Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Oversættelse ribosom affinitet Rensning (TRAP) til at undersøge Arabidopsis thaliana Root Development på en celletype-specifik skala

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

Oversættelse ribosom affinitet rensning (TRAP) giver mulighed for at dissekere udviklingsprogrammer med minimal behandling af organer og væv. Protokollen giver høj kvalitet RNA fra celler målrettet med en grøn fluorescerende protein (GFP)-mærket ribosomal subunit. Downstream analyseværktøjer, såsom qRT-PCR eller RNA-seq, afslører væv og celle type-specifikke udtryk profiler.

Abstract

I denne artikel giver vi praktiske instruktioner for at få oversætte data fra forskellige Arabidopsis thaliana rodcelletyper via den oversættende ribosom affinitetrensning (TRAP) metode og fortløbende optimeret lav-input bibliotek forberedelse.

Som udgangsmateriale anvender vi anlægslinjer, der udtrykker GFP-mærket ribosomprotein RPL18 på en celletypespecifik måde ved hjælp af passende promotorer. Før immunrensning og RNA-ekstraktion er vævet snapfrosset, hvilket bevarer vævsintegriteten og samtidig tillader udførelse af tidsseriestudier med høj tidsmæssig opløsning. Især, cellevæg strukturer forbliver intakt, hvilket er en stor ulempe i alternative procedurer såsom fluorescens-aktiveret celle sortering-baserede tilgange, der er afhængige af væv protoplasting at isolere forskellige cellepopulationer. Derudover er ingen vævsfiksering nødvendig som i lasercapture mikrodissektionsbaserede teknikker, som gør det muligt at opnå RNA af høj kvalitet.

Men prøveudtagning fra delpopulationer af celler og kun isolere polysome-associerede RNA alvorligt begrænser RNA udbytter. Det er derfor nødvendigt at anvende tilstrækkeligt følsomme metoder til tilberedning af biblioteker til en vellykket dataindsamling foretaget af RNA-seq.

TRAP er et ideelt værktøj til planteforskning, da mange udviklingsprocesser involverer cellevægrelaterede og mekaniske signalveje. Brugen af initiativtagere til at målrette specifikke cellepopulationer er at bygge bro over kløften mellem organ og encelleniveau, som igen lider under ringe opløsning eller meget høje omkostninger. Her anvender vi TRAP til at studere cellecellekommunikation i lateral roddannelse.

Introduction

Drevet af den stigende anvendelse af næste generations sekventeringsteknikker kan rumlig opløsning i udviklingsbiologi øges. Moderne undersøgelser har til formål at dissekere væv ned til specialiserede celletyper, hvis ikke enkeltcelleniveau1,2,3,4. Med henblik herpå er der i løbet af de sidste 50 år udviklet en overflod af forskellige metoder (se figur 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mange værktøjer i plantevidenskab har været tilpasninger af teknikker, der var banebrydende inden for dyreforsøg. Det er ikke tilfældet for den metode, vi indfører i detaljer her. I 2005, udstyret med en stærk baggrund i protein oversættelse, Bailey-Serres Lab satte sig for at ingeniør ribosomale proteiner til efterfølgende affinitet rensning16. Således kunne de undgå tidskrævende og arbejdskrævende polysome profilering, som er baseret på ultracentrifugering med en saccharose gradient og blev brugt til at vurdere oversætte ribosomer siden 1960'erne17,18. Metoden er siden blevet omtalt som translationel ribosom affinitetrensning (TRAP)16. Efter vellykkede oversættelsesundersøgelser i planter, Heiman et al. tilpasset TRAP for dyr19 og andre udvidet sin ansøgning til gær20, Drosophila21, Xenopus22 og zebrafisk23,24.

Selv om genetisk modifikation af modelsystemet er en forudsætning for TRAP, som begrænser dets anvendelse til arter, der kan underkastes genetisk transformation, kan man samtidig udnytte denne indvending til at målrette delmængder af celler, der er af særlig interesse og ellers yderst vanskeligt at isolere fra det intakte væv/organ25 (f.eks. stærkt forgrenede dendritiske celler i en musehjerne eller svampehyphae i inficeret plantevæv). I planter holdes alle celler på plads via cellevægge, der danner grundlag for det hydrostatiske skelet26. For at frigøre en plantecelle fra denne matrix har forskerne enten fysisk skåret cellen ud af det omgivende væv gennem lasercapture microdissection (LCM)27 eller udført enzymatisk fordøjelse af cellevæggene28. Blandt de sidstnævnte celler, såkaldte protoplasts, er populationen af interesse fluorescerende mærket og kan adskilles via fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)7. LCM kræver normalt en prøve, der skal fastsættes og indlejres i voks, hvilket i sidste ende forringer kvaliteten af sin RNA29. FACS-baserede metoder giver høj kvalitet RNA, men processen med protoplasting selv introducerer forskelle i genekspression30 og væv med modificerede og tykke sekundære cellevægge er notorisk vanskelige at behandle. Desuden antages mange udviklingsprocesser i planter at være afhængige af mekanisk transmitterede signaler, og derfor er cellevæggens integritet af afgørende betydning31. To metoder, der bruger en genvej til at omgå celleisolation ved at operere på niveauet af kerner, er fluorescensaktiveret nuklear sortering (FANS) og isolering af kerner mærket i bestemte celletyper (INTAKT). Som i TRAP, de bruger celletype-specifikke initiativtagere til at markere kerner, der efterfølgende bliver beriget via sortering eller trække ned, henholdsvis8,15. En stor udfordring for alle disse tilgange er at få tilstrækkeligt RNA-materiale fra delmængder af celler i et væv. Da TRAP kun fanger en brøkdel af de cellulære RNA'er, er prøveindsamling en betydelig flaskehals. Derfor er der behov for særligt følsomme biblioteksforberedelsesprotokoller for at producere data af høj kvalitet fra lave inputmængder.

Siden oprettelsen er TRAP enten blevet anvendt i kombination med DNA-mikroarrays eller, da sekventeringsomkostningerne er faldet betydeligt i de senere år, RNA-seq10,32,33. En lang række forskningsspørgsmål er allerede blevet belyst som gennemgået i Sablok et al.34. Vi er overbeviste om, at flere rapporter vil følge i de kommende år, da teknikken er meget alsidig, når man kombinerer forskellige initiativtagere til at målrette specifikke celletyper. Til sidst, Dette vil ske selv i en ukuelig måde, og kan kombineres med sondering plantens reaktion på mange biotiske og abiotiske stressfaktorer. Derudover, hvor stabile transgene linjer ikke er tilgængelige, behårede rod udtryksystemer er også blevet anvendt med succes til at udføre TRAP i tomat og medicago35,36.

Figure 1
Figur 1: Oversættelse af ribosom affinitetsrensning (TRAP) supplerer analyseporteføljen "omics". A. Stigende niveauer af analytisk præcision, ned til encellede eller endda subcellulære opløsning kan opnås ved et væld af metoder eller kombinationer heraf. Ordningen giver et overblik over de værktøjer, der i øjeblikket er til rådighed på plante- og dyreområdet. Vævssamling ved cellulær opløsning kan opnås ved protokoller som LCM eller FACS, som derefter kobles til standard transkription eller polysome profileing/translatome analyse. TRAP og INTAKT integrerer både vævsindfangning og RNA-isolation, da de er baseret på epitop-tagging. Intakt e-prøver imidlertid kun cellekerner og udgør derfor et særligt tilfælde af transskriptionsanalyse. En lille kanin ikon markerer nyudviklede metoder på dyreområdet: Mens SLAM-ITseq og Flura-seq stole på metaboliske målretning af spirende RNAs med modificerede uracil baser i celler, der udtrykker eftergivende enzym, Slide-seq gør brug af en belagt glas dias med DNA stregkoder, der giver positionelle oplysninger i cellulære område. Der anvendes en nærhedsmærkningsmetode i APEX-seq for at udtage prøver af RNA'er i specifikke subcellulære rum. Navnlig kræver øget opløsning ofte generering af transgent materiale (stjerner), og disse metoder anvendes således overvejende til modelarter. TRAP er specielt velegnet til plantevidenskabelige undersøgelser, der involverer cellevæg (CW) eller mekaniker signalering samt cellearter, der er vanskelige at frigive fra deres CW matrix. B. Detaljerede vådlaboratorietrin i TRAP-proceduren: Kimplanter, der udtrykker GFP-mærket ribosomprotein i forskellige celletyper (f.eks. rodendodermis), dyrkes på petriskåle i syv dage og rodmateriale høstet ved snapfrysning. En total RNA-kontrolprøve indsamles fra det homogeniserede rå ekstrakt, før det pelleteres i snavset via centrifugering. Magnetiske anti-GFP perler tilsættes til det klare ekstrakt for at udføre immunudfældning. Efter inkubation og tre vasketrin opnås det polysomeassocierede RNA (TRAP/polysome RNA) direkte via fenol-chloroform ekstraktion. LCM: mikrodissektion af laserfanger, FACS/FANS: fluorescensaktiveret celle/nuklear sortering APEX-seq: metode baseret på manipuleret ascorbatperoxidase, INTAKT: isolering af kerner mærket i specifikke celletyper, SLAM-ITseq: thiol(SH)-linked alkylering for metabolisk sekventering af RNA i væv, Flura-seq: fluorouracil-mærket RNA sekventering (Oprettet med Biorender.com) Klik her for at se en større version af denne figur.

Målet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af TRAP-metoden, at fremhæve kritiske trin og at give vejledning til en mulig metode til forberedelse af biblioteket.

Et generisk TRAP-eksperiment vil hovedsagelig bestå af følgende trin (se også figur 1B):(1) Fremstilling af plantemateriale, herunder kloning af ribosomt-taggingkonstruktion, transgene linjeproduktion og -udvælgelse, dyrkning og opsamling af frø, sterilisering og plettering samt stressanvendelse/-behandling (valgfri) og vævshøst; 2) immunrensning, herunder vævshomogenisering og rydning af råekstrakt, perlevask og immunrensning samt vasketrin 3) RNA-ekstraktion og kvalitetsvurdering og (4) biblioteksforberedelse.

Arabidopsis-roden har været et modelsystem til undersøgelse af planteudvikling lige siden dens indførelse som modelanlæg37,38. Her er anvendelsen af TRAP fremvist i forbindelse med anlæggetlateral rod udvikling. I planter, opbygningen af hele rodsystemet er afhængig af udførelsen af dette program og er derfor meget vigtigt for overlevelsen af organismen39. I Arabidopsisstammer laterale rødder fra pericyclevæv , der ligger ved siden af xylem-karog derfor kaldes xylempolpericycle (XPP; se figur 2C)40. Nogle XPP-celler, som er placeret dybt inde i roden, erhverve en grundlægger celleidentitet og, på en lokal hormonelle udløse, begynder at formere sig ved hævelse og dividere anticlinally41. Men på grund af tilstedeværelsen af en stiv cellevæg matrix, denne proces udøver mekanisk stress på det omgivende væv. Især er den overliggende endodermis påvirket, da det er i vejen for den laterale rodvækst akse42,43,44. Faktisk vil den nydannende primordium nødt til at vokse gennem den overliggende endodermis celle (Figur 2C2), mens cortex og epidermis celler er bare skubbet til side for primordium til endelig at dukke45,46. Nylige arbejde i vores laboratorium har vist, at endodermis aktivt bidrager til at imødekomme spredning i perihjulet. Målrettet blokering af endodermal hormonel signalering er tilstrækkelig til at hæmme selv den allerførste division i XPP-cellerne47. Derfor pericycle-endodermis kommunikation udgør en meget tidlig checkpoint for lateral rod udvikling i Arabidopsis. Det vides dog ikke, hvordan denne krydstale udføres. For at opklare dette mysterium valgte vi TRAP-seq-tilgangen til at målrette XPP og endodermale celler. At berige for celler i den laterale rod program, vi efterlignede hormonelle udløse ved eksogent anvende en auxin analog (1-naphthaleneeddikesyre, NAA)48, som samtidig lov til at tidsmæssigt løse den indledende fase af lateral roddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kloning af transgene, transgene linjeproduktion og -udvælgelse

  1. Klon den foretrukne promotor i den relevante indgangsvektor. Brug en rekombinationsbaseret kloningsmetode (Materialetabel) og kombiner initiativtagerne i pDONRP4-P1r. Klon RPL18 (med affinitetsmærke eller fluorescerende protein efter eget valg) ved hjælp af rekombinationsbaseret kloning i pDONRP1-P249.
  2. Komponeringsvektoren, der indeholder RPL18, med den promotorholdige indgangsvektor i en tofragmentsrekombinationsreaktion til den relevante destinationsvektor med FAST-red selection kassette50 for at lette direkte udvælgelse af transgene frø.
  3. Kontroller den rekombinerede vektor ved sekventering og omdanne det til egnede, kompetente agrobakterier. Flower dip Arabidopsis planter og efter 3-4 uger høst og vælg T1 frø51.
  4. Brug mikroskopi til at identificere velekspressende linjer og verificere udtryksmønstre i henhold til den rapporterede promotoraktivitet på flere uafhængige linjer. Vælg linjer, der viser et repræsentativt udtryksmønster med en enkelt T-DNA-indsættelse. Dette kan bidrage til at minimere hæmning og vil være en fordel for genetiske kors.
  5. Vælg T3 afkom, der er homozygot til markørgenet.

2. Formering og sterilisering

  1. Celletypespecifik TRAP isolerer RNA fra et begrænset antal målceller pr. rod. At generere den nødvendige udgangsmateriale, udbrede homozygote linjer. Til dette formål skal du bruge standard vækstbetingelser med særligt fokus på svampevækstkontrol.
    BEMÆRK: Hvis der ikke kan opnås enkelte indføringslinjer, vokser partier i store populationer over få generationer for at undgå T-DNA-induceret transgenerationel lyddæmpning.
  2. Steriliser store mængder arabidopsisfrø med en runde klorgas og en runde på 70% EtOH.
    1. Spred frøene jævnt på 12 cm x 12 cm firkantede petriskåle (mindre end 0,3 ml frø/plade) og stabling dem i en ekssikkator eller anden egnet beholder. Undgå klump eller bunke dannelse som frøene skal være tilgængelige for gassen. Udfør gassterilisation natten over med blegemiddel og HCl mængder som rapporteret52: 100 ml blegemiddel (13%) med 6 ml conc. HCl i en 60 L ekssikkator. Defumigate i mindst 1 time, før frøene opsamles i en steril beholder.
      FORSIGTIG: 37% HCl er meget ætsende og kræver omhyggelig håndtering. Klor gas er giftigt, skal du bruge en røg hætte.
    2. Tag 0,1 ml tørre, gassteriliserede frø pr plade og bland dem med sterilisation sopløsning (70% EtOH, 0,01% Tween) ved stuetemperatur. Inkuber i 20 min, dekantere EtOH og vask frøene 3-4 gange med sterilH2O.
    3. De gennemblødte frø overføres til 50 ml rør og fortyndes med steril 0,1% agar for at opnå 1 ml glødefrøpr. plade (0,1 ml frø/1 ml gylle).
      BEMÆRK: På grund af transgene integration begivenheder, kan plante linjer være modtagelige for forskellige sterilisation teknikker; navnlig etoh-inkubationstiden viste sig at være kritisk. I vores hænder var de dobbelte sterilisationstrin nødvendige for at undgå svampeforurening under forsøgene. Dette er især vigtigt, når du udfører tidsserier, da forurening af et enkelt tidspunkt hæmmer hele eksperimentet. Det kan godt være, at dobbelt sterilisation ikke altid er nødvendig, afhængigt af lokale vækstbetingelser.

3. Plating

  1. Forbered disse trin på forhånd. 1/2 MS-plader (pH 5.8) hældes med 1% agar i de mængder, der er nødvendige for forsøget (20-30 pr. prøve/tidspunkt). Skær 1 ml pipettespidser for at forstørre spidsdiameteren til ca. 3-4 mm med et barberblad. Autoklave spidserne. Opret en skabelonholder til plettering af tre rækker frø pr. plade med firkantede petriskållåg. Forbered en laminar flow hætte til at give et sterilt arbejdsmiljø og mærke de plader, der skal behandles.
    BEMÆRK: Hvis mange plader behandles på samme tid, kan farvede etiketter fremskynde mærkningen.
  2. Placer tomme agarplader i skabelonholderen, og fordel 1 ml imbibedfrø jævnt på tre rækker. Anbring de forarbejdede plader i stakkene i laminarstrømmen, indtil frøene er tørre (dvs. hold dig til agaroverfladen). Lad ikke pladerne være længere, da agaren også tørrer ud.
  3. Når frøene er tilstrækkeligt tørre, lukkes lågene og forsegler hver plade med mikroporetape. Stratificere frøene i to dage ved 4 °C i mørke og derefter placere dem i et vækstkammer.

4. Vævsbehandling (valgfrit)

BEMÆRK: I denne protokol skitserer vi den eksogene behandling af Arabidopsis rødder med den syntetiske auxin variant NAA. Afhængigt af det foreliggende forsøgsspørgsmål skal denne del justeres eller helt udelades.

  1. Forbered strimler af silkepapir på 1,5 - 2 cm i højden og 10 cm i længden. Forlængede inkubationstider kræver, at vævet autokvires før brug.
  2. Fjern mikropore tape fra alle plader, der skal gennemgå hormonbehandling. 1 ml 10 mM NAA (opløst i DMSO) fortyndes i 1 L væske, autokvires 1/2 MS opløsning (pH 5.8) og lægges i blød i opløsningen (10 μM NAA).
  3. Brug pincet til at anvende en strimmel silkepapir på hver række af rødder. Brug forsigtigt fingrene til at fjerne luftbobler. Tøm overskydende væske fra pladen, luk låget og mærk pladen med tiden. For forlængede inkubationstider skal pladerne placeres tilbage i vækstkammeret.

5. Høst

  1. Plader ne hentes for hver biologisk replikat/tidspunkt/behandling. Flydende nitrogen opsamles i en ren Dewar-beholder og mærkerør (15 eller 50 ml) til de forskellige vævsprøver. Forbered en Styrofoam holder.
    FORSIGTIG: Bliv fortrolig med procedurer for håndtering af flydende nitrogen (beluftning, frostbid, potentielt eksploderende rør).
  2. Åbn pladen og fjern silkepapiret med pincet, og pas på ikke at løsne rødderne fra agaroverfladen. Med en kirurgisk klinge skæres én gang pr. række langs skud-rod-krydset i et enkelt, bestemt slag. Rengør knivene mellem prøverne, og ombyt dem ofte for at sikre skarphed.
  3. Med en pincet, knalde langs rødderne af hver række for at samle dem i tre bundter. Grib rødderne og tøm dem i et 50 ml rør fyldt med flydende nitrogen for at knække frysepunktet.
    BEMÆRK: Forsøg ikke at samle rødder i tætte strukturer (som bolde), da de er svære at male i næste trin.
  4. Der fortsættes med alle plader, der udgør én prøve (i rækkefølge efter inkubationstider), og udhæld overskydende flydende nitrogen ud. Brug rørlåget for at forhindre rødderne i at spilde. Luk derefter låget og saml alle rør i Dewar-beholderen. Rodvævet opbevares ved -80 °C.

6. Immunrensning

BEMÆRK: Dette trin har til formål at opnå høj kvalitet TRAP / polysome RNA. Følg derfor nøje råd om god praksis for RNA-håndtering. Udfør alle trin i dette afsnit i en steril bænk og rengør alt udstyr og labware med en RNase-fjernelsesopløsning (Materialebord). Bær handsker, og skift dem straks, når de er forurenet med prøve, is eller andre kilder, der ikke er blevet rengjort. Da dette er et meget afgørende aspekt, er et afsnit om genbrug af udstyr sammen med rådgivning om bortskaffelse af affald medtaget.

  1. Forberedelse af buffer
    1. Klargør stamopløsninger i henhold til tabel 1 og autoklave (A) eller filter steriliser (?). Medmindre andet er angivet, er opløsningsmidlet RNase-frit vand.
    2. Opløses og aliquot dithiothreitol (DTT), phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), cycloheximid (CHX) og chloramphenicol (CAM) opløses i deres respektive opløsningsmidler som angivet i tabel 1 og opbevares ved -20 °C. Alle andre lagre kan forblive ved stuetemperatur.
    3. Forblanding lagrene - med ingredienser 1-4 til vaskebuffer (WB) og 1-6 for polysome extraction buffer (PEB) - for at undgå tidskrævende bufferblanding før hver ekstraktion. Således kun tilføje vand og de frosne ingredienser (7-10) på dagen for ekstraktionen. Opbevar de forblandede lagre og rnasefrit vand ved 4 °C.
      BEMÆRK: DTT-koncentrationen er 1/5 af den rapporterede koncentration fra Zanetti et al. 2005, da nanobody-interaktionen med GFP er følsom over for høje DTT-koncentrationer.
Ingredienser Lagerkoncentration Tilføj volumen i ml til 50 ml WB* Tilføj volumen i ml til 50 ml PEB*
1 Tris, pH 9 A 2 M 5 5
2 KCl (KCl) A 2 M 5 5
3 EGTA A 0,5 M 2.5 2.5
4 MgCl2 A 1 m 1.75 1.75
5 Pte A 20% (v/v) 0 2.5
6 blanding af vaskemiddel A 0 2.5
Tween 20 20% (v/v)
Triton-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (m/v)
Igepal (Igepal) 20% (v/v)
7 DTT (DTT) ₳ 0,5 M 0.1 0.1
8 PMSF (PMSF) ₳ 0,1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cycloheximide delte et link. ₳ 25 mg/ml (EtOH) 0.1 0.1
10 Chloramphenicol ₳ 50 mg/ml (EtOH) 0.05 0.05

Tabel 1: Buffersammensætning og blandingsrådgivning. Ingredienser med de givne bestandskoncentrationer blandet i de givne mængder giver 50 ml WB eller PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminothan, EGTA: ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N',N'-tetra-eddikesyre, PTE: Polyoxyethylen-(10)-tridecylether, A: autoklave, ...: filtersteriliser; * fyld op til 50 ml med RNase-fri vand.

  1. Vævshomogenisering/slibning
    1. Kog ned centrifuge og placere homogenisatorer og centrifuge rør på is. Optø aliquots af DTT, PMSF, CHX og CAM. Bland PEB og WB fra stamopløsningerne i 50 ml rør i henhold til dagens krav (# af prøver) og afkøles på is.
      BEMÆRK: Tilsæt kun PMSF kort før brug, da halveringstiden for PMSF i vand kun er 30 min.
    2. Der fremstilles rigeligt flydende nitrogen i en dewarbeholder, og vævsprøver hentes fra -80 °C opbevaring. Brug bomuldshandsker under standardlabhandskerne for at undgå forbrændinger fra kolde morterer. Hæld flydende kvælstof i morterer og støder, indtil de er kolde nok til at tillade slibning. Det anbefales at udtænke et system til at skelne morterer (etiket eller holde i en bestemt rækkefølge).
    3. Tom vævsprøve i en morter og male omhyggeligt, indtil alt materiale er et hvidt pulver. Hvis det er nødvendigt, tilsæt flydende nitrogen for at holde vævet frosset eller for at lette bedre slibning.
    4. Der tilsættes 5 ml PEB til prøven, og pulveret blandes hurtigt, før bufferen fryser. Mens denne prøve tø (mix fra tid til anden) behandle en anden prøve.
    5. Så snart blandingen kan overføres, tømmes gyllen til en glashomogenisator og holdes på is. Med yderligere 2 ml PEB skylles mørtel og støder og dertilsættes den til prøven i homogenisatoren.
      BEMÆRK: Undgå en helt flydende prøve, da dette giver mulighed for RNA-nedbrydning.
    6. Gyllen slibes manuelt, indtil ekstraktet er homogent. Vi anbefaler mindst 4 til 5.
      BEMÆRK: Det kan kræve lidt ekstra ventetid at lade gyllen tø yderligere op. Håndtering af homogenisatorer kræver en vis omhu. Må ikke anvendes brute force og pas på sugekræfter. Hvis dette ikke tages i betragtning, vil det føre til spild, forurening eller ødelæggelse af homogenisatoren.
    7. Hæld det rå rodekstrakt i et 50 ml centrifugerør (hold på is).
      BEMÆRK: Normalt flere prøver kan være jorden før overførsel. Parallel håndtering af slibning, overførsel og homogenisering er påkrævet. Prøv at arbejde hurtigt, men ikke haste; bevare roen. Opbevar altid homogeniserede prøver på is.
  2. I alt RNA-prøvesamling
    1. 200 μL aliquots af hver rå prøve overføres til et rent mikrocentrifugerør (mærket og afkølet på is på forhånd).
    2. Der fortsættes med RNA-ekstraktionen som detaljeret for TRAP-prøver i punkt 7.1 og 7.2. Gør disse trin, mens prøverne er clearing i centrifugen.
    3. Udfør en DNase behandling med den resuspenderede samlede RNA for at eliminere DNA-forurening og rydde op i reaktionen ved hjælp af et kommercielt kit (Table of Materials).
      BEMÆRK: De samlede RNA-ekstraktioner giver normalt høje koncentrationer, og prøverne skal fortyndes betydeligt. Vi anbefaler, at koncentrationen måles efter fortynding efter den følsomme Qubit-protokol.
  3. Rydning af råekstrakt
    1. Isspanden udtages med prøver fra 6.2.7, og den centrifugeres i 15 minutter ved 16.000 x g og 4 °C.
      BEMÆRK: For at afbalancere centrifugen skal prøverne parres i overensstemmelse hermed. Hvis dette ikke er fuldt ud muligt, justeres en prøve ved at tilsætte PEB.
    2. Supernatanten hældes i et nyt centrifugerør (afkølet på isen på forhånd) og centrifugation gentages (15 min ved 16.000 x g og 4 °C). Denne overførsel kan hurtigt udføres ved siden af centrifugen.
    3. Mens den rå ekstrakt er clearing, indlede vask af GFP-perler til trin 6,6.
      BEMÆRK: Hold denne isspand til rokkende på rysteren, men anbring ikke den sterile bænk igen, da den kan være forurenet.
  4. Perle vask
    1. Aliquot magnetiske GFP-perler (#samples x 60 μL, Materialetabel) i et 1,5 ml rør. Placer på det magnetiske stativ. Når perlerne har indsamlet, skal du fjerne supernatanten.
    2. Tilsæt 1 ml kold WB, resuspender perlerne og saml dem igen. Vaskbufferen kasseres, og gentag igen med 1 ml WB.
    3. I sidste ende resuspenderperlerne i WB til det oprindelige volumen, der anvendes i trin 6.5.1.
  5. Immunrensning (IP)
    1. Umiddelbart efter centrifugering hældes det klare supernatant i mærkede 15 ml rør, og der tilsættes 60 μL vaskede perler pr. prøve.
    2. Læg alle prøver vandret i isspanden og læg den på en shaker. Lad blandingen inkubere i 2 timer for at binde de GFP-mærkede polysomer til perlerne.
    3. Saml perlerne på den magnetiske stativ for 15 ml rør (på is) og tilsæt PMSF til den resterende PEB. Kassér supernatanten. Hæld ca. 5 ml PEB til perlerne og resuspender dem ved at vippe. Prøverne rystes i 15 min. i samme opsætning som i punkt 6.6.2.
    4. Gentag vaskerne med WB til i alt 3 vaske (1 x PEB, 2 x WB). Tilføj PMSF før hver bufferudveksling.
    5. Saml perlerne i 1 ml WB og overfør dem til et 1,5 ml rør. Endelig indsamle perlerne en gang mere på den magnetiske stativ og fjerne al væske. Luk røret og hold på is, indtil alle prøver er behandlet.
    6. Prøverne transporteres til en røghætte til RNA-ekstraktion.
  6. Bortskaffelse og istandsættelse af laboratorieforsyninger.
    1. Hvis sterilisationsproceduren udføres i overensstemmelse med god laboratoriepraksis (se pkt. 2.2.1), giver sterilisationsproceduren en vandig NaCl-opløsning. Lad klor gas, samt resterende HCl og blegemiddel, at defumigate i røghætte.
    2. PEB og WB bortskaffelse: Som CHX nedbrydes ved høj pH, indsamle alle væsker og bringe til pH>9. Det flydende affald bortskaffes i det halogenerede kemiske affald. Alle faste stoffer (væv, serologiske pipetter, handsker osv.) skal bortskaffes som kemisk affald.
    3. Saml fenolholdige væsker separat, samt fenol-forurenet materiale (spidser, rør og handsker).
    4. Håndvaskemorterer, pestler og homogenisatorer (svampe og børste) med sæbe og skyl grundigt. Derefter bages materialet ved >220 °C natten over. Enten wrap i tin folie før behandlingen eller placeres i en varme-bevis, dækket beholder.
    5. Børst rene centrifugerør med vaskemiddel og derefter diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandle i røghætte. Til dette formål tilsættes flydende DEPC til deioniseret vand (1 ml DEPC til 1 L af H2O) og blandes via omrystning. Placer centrifugerørene på en autoklaverbar bakke, der fanger spildt DEPC-vand. Hæld suspensionen i rørene og lad i 3 timer eller natten over. DEPC nedbrydes i den efterfølgende autoklaveringsproces.
      FORSIGTIG: DEPC er meget giftigt.

7. RNA ekstraktion og QC

  1. RNA-ekstraktion
    1. Daføl bordpladecentrifugen til 4 °C.
    2. Der tilsættes 1 ml syre-guanidinium-phenolbaseret reagens (Materialetabel)til hver prøve, inverter for at gensuspendere perlerne eller den samlede RNA-gylle og inkubere i 5 minutter på is. Må ikke vortex!
    3. Der tilsættes 200 μL chloroform og inkuberes i 3 minutter på is. Derefter grundigt vortex prøverne.
    4. For at hjælpe fase adskillelse, centrifuge ved max. hastighed i 10-15 min. 4 °C.
    5. Mærk 1,5 ml rør med lav retention (Materialetabel) og aliquot 650 μL isopropanol i hver.
    6. Tag forsigtigt den øvre vandige fase (ca. 650 μL) og overføres til de forberedte rør med isopropanol. Undgå at røre ved den lyserøde organiske fase.
    7. Udfæld RNA natten over ved -20 °C.
      BEMÆRK: Det anbefales at opbevare prøverne i isopropanol ved -20 °C eller -80 °C og kun opløses i vand, når det er nødvendigt. Vandigt RNA nedbrydes selv ved -80 °C, når det opbevares i uger/måneder.
  2. RNA-udfældning
    1. Daføl bordpladecentrifugen til 4 °C.
    2. Forbered frisk 80% EtOH med RNase-frit vand og afkøles ved -20 °C (5 min ved -80 °C bidrage til at fremskynde processen).
    3. Prøverne centrifugeres ved maksimal hastighed (ca. 13.000 x g) i 30 min. og supernatanten kasseres. Pellet vil ikke være synlig, så omhyggeligt pipette, som om det var der. Tilsæt 1 ml koldt 80% EtOH og inverter røret en eller to gange.
    4. Centrifugeres igen i 30 min ved maksimal hastighed, og vasken gentages til i alt to vaske.
    5. Drej ned i 2 min, og fjern alle resterende EtOH med en 10 μL spids. Lad pellet tørre i 3-5 min (ikke mere) ved stuetemperatur og resuspenderi i 20 μL RNase-fri vand.
    6. Hold prøverne på is og udfør kvalitetskontrol så hurtigt som muligt. Prøverne opbevares ved -80 °C. Undgå fryse-tø cykler.
  3. Kvalitetskontrol ved hjælp af dedikeret udstyr (Materialetabel) i henhold til producentens anbefalinger.

8. Biblioteksforberedelse

  1. cDNA syntese og forstærkning med SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit
    1. Fortyndingen af hver prøve beregnes til at have 1,5 ng AF TRAP-RNA eller total RNA i et volumen på 4,75 μL. Udfør alle reaktioner i PCR-rør og fortyndes prøver med friske aliquots af RNase-frit vand.
    2. Udfør alle trin i henhold til producentens anbefalinger med 1/2 reaktionsvolumenerne. Forstærk cDNA'et med 12-13 PCR-cyklusser.
    3. Ryd op i PCR ved at tilføje 0,5 μL 10x lysis buffer og 25 μL SPRI perler (Materialetabel). Hvis mange prøver behandles lysis buffer og perler kan forblandede. Sørg for, at perlerne er jævnt fordelt før pipettering.
    4. Der fortsættes med protokollen i fuld reaktionsvolumen (17 μL elueringsbuffer). Lad ikke perlerne tørre i mere end 3 minutter. Overtørrede prøver kan potentielt reddes ved længere tids inkubationstid.
    5. Prøvekoncentrationerne måles med Qubit HS DNA-sættet.
      BEMÆRK: SMARTer v4-sættet kan tåle ned til 200 pg input. Vi fik biblioteker i tilfælde, hvor Qubit værdier ikke kunne bestemmes (under 250 pg, afsløring grænse) med en 16 cyklus PCR. Det begrænsede inputmateriale kan dog også give mindre komplekse biblioteker.
  2. Opsplitning og adapterligation PCR med Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. CDNA'et fortyndes med RNase-frit vand for at opnå en koncentration på 200 pg/μl og pipette 1,25 μL i et PCR-rør.
    2. Udfør alle trin i henhold til producenten med 1/4 reaktionsvolumener. Forstærk cDNA'et med 12 PCR-cyklusser og kompatible adaptere til de prøver, der tilhører en sekvenspulje. Med Illumina's Index Kits A og D op til 384 prøver kan multiplexed.
    3. Til PCR-oprydningen tilsættes 12,5 μL resuspensionsbuffer og 22,5 μL SPRI-perler (0,9 x forhold). Eluer prøven med 22 μL elueringsbuffer.
      BEMÆRK: QC og pooling blev udført af sekventeringsfirmaet (Table of Materials),og der var derfor ikke behov for bead-baseret normalisering. Den enzymatiske fragmenteringsreaktion (tagmentation) er meget følsom over for materialeinput, da hvert enzym kun skærer én gang. Du må derfor ikke overskride koncentrationsanbefalingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med henblik på kvalitetsvurdering bør ovennævnte procedure undersøges på flere mellemliggende trin: validering af ekspressionsmønster i planta, kvalitetskontrol af det isolerede polysomale RNA samt af de endelige biblioteker. qRT-PCR ved hjælp af kendte markørgener kan desuden udføres for at bekræfte responsen på behandlingstilstanden eller for at finjustere forsøgsbetingelserne.

Konfokal analyse af fordelingen af GFP-signaler
For at kontrollere for både endodermal og XPP udtryk mønstre, vi analyserede homozygote linjer pELTP::GFP-RPL18 og pXPP::GFP-RPL18 ved konfokal mikroskopi. Figur 2A og figur 2B viser repræsentative planter med GFP-signaler (grøn), der er blevet modvirket med propidiumiodid (magenta) til konturaflæggecellevægge. Tværsnittet i figur 2A1 viser en koncentrisk ring i det tredje cellelag udefra, hvilket svarer til endodermis. Det endodermale GFP-signal starter kort over meristematic zone (Figur 2A2) og vises både i cytosol og omkring cellernes kerner, hvilket svarer til ribosomer. I modsætning hertil udstiller XPP-linjen to forskellige poler, hvilket svarer til XPP (Figur 2B1). Ca. tre celler ved hver pol starter over meristematic zone for at udstille et GFP-signal. Således begge linjer er i overensstemmelse med lokaliseringmønster af endodermis og XPP, henholdsvis (Figur 2C)53.

Polysome RNA validering
For at bestemme kvaliteten af det opnåede polysome RNA udførte vi kvalitetskontrolmålinger ved hjælp af to automatiserede elektroforesesystemer (Materialetabel),der arbejder med μL-inputmængder og også beregner et RNA-integritetsnummer (RIN)54. Den proprietære algoritme tildeler en RIN-værdi mellem 1 og 10 til hvert elektrofherogram og er et robust og reproducerbart mål for RNA-kvalitet (dvs. nedbrydning) - jo lavere værdi jo mere nedbrudt er prøven. Figur 3 viser eksempler på de målinger, vi har fået fra polysome RNA. De fleste prøver viser næsten ingen tilsyneladende nedbrydning med RIN-værdier fra 9-10 , hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter55,56. Enhver forkert håndtering, især perioder med langvarige forhøjede temperaturer (f.eks. stuetemperatur) eller RNase-forurening, vil være tydelig på nuværende tidspunkt. Begge instrumenter beregner også prøvekoncentrationerne ud fra deres elektropherogrammer (figur 3A). Disse kan variere betydeligt og er for det meste på den nedre detektiongrænse. Vi anbefaler derfor, at du bruger fluorometriske målinger til præcist at kvantificere koncentrationer.

Bibliotek QC
Da de fleste laboratorier ikke udfører RNA-sekvenseringen i huset, køres kvalitetskontrol ofte på specialiserede faciliteter med enheder med høj overførselsmængde (Materialetabel). De vurderer rutinemæssigt kvaliteten og kvantificerer koncentrationerne ved qPCR og fluorometriske analyser (Materialetabel), da nøjagtige målinger er en forudsætning for bibliotekspooling. Ikke desto mindre, hvis biblioteket forberedelse ikke er outsourcet, kan man prøve resultatet med specialiseret udstyr (Tabel over materialer). Figur 4 viser spor af korrekt forberedte biblioteker med vores anbefalede protokol (A) og fremhæver procedurens robusthed på trods af nedskalerede reaktionsmængder (B). Del C illustrerer prøver, der ikke lever op til standarderne, og som kan skyldes overfragmentering, materialetab under oprydning eller mislykket fjernelse af adapteren. I sidstnævnte tilfælde kan en anden oprydning med et strengere prøveperle-forhold bidrage til at eliminere forureningen. Helt mislykkede prøver var yderst sjældne i vores hænder og kunne stamme fra flere punkter (f.eks. for højt input til den stochioetriske tagmentationsreaktion).

Sekvenserede bibliotekers ydeevne eksemplificeres i figur 4D for prøver fra endodermis i vores mutantbaggrund. Biblioteker fra WT og / eller pericycle udføre lignende eller endnu bedre. Ribosomal læser var i gennemsnit omkring 2% med kun få prøver over 3%. Læser med en gennemsnitlig kvalitetsscore over 30 var konsekvent over 90% allerede før filtrering. Kortlægningen evne af de sekventeret læser var lige så høj i gennemsnit på 85%. For at bestemme sammenhængen mellem biologiske replikater parvis Spearman koefficienter blev beregnet for hvert tidspunkt. Alle test resulterede i høje koefficientværdier.

Behandlingsrespons og berigelsesanalyse
Før der produceres et genom-omfattende datasæt, kan TRAP RNA fra et piloteksperiment undersøges af qRT-PCR for at validere behandlingssucces og/eller eksperimentelle tilstande. Vi udførte denne type analyse for at vurdere auxin-respons efter 2 timers behandling i XPP-prøverne (figur 5A). Tre forskellige auxin-responsive gener (GH3.3, LBD29 og GATA23) blev testet via ct-metoden57. Der blev observeret meget stærk induktion i alle tre tilfælde efter inkubationstiden, hvilket tyder på, at den eksogene NAA-ansøgning var vellykket.

Hvis nyudviklede initiativtagere udnyttes, bør man på dette tidspunkt også udføre berigelsesanalyse med qRT-PCR. Til dette formål forstærkes et kendt markørgen (dvs. det gen, der drives af den anvendte promotor) i TRAP og det samlede RNA-prøve- og ekspressionsniveauer normaliseret til det samlede RNA-niveau. Hvis isoleringen af TRAP RNA fra det specifikke væv lykkedes, bør der opnås en signifikant ændringsstigning. Alternativt kan der hentes tilsvarende oplysninger fra sekventeringsdataene (se figur 5B). Udtryk for to suberin-relaterede gener, GPAT5 og HORST, er til stede i alle endodermis prøver og især fraværende fra XPP væv. Tværtimod udtrykkes pericycle-udtrykte gener (PHO1 og SKOR) kun meget lavt i endodermis og beriget i XPP-sonderne med en auxin-induceret nedregulering over den undersøgte tidsramme.

Figure 2
Figur 2: Celletypespecifikt udtryk for GFP-RPL18 i Arabidopsis-roden. A-B. Konfokale mikroskopi billeder af pELTP::GFP-RPL18 (A) og pXPP::GFP-RPL18 (B) udtrykke rødder på seks dage efter spiring. Cellevægkonturer blev opnået ved farvning med propidiumiodid (magenta). Tværsnit A1 og B1 er fra de positioner, der er angivet med stiplede linjer i henholdsvis A2 og B2. Sidstnævnte billeder viser maksimale fremskrivninger (MAX) af de optagede z-stakke. C. Skematisk repræsentation af de vævstyper, der udgør Arabidopsis-roden i længderetningen (C1) og tværsnit (C3), samt i en lateral rodprimordium (C2). Billedet blev ændret med tilladelse fra F. Bouché. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: TRAP/polysome RNA kvalitetsvurdering. A. Tapestation - Repræsentative resultater fra 14 målte prøver i gel billede repræsentation med deres respektive RINe værdier (øverst til venstre). Elektropherogramrepræsentation vises for prøve A1 (fremhævet med blåt). Tabellen til højre informerer om prøvekoncentrationerne. B. Lignende spor som i A opnås med Bioanalyzer. Panelerne til højre viser prøver med stigende nedbrydningsniveauer, hvilket afspejler deres faldende RIN-værdier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Biblioteksprofiler fra TRAP/polysomeprøver. A. To repræsentative TRAP prøver (venstre) svarer meget godt med spor for vellykkede biblioteker anbefalet af Nextera XT brugervejledning. B. Forskellige reaktionsmængder giver robuste resultater af biblioteksforberedelse. C. Biblioteker med suboptimale resultater: meget korte fragmenter (øverst til venstre), ekstremt lange fragmenter (nederst til venstre), lav koncentration (øverst til højre) eller fuldstændig fejl (nederst til højre). Bemærk også resterende korte fragmenter (blå ellipse), der skal fjernes før sekvensering. Bioanalyzer: røde spor, LabChip: blå spor. D. Udvalgte kvalitetsmål for sekvenserede TRAP-prøver (endodermis af vores laterale rodfri mutant) på forskellige tidspunkter og fordeling af Spearman-korrelationskoefficienter beregnet mellem parvis sammenligninger af alle prøver inden for et tidspunkt (n=65). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: qRT-PCR og RNA-seq viser auxin-responsiveness og vævstype berigelse, henholdsvis. A. Ekspressionsniveauer for tre kendte auxin-responsive gener blev vurderet efter 2 timers auxinbehandling via qRT-PCR. Der blev observeret stærk induktion i alle prøver. RT-PCR blev udført på 3 uafhængige biologiske replikater og normaliseret til de ikke-behandlede prøver med UBC21 som internt referencegen. Fejllinjer repræsenterer SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: GATA-motiv binding transskriptionsfaktor 23, UBC21: UBIQUITIN-KONJUGerende ENZYM 21 B. Udtryksniveauer for fire markørgener fra TRAP-seq-datasættet. Prøver til venstre er endodermis-afledte (grønne nuancer), mens prøver til højre er XPP-afledte (blå nuancer). Tal repræsenterer auxin inkubationsintervallerne i timer. Negative z-scorer afspejler lave udtryksniveauer og omvendt. Endodermale markørgener (GPAT5, HORST) udtrykkes forskelligt med høje niveauer i endodermisprøver. Tværtimod, pericycle markører (PHO1, SKOR) har høje udtrykniveauer i XPP-celler og vise ned-regulering ved auxin behandling. GPAT5: glycerol-3-phosphat 2-O-acyltransferas (suberin biosynthsis), HORST: hydroxylase af rodsuberiseret væv, PHO1: fosfat 1, SKOR: stelar K+ passiv rektifikator. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Ikke-konstituerende pUBQ10::GFP-RPL18 lokaliseringsmønstre. Konfokal mikroskopi af seks dage gamle planter. Cellevægkonturer blev opnået ved farvning med propidiumiodid (magenta). Tværsnit A2 og C1 er fra de positioner, der er angivet med stiplede linjer i henholdsvis A3 og C2. Billeder markeret MAX viser maksimale fremskrivninger af de indspillede z-stakke. A1-A3. Ensartede lokaliseringsmønstre for UBQ10-drevetkonstruktion. B1-C2. Bemærkelsesværdigt fald i signalstyrken i ydre vævslag. A, B og C registreres i tre forskellige anlæg. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verificering af lokaliseringsmønsteret RPL18
Afgørende for at undgå fejlfortolkning af data fra ethvert TRAP-eksperiment er det korrekte udtryksmønster for den mærkede ribosomal-underenhed. Derfor indarbejdes GFP som en epitop tag til RPL18 meget elegant tillader verifikation af det ønskede udtryk mønster og fortløbende, pulldown af polysom fraktion fra samme væv. Mere invasive tilgange til at sikre ordentlig promotor mønstre efterfølges af Jiao og Mayerowitz 2010, som kræver GUS-farvning og i Tian et al. 2019, der er afhængig af immunfarvning med anti-FLAG antistoffer58,59.

Vi anbefaler på det kraftigste at kontrollere lokaliseringsmønsteret i hver generation, da Transgene T-DNA-linjer kan være tilbøjelige til at dæmpe og dermed signalstyrken kan forringes, eller andelen af ekspresfald. Med GFP-tag indarbejdet i konstruktionen, er disse hyppige kontroller let udføres via mikroskopi.

Men selv en grundig konfokal analyse kan i nogle tilfælde føre til falske konklusioner. Vi vil gerne fremhæve dette med vores mislykkede forsøg på at producere en kontrol TRAP linje. Hidtil har plantevidenskab samfund ikke været i stand til at skabe en plante linje med en ensartet RPL18 fordeling i alle cellelag. Selv den oprindeligt beskæftigede 35S promotor blev tilskrevet kun vise "næsten konstituerende" distribution med en ikke-ensartet lokalisering mønster10. Vores tilgang var at bruge initiativtageren til UBIQUITIN10 (UBQ10)til at drive GFP-RPL18 konstruktion. Screening i T1 generation tilbudt meget lovende lokalisering og dermed blev valgt til at blive formeret (Figur 6A). Data fra en testsekvenseringskørsel viste imidlertid ikke berigelse i sammenligninger mellem ELTP- og UBQ10-drevne linjer for kendte endodermisspecifikke gener. Ved nærmere eftersyn af disse planter fandt vi et fald i signalet i de ydre vævslag, mens stelevæv udviste et stærkt udtryk (figur 6B). Fremtidige undersøgelser bør søge i promotorlandskabet efter mere egnede kandidater og supplere TRAP-metoden.

I alt RNA som kontrolprøve
Etableringen af en bedre TRAP-kontrollinje er endnu ikke afsluttet og vil med spænding blive forudset af marken. Med dette i tankerne, hidtil den eneste måde at opnå en væv-dækkende ensartet fordeling af mRNAs er at indsamle samlede RNA. Da der i dette tilfælde udtages prøver af et transskription, skal dette tages i betragtning i den yderligere bioinformatikanalyse. Især er både de samlede RNA- og polysome RNA-fraktioner nu korreleret, da de stammer fra den samme vævsprøve.

På jagt efter en TRAP bibliotek forberedelse metode
Som tidligere nævnt er en væsentlig ulempe ved TRAP-metoden de varierende og for det meste lave udbytter, der kan opnås. Med prøver, der spænder fra få ng til undertiden op til 100 ng en standard tilgang med Illumina TruSeq kit (100 NG input krav) blev anset for for ufølsom til opførelse af biblioteker af tilstrækkelig kvalitet. En markedssøgning afslørede flere kommercielt tilgængelige bibliotek forberedelse kits, der blev specificeret til at arbejde med så lavt som 5-10 ng udgangsmateriale. Vi har ikke testet den protokol, der anvendes af Reynoso et al. 2019, som arbejder for deres TRAP prøver fra tomat, ris og Medicago og bruger BrAD-seq tilgang60.

Alle vores forsøg, dog med efterfølgende test sekventering gav utilfredsstillende resultater. På trods af brugen af polyA-berigelsestrin led TRAP-prøverne af høje ribosomalforureninger (op til 30 % af læsningerne). Desuden var succesraten for bibliotekets forberedelse variabel og især lav for prøver med kritisk lave koncentrationer eller relativt lavere RIN-værdier. Vores omfattende test fører os til den konklusion, at den specifikke RNA-sammensætning af en TRAP-prøve med meget højt rRNA-indhold og formentlig minutter af mRNA-koncentrationer kræver en mere følsom tilgang for at opnå pålidelige biblioteker. Således henvendte vi os til state-of-the-art løsninger til ultra-lave input mængder: SMARTer v4 og Nextera XT. Beroligende, Song et al. fandt også dette bibliotek forberedelse tilgang til at udkonkurrere deres konkurrenter, når de testede flere metoder og deres sekventering output på TRAPed levervæv61. De kvalitetsmålinger, vi har præsenteret i figur 4D, udviser læser af høj kvalitet (Q>30) ved lave rRNA-kortlægningsrater (<3%) samtidig med høje genkortlægningsrater. Derudover konsekvent høje Spearman korrelationskoefficienter viser, at replikater har faktisk meget lignende udtryk profiler. Brugen af begge kits var ligetil med beskedne cyklus numre og gav robuste og pålidelige resultater. Sekventeringsdata var af høj kvalitet med 1,5 ng udgangsmateriale. Med SMARTer-sættet, der tolererer så lavt som 200 pg input, kan mængden af anlægsudgangsmateriale optimeres. Anvendeligheden for sjældnere celletyper vil i sidste ende blive bestemt af muligheden for at opsamle nok RNA.

TRAP supplerer plantevidenskabelig værktøjskasse
TRAP-metoden er blevet mere og mere populær hos planteforskere34, og vi er overbeviste om, at den vil opnå status som standardteknik af flere årsager.

Ingen af trinene i TRAP-protokollen behøver specialiseret udstyr, som en cellesorteringsmaskine eller et dedikeret lasercapture-mikroskop, hvilket gør det muligt for mange laboratorier at udføre eksperimenterne. Til dato er de dyreste faktorer bibliotek forberedelse og downstream sekventering. Ikke desto mindre forventer vi, at omkostningerne vil falde betydeligt med den dynamiske udvikling af næste generations sekventeringsteknikker og stigende efterspørgsel efter encellede sekvensering.

Desuden betyder isoleringen af polysome-associerede RNA'er, at der indsamles oplysninger om disse RNA'ers aktive oversættelsesstatus (translatome). Derfor fanger TRAP produktionen af alle lovgivningsmæssige trin, der er opstrøms for oversættelse og repræsenterer en mere direkte proxy for den cellulære proteinsammensætning. Naturligvis er ribosomer og posttranslationelle ændringer stadig undvigende og skal håndteres ved andre tilgange (f.eks. proteomics).

Som tidligere nævnt er en klar fordel, som TRAP har i en plantesammenhæng, bevarelsen af CW-strukturer og cellernes mekaniske egenskaber. Da vi først begynder at forstå de indviklede forbindelser og regulerende funktioner, der opstår gennem CW- og mekanisk signalering31,62, tilgange, der bevarer disse strukturer vil blive vigtigere i mange forskellige udviklingsmæssige sammenhænge.

Især for veletablerede modelarter kan TRAP drage fordel af et væld af forskellige initiativtagere, der er blevet karakteriseret. I Arabidopsisvar det således muligt at kortlægge hele roden på en celletypespecifik måde ved hjælp af 19 forskellige markørgenpromotorer30,63. Med hvert RNA-seq-eksperiment vil disse valg blive forbedret, og der vil opstå nye, mere specifikke promotorer og forfine celleopløsningen.

TRAP kan desuden anvendes i en kombinatorisk anvendelse med mange initiativtagere til cellepopulationer, hvor der endnu ikke er kendt nogen markører. Dette er tilfældet for specialiserede celler i roden endodermis. De såkaldte passage celler er karakteriseret ved absense af suberin lag, der frakker modne endodermis celler53. Ved at kombinere egnede initiativtagere og efterfølgende i silico subtraktion af de forskellige udtryksprofiler vil berige for regioner, der huser passageceller. Transskriptionel reporter analyse vil derefter hjælpe med at identificere passage celle markør gener. Men om TRAP kan bruges til derefter at analysere den sjældne cellepopulation på dette grundlag, er dog endnu ikke fastlagt.

I denne artikel har vi givet en detaljeret beskrivelse af den oversætte-ribosom affinitet rensning metode, dens fordele og begrænsninger, og fremhævede potentielle anvendelser heraf. I porteføljen af "omics" undersøgelser, indtager det en vigtig niche og vil bidrage til at besvare mange biologiske spørgsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Jean-Claude Walser fra Det Genetiske Mangfoldighedscenter Zürich for afgørende ekspertrådgivning i den tidlige fase af dette projekt. Arbejdet i Vermeer-laboratoriet blev støttet af et SNF Professorship grant (PP00P3_157524) og et Tilskud til R'EQUIP-udstyr (316030_164086) fra Swiss National Science Foundation (SNSF), der blev tildelt JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

Tags

Udviklingsbiologi Arabidopsis TRAP TRAP-seq translatomprofilering celletypespecifik RNA-seq lateral roddannelse endodermisdifferentiering
Oversættelse ribosom affinitet Rensning (TRAP) til at undersøge <em>Arabidopsis thaliana</em> Root Development på en celletype-specifik skala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thellmann, M., Andersen, T. G.,… More

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter