室温）或RNase污染，在此阶段都是显而易见的。两种仪器还计算其电图中的样品浓度（图3A）。这些可能有很大差异，并且大多处于较低的检测限制。因此，我们建议使用荧光测量来准确量化浓度。
图书馆质量控制
由于大多数实验室不在家里执行RNA测序，质量控制通常在具有高通量设备的专用设施中运行（材料表）。他们定期通过qPCR和荧光测量（材料表）评估质量并量化浓度，因为精确的测量是库池的先决条件。然而，如果图书馆的准备工作不是外包的，人们可以使用专门的设备（材料表）来对结果进行取样。图 4显示了使用我们推荐的协议 （A） 成功准备库的痕迹，并突出显示了尽管缩减了反应卷 （B） 该过程的鲁棒性。部件 C 说明了由于过度/不分碎裂、清理过程中的材料损失或适配器删除失败而导致的低于标准的示例。在后一种情况下，使用更严格的样品珠比进行另一次清理有助于消除污染。完全失败的样品在我们手中极为罕见，可能源自多个点（例如，对于测形标记反应输入过高）。
序列库的性能在图 4D中说明了我们突变背景中内皮的样本。来自 WT 和/或围轮的库的性能相似甚至更好。核糖核糖平均读数约为2%，只有很少的样本超过3%。平均质量得分高于 30 的读取在筛选之前一直高于 90%。序列读取的映射能力同样高，平均范围为 85%。为了确定生物复制对子斯皮尔曼系数之间的相关性，计算了每个时间点。所有测试都会产生高系数值。
治疗反应和浓缩分析
在生成基因组覆盖数据集之前，可以通过 qRT-PCR 探测试验实验中的 TRAP RNA，以验证治疗成功和/或实验条件。我们进行了这种类型的分析，以评估XPP样本中2小时后的辅助素反应（图5A）。通过 _Ct 方法57测试了三种不同的助生反应基因（GH3.3、LBD29 和 GATA23）。在潜伏期之后的三种情况下都观察到非常强烈的诱导，这表明外源NAA应用是成功的。
如果使用新开发的启动器，此时还应使用 qRT-PCR 执行浓缩分析。为此，一个已知的标记基因（即由所用的启动子驱动的基因）在TRAP中被放大，RNA样本和表达水平总水平正常化到总RNA水平。如果TRAP RNA与特定组织分离成功，应获得显著的褶皱变化。或者，可以从排序数据中检索等效信息（参见图 5B）。两个与生物素相关的基因，GPAT5和HORST的表达存在于所有内皮质样本中，明显不存在于XPP组织。相反，在内皮图中，围周期表达基因（PHO1和SKOR）的表达量很低，在XPP探针中具有辅助素诱导的向下调节， 在检查的时间段内。
图 2：阿拉伯根中 GFP-RPL18 的特定于单元格类型的表达式。A-B.pELTP的共聚焦显微镜图像：：GFP-RPL18（A）和p XPP：：GFP-RPL18（B）在发芽后六天内表达根部。XPP细胞壁轮廓是通过用碘化物（洋红色）染色获得的。横截面 A1 和 B1 分别来自 A2 和 B2 中分别表示的虚线的位置。后一个图像显示记录 z 堆栈的最大投影 （MAX）。C.在纵向（C1）和横截面（C3）以及横向根（C2）中组成阿拉伯根的组织类型的图解表示。该图像在 F. Bouché 的许可下进行了修改。刻度柱：100 μm.请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：TRAP/多体RNA质量评估。A.锥形站 - 14个测量样本的代表性结果，这些样本具有各自的 RINe值（左上图）。样本 A1（以蓝色突出显示）显示电谱图表示形式。右侧的表格会告知样品浓度。B.生物分析仪获得与 A 类似的痕迹。右侧的面板显示具有日益降低的降解水平的样本，这反映了其不断减少的 RIN 值。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：来自 TRAP/多体型样本的库配置文件。A.两个具有代表性的 TRAP 示例（左图）与 Nextera XT 用户指南推荐的成功库的跟踪非常吻应。B.不同的反应量产生可靠的库制备结果。C.结果不理想的库：极短的片段（左上角）、极长片段（左下角）、低浓度（右上）或完全失效（右下角）。另请注意在排序之前必须删除的剩余短片段（蓝色椭圆）。生物分析仪：红色痕迹，实验室芯片：蓝色痕迹。D. 选择不同时间点的序列 TRAP 样本（横向无根突变体的内皮）和在时间点内对所有样本的成对比较（n=65）之间计算的斯皮尔曼相关系数分布的选定质量度量。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：qRT-PCR和RNA-seq分别显示助辛反应能力和组织类型富集。A.通过qRT-PCR进行2小时辅助治疗后，对三个已知助辛反应基因的表达水平进行了评估。在所有样品中均观察到强感应。RT-PCR在3个独立的生物复制中进行，并归化为未处理的样品，UBC21作为内部参考基因。误差条代表SEM.GH3.3：格雷琴·哈根3.3，LDB29：横向边界域29，GATA23：GATA-motifLDB29GATA23结合转录因子23，UBC21：UBIQUITIN-CONJU-IN，21 UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B。 UBC21TRAP-seq 数据集中四个标记基因的表达水平。左侧的样本是内皮源（绿色阴影），而右侧的样本为 XPP 派生的（蓝色阴影）。数字以小时表示辅助辛孵育间隔。负 z 分数反映较低的表达水平，反之亦然。内皮标记基因（GPAT5，HORST）在内皮质样本中以高水平表达。 HORST相反，围周期标记（PHO1，SKOR）在SKORXPP细胞中具有高表达水平，并在辅助素治疗时表现出向下调节。GPAT5：甘油-3-磷酸盐2-O-acyl转移（suberin生物合成），HORST：根共生组织的羟基酶，PHO1：磷酸盐1，SKOR：stelarK SKOR =向外整流剂。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 6：非组织pUBQ10：：GFP-RPL18本地化模式。六天幼苗的共聚焦显微镜。细胞壁轮廓是通过用碘化物（洋红色）染色获得的。横截面 A2 和 C1 分别来自 A3 和 C2 中分别表示的虚线的位置。标记为 MAX 的图像显示记录 z 堆栈的最大投影。A1-A3.UBQ10驱动构造的统一本地化模式。B1-C2。外组织层信号强度显著下降。A、B 和 C 记录在三个不同的工厂中。刻度柱：100 μm.请点击这里查看此图形的较大版本。
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Discussion
验证 RPL18 本地化模式
避免任何 TRAP 实验的数据被误解的关键，是标记的核糖体子单位的正确表达模式。因此，将 GFP 作为表位标记与 RPL18 的上部标签非常优雅地允许验证所需的表达模式，并连续从同一组织中下拉多体分数。更多侵入性的方法，以确保适当的促进者模式遵循焦和梅耶罗维茨2010年，这需要GUS染色和在Tian等人2019年依靠免疫染色与抗FLAG抗体58，59。58,
我们强烈建议检查每一代的定位模式，因为T-DNA转基因线容易沉默，因此信号强度会恶化或表达种子的比例降低。在构造中包含 GFP 标记后，这些频繁的控制可通过显微镜轻松执行。
然而，即使彻底的共聚焦分析在某些情况下也会导致错误的结论。我们想强调这一点，我们未能尝试生成控制 TRAP 线。到目前为止，植物科学界尚未能够创建一个植物线，其均匀的RPL18分布在所有细胞层。即使是最初雇用的35S推广人也只归因于只显示"近组织"分布与非统一的本地化模式10。我们的方法是使用UBIQUITIN10 （UBQ10） 的启动器来驱动GFP-RPL18构造。T1 代的筛选提供了非常有前途的本地化，因此被选中进行传播（图 6Figure 6A）。然而，测试测序运行的数据在用于已知内皮系统特定基因的ELTP和UBQ10驱动线之间的比较中并没有显示出丰富的丰富性。仔细观察这些植物后，我们发现外组织层的信号减少，而石碑组织表现出强烈的表达（图6B）。未来的研究应寻找更合适的候选人的推动者景观，并补充TRAP方法。
总RNA作为对照样品
建立更好的TRAP控制线仍有待建立，该领域将高度期待。考虑到这一点，到目前为止，获得mRNA组织均匀分布的唯一方法是收集总RNA。在这种情况下，对转录因子进行了采样，这需要进一步的生物信息分析。值得注意的是，总RNA和多体RNA分数现在都相关，因为它们来自同一个组织样本。
在搜索 TRAP 库准备方法时
如前所述，TRAP方法的一个主要缺点是可实现的产量各不相同，而且大多很低。由于样品范围从几ng到有时高达100 ng，采用光明会TruSeq套件的标准方法（100 ng 输入要求）被认为对构建质量足够的库过于不敏感。市场搜索发现，一些商业上可用的图书馆准备套件，被指定使用低至5-10 ng起始材料。我们没有测试雷诺索等人2019年使用的协议，它适用于他们的TRAP样品从番茄，大米和美第药，并使用BrAD-seq方法60。
然而，我们所有的试验，以及随后的试验测序都产生了不令人满意的结果。尽管使用多A浓缩步骤，TRAP样品仍受到高核糖体污染（高达30%的读数）。此外，库制备的成功率是可变的，对于浓度极低或RIN值相对较低的样品，成功率尤其低。我们广泛的测试使我们得出结论，TRAP样品的特定RNA成分，具有非常高的rRNA含量和可能分钟的mRNA浓度，需要一种更敏感的方法来获得可靠的库。因此，我们转向超低输入量的最先进的解决方案：SMARTer v4 和 Nextera XT。令人欣慰的是，Song等人还发现，这种库制备方法在TRAPed肝组织61上测试了几种方法和测序输出时，优于竞争对手。我们在图 4D中介绍的质量指标以较低的 rRNA 映射率 （<3%） 显示高质量读取 （Q>30）同时与高基因映射率。此外，一贯高的斯皮尔曼相关系数显示，复制确实有非常相似的表达配置文件。这两个套件的使用简单明了，周期数适中，并产生了可靠可靠的结果。测序数据具有 1.5 ng 起始材料的高质量。SMARTer 套件的托气率低至 200 pg 输入，可以优化工厂起始材料的数量。对更稀有细胞类型的适用性最终将取决于产生足够RNA的可行性。
TRAP 补充植物科学工具包
TRAP方法越来越受到植物科学家的欢迎，我们相信，由于多种原因，它将获得标准技术的地位。
TRAP 协议中的步骤都不需要专用设备，如细胞分拣机或专用激光捕获显微镜，这使得许多实验室能够执行实验。迄今为止，最昂贵的因素是库准备和下游测序。然而，随着下一代测序技术的蓬勃发展和对单细胞测序需求的增加，我们预计成本将大大降低。
此外，与多体相关RNA的隔离意味着收集有关这些RNA（翻译）的活动转换状态的信息。因此，TRAP 捕获所有调节步骤的输出，这些步骤是翻译上游的，代表细胞蛋白成分的更直接代理。当然，停滞的核糖体和翻译后修改仍然难以捉摸，需要通过其他方法（例如蛋白质组学）加以解决。
如前所述，TRAP在植物环境中的一个明显优势是保存了CW结构和细胞的机械特性。由于我们才刚刚开始了解通过CW和机械信号31，62,62产生的错综复杂的连接和监管功能，保护这些结构的方法将在许多不同的发展环境中变得更加重要。
特别是对于成熟的模型物种，TRAP可以从具有特征的丰富不同促进者中获益。因此，在阿拉伯细胞中，通过使用19个不同的标记基因启动子30，63，可以以细胞类型特异性的方式绘制整个根30,63部。通过每次RNA-seq实验，这些选择将得到改善，新的，更具体的促进剂将会出现，并完善细胞分辨率。
TRAP 还适用于组合使用与许多细胞群的启动器，这些细胞群尚不为已知标记。根内皮的专用细胞就是这种情况。所谓的通道细胞的特点是覆盖成熟的内皮细胞53的苏伯林层的腹感。结合适当的启动子和随后的silico减法的独特表达配置文件将丰富为区域，庇护通道细胞。转录记者分析将有助于识别通道细胞标记基因。然而，是否可用于在此基础上分析稀有细胞群仍有待确定。
在本文中，我们详细介绍了翻译-核糖体亲和纯化方法及其优点和局限性，并强调了该方法的潜在应用。在"经济学"研究组合中，它占据着重要的利基地位，将有助于回答许多生物学问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢苏黎世遗传多样性中心的让-克洛德·沃尔瑟在该项目的早期阶段提供重要的专家建议。Vermeer 实验室的工作得到了瑞士国家科学基金会 （SNSF） 授予 JEMV 的 SNF 教授授予 （PP00P3_157524） 和 R'EQUIP 设备赠款 （316030_164086） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization | |||
| bleach, 13% | Sigma | 71696 | |
| beaker | VWR | 214-1172/74/75 | |
| desiccator with porcelaine plate (DURAN) | Sigma/Merck | Z317454-1EA/Z317594-1EA | |
| EtOH, p.a. | Honeywell | 02860-1L | |
| HCl, 37% | Roth | 4625.1 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Plate growth + harvesting | |||
| MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer | Duchefa | M0254 | |
| agar plant for cell culture | Applichem/Panreac | A2111.1000 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| forcepts | Rubis Switzerland | 5-SA model | |
| KOH | Fluka | 60370 | |
| micropore/surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| petri dishes 120x120 mm | Greiner bio-one | 688102 | |
| scalpel | VWR/Swann-Morton | 233-5454 | |
| tissues, neutral, two-layered | any supplier of your choice | ||
| Immunoprecipitation | |||
| GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA | Chromotek | e.g. gtma-100 | |
| Brij-35 | Sigma | P1254-500G | |
| centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) | Beckman Coulter | 357001 | |
| Chloramphenicol | Applichem | C0378-25G | |
| cotton gloves | VWR | 113-7355 | |
| Cycloheximide, HPLC grade | Sigma | 01810-1G | |
| DEPC | VWR | E174 | might have long delivery times |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| EGTA | Sigma | 3054.3 | |
| homogenizers DUALL 23 | KONTES GLASS CO (via VWR) | SCERSP885450-0023 (set) | SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times |
| Igepal CA-360 | Sigma | I3021-100ml | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| MgCl2 hexahydrat | Roth | 2189.2 | |
| mortar and pestle | VWR | 470148-960 & 470019-978 | |
| PMSF | Roche | 10 837 091 001 | |
| Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE | Sigma | P2393-500G | |
| RNase-free water | Roth | T143.3 | |
| RNAZap | Thermo Fisher | AM9780/AM9782 | for cleaning surfaces |
| Tris, >99.3% | Roth | AE15.3 | |
| Triton X-100 | Fluka | T8787-250ml | |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ml | |
| RNA extraction | |||
| 2-Propanol, p.a. | Sigma | 33539-1L-GL-R | |
| Chloroform, HPLC grade | Scharlau | CL02181000 | |
| EtOH, p.a. | Honeywell | 02860-1L | |
| low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml | Eppendorf/Sigma | Z666548-250EA | LoBind |
| RNase-free DNase set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| TRIzol reagent | ThermoFisher/Ambion | 15596018 | |
| Library preparation | |||
| 15/50 mL Tube Magnetic Separator | Abraxis | PN 472250 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Index Kit A | Illumina | FC-131-2001 | |
| Index Kit D | Illumina | FC-131-2004 | |
| neodymium magnets | Amazon/other | 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB) | |
| Nextera XT kit | Illumina | FC-131-1024/1096 | https://emea.support.illumina.com/ |
| PCR strips | ThermoScientific | AB-0266 | |
| SMARTer v4 kit | Takara Bioscience | 634892 | https://www.takarabio.com/ |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | specialized equipment for RNA/DNA quality control |
| Tapestation | Agilent | 4200 Tapestation Instrument | specialized equipment for RNA/DNA quality control |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5400 Fragment Analyzer System | specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput) |
| LabChip | PerkinElmer | LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer | specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput) |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher | Q33239 | specialized equipment for RNA/DNA concentration determination |
| qRT-PCR | |||
| GATA23 | Microsynth | fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC |
|
| GH3.3 | Microsynth | fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT |
|
| LBD29 | Microsynth | fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA |
|
| UBC21 | Microsynth | fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG |
|
| SsoAdvanced Universal SYBR Green | Bio-Rad | #172-5270 | |
| iScript Adv cDNA Kit | Bio-Rad | #172-5038 | |
| miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 ml, Cellstar | Greiner bio-one | 188261 | |
| Falcon tubes 50 ml, Cellstar | Greiner bio-one | 210261 | |
| filter tips 1 ml | Axygen | TF-1000-R-S | |
| filter tips 10 µl | Axygen | TF-10-R-S | |
| filter tips 100 µl | Axygen | TF-100-R-S | |
| filter tips 20 µl | Axygen | TF-20-R-S | |
| filter tips 200 µl | Axygen | TF-200-R-S | |
| microcentrifuge tubes 1.5 ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-100MG | |
| sequencing company | Novogene | en.novogene.com |
References
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