Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Abstract

In dit artikel geven we hands-on instructies om translationoom gegevens te verkrijgen van verschillende Arabidopsis thaliana wortelceltypes via de vertaalribomasoom affinity purification (TRAP) methode en opeenvolgende geoptimaliseerde low-input bibliotheek voorbereiding.

Als uitgangsmateriaal maken we gebruik van plantlijnen die GFP-gelabelde ribosomal eïne RPL18 op een celtype-specifieke manier uitdrukken door gebruik te maken van adequate promotors. Voorafgaand aan immunozuivering en RNA-extractie wordt het weefsel vastgemaakt, wat de weefselintegriteit behoudt en tegelijkertijd de uitvoering van tijdreeksstudies met een hoge temporele resolutie mogelijk maakt. Met name celwandstructuren blijven intact, wat een groot nadeel is in alternatieve procedures zoals op fluorescentie geactiveerde celsorteermethoden die afhankelijk zijn van weefselprotoplasting om verschillende celpopulaties te isoleren. Bovendien is er geen weefselfixatie nodig zoals in lasercapture op microdissectie gebaseerde technieken, waardoor rna van hoge kwaliteit kan worden verkregen.

Echter, bemonstering van subpopulaties van cellen en alleen isoleren polysome-geassocieerdRNA ernstig beperkt RNA opbrengsten. Het is daarom noodzakelijk om voldoende gevoelige bibliotheekbereidingsmethoden toe te passen voor succesvolle gegevensverwerving door RNA-seq.

TRAP biedt een ideaal hulpmiddel voor plantenonderzoek, omdat veel ontwikkelingsprocessen celwandgerelateerde en mechanische signaleringstrajecten omvatten. Het gebruik van promotors om specifieke celpopulaties te richten overbrugt de kloof tussen orgaan- en eencellige niveau dat op zijn beurt te lijden heeft onder weinig resolutie of zeer hoge kosten. Hier passen we TRAP toe om celcelcommunicatie te bestuderen in laterale wortelvorming.

Introduction

Gedreven door de toenemende toepassing van next-generation sequencing technieken, ruimtelijke resolutie in de ontwikkelingsbiologie zou kunnen worden uitgebreid. Hedendaagse studies zijn gericht op het ontleden van weefsels tot gespecialiseerde celtypes, zo niet eencellige niveau1,2,3,4. Daartoe is in de afgelopen vijftig jaar een overvloed aan verschillende methoden bedacht (zie figuur 1A)5,6,7,8,9,11,11,12,13,14,15.

Veel instrumenten in de plantenwetenschap zijn aanpassingen van technieken die werden pionier in dierlijk onderzoek. Dit is niet het geval voor de methode die we hier in detail introduceren. In 2005, uitgerust met een sterke achtergrond in eiwitvertaling, ging het Bailey-Serres Lab op zoek naar ribosomale eiwitten voor latere affiniteitszuivering16. Zo konden ze tijdrovende en arbeidsintensieve polysome profilering vermijden, die is gebaseerd op ultracentrifugatie met een sacharosegradiënt en werd gebruikt om het vertalen van ribosomen te beoordelen sinds de jaren 196017,18. De methode is sindsdien aangeduid als translationele ribosoom affiniteit zuivering (TRAP)16. Na succesvolle translationoomstudies in planten, hebben Heiman et al. TRAP voor dieren19 en anderen de toepassing ervan uitgebreid tot gist20, Drosophila21, Xenopus22 en zebrafish23,24.

Hoewel genetische modificatie van het modelsysteem een voorwaarde is voor TRAP, dat de toepassing ervan beperkt tot soorten die vatbaar zijn voor genetische transformatie, kan men dit bezwaar tegelijkertijd benutten om subgroepen van cellen aan te pakken die van bijzonder belang zijn en anderszins uiterst moeilijk te isoleren van het intacte weefsel/orgaan25 (bijvoorbeeld sterk vertakte dendritische cellen in een muishersenof schimmelhyphae in besmet plantaardig weefsel). In planten worden alle cellen op hun plaats gehouden via celwanden die de basis vormen van het hydrostatische skelet26. Om een plantencel uit deze matrix te bevrijden, hebben wetenschappers de cel fysiek uit zijn omringende weefsel gesneden door middel van lasercapture microdissectie (LCM)27 of enzymatische spijsvertering van de celwandenuitgevoerd 28. Onder de laatste cellen, de zogenaamde protoplasten, is de populatie van belang fluorescerend gelabeld en kan worden gescheiden via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)7. LCM vereist meestal een monster te worden vastgesteld en ingebed in was, die uiteindelijk verslechtert de kwaliteit van haar RNA29. FACS-gebaseerde methoden leveren rna van hoge kwaliteit op, maar het proces van protoplasting zelf introduceert verschillen in genexpressie30 en weefsels met gemodificeerde en dikke secundaire celwanden zijn notoir moeilijk te behandelen. Bovendien wordt aangenomen dat veel ontwikkelingsprocessen in installaties afhankelijk zijn van mechanisch overgebrachte signalen en daarom is de integriteit van de celwand van het grootste belang31. Twee methoden, die een snelkoppeling gebruiken om celisolatie te omzeilen door te werken op het niveau van nucleii, zijn fluorescentie-geactiveerde nucleaire sortering (FANS) en isolatie van kernen die zijn getagd in specifieke celtypen (INTACT). Net als in TRAP gebruiken ze celtypespecifieke promotors om kernen te markeren, die vervolgens verrijkt worden via sorteren of naar beneden trekken, respectievelijk8,15. Een grote uitdaging voor al deze benaderingen is om voldoende RNA-materiaal te krijgen uit subsets van cellen in een weefsel. Aangezien TRAP slechts een fractie van de cellulaire RNA's vangt, is monsterverzameling een aanzienlijk knelpunt. Daarom zijn er vooral gevoelige protocollen voor de voorbereiding van bibliotheken nodig om gegevens van hoge kwaliteit te produceren van lage invoerhoeveelheden.

Sinds de oprichting is TRAP ofwel gebruikt in combinatie met DNA-microarrays of, aangezien de sequencingkosten de afgelopen jaren aanzienlijk daalden, RNA-seq10,32,33. Een veelheid van onderzoeksvragen is al opgehelderd zoals beoordeeld in Sablok et al.34. We zijn ervan overtuigd dat er de komende jaren meer rapporten zullen volgen, omdat de techniek zeer veelzijdig is bij het combineren van verschillende promotors om specifieke celtypen te targeten. Uiteindelijk zal dit zelfs op een ondoordringbare manier gebeuren, en kan worden gecombineerd met het indringende van de reactie van de plant op vele biotische en abiotische stressfactoren. Bovendien, waar stabiele transgene lijnen niet beschikbaar zijn, zijn harige wortelexpressiesystemen ook met succes gebruikt om TRAP uit te voeren in tomaat en medicago35,36.

Figure 1
Figuur 1: Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) vormt een aanvulling op het "omics" analyseportfolio. A. Het verhogen van de mate van analytische precisie, tot eencellige of zelfs subcellulaire resolutie kan worden bereikt door een overvloed aan methoden of combinaties daarvan. De regeling geeft een overzicht van de momenteel beschikbare gereedschappen op het gebied van planten en dieren. Weefselverzameling bij cellulaire resolutie kan worden bereikt door protocollen zoals LCM of FACS, die vervolgens worden gekoppeld aan standaard transcriptome of polysome profiling /translatome analyse. TRAP en INTACT integreren zowel weefselopname als RNA-isolatie omdat ze gebaseerd zijn op epitoop-tagging. INTACT monstert echter alleen celkernen en vormt daarom een speciaal geval van transcriptoomanalyse. Een klein konijn pictogram markeert nieuw ontwikkelde methoden in het gebied van dieren: Terwijl SLAM-ITseq en Flura-seq vertrouwen op metabole targetting van ontluikende RNAs met gemodificeerde uracil bases in cellen uitdrukken van de tolerante enzym, Slide-seq maakt gebruik van een gecoate glazen dia met DNA barcodes die positionele informatie in het cellulaire bereik. Een proximity labeling benadering wordt gevolgd in APEX-seq om RNA's te proeven in specifieke subcellulaire compartimenten. Met name een verhoogde resolutie vereist vaak de productie van transgeen materiaal (sterretjes) en deze methoden worden dus voornamelijk gebruikt voor modelsoorten. TRAP is vooral geschikt voor plantenwetenschappelijke studies waarbij celwand (CW) of mechanische signalering en celsoorten die moeilijk te bevrijden zijn uit hun CW-matrix. B. Gedetailleerde wet-lab stappen van de TRAP procedure: Zaailingen uitdrukken GFP-gelabeld ribosomal eiwit in verschillende celtypes (bijvoorbeeld wortel endodermis) worden geteeld op petrischaaltjes gedurende zeven dagen en wortelmateriaal geoogst door snap bevriezing. Een totaal RNA controlemonster wordt verzameld uit het gehomogeniseerde ruwe extract voordat pelleting het puin via centrifugeren. Magnetische anti-GFP kralen worden toegevoegd aan het gewiste extract om immunoneerslag uit te voeren. Na incubatie en drie wasstappen wordt het polysome-geassocieerde RNA (TRAP/polysome RNA) rechtstreeks verkregen via fenol-chloroform extractie. LCM: lasercapture microdissectie, FACS/FANS: fluorescentie-geactiveerde cel/nucleaire sortering, APEX-seq: methode gebaseerd op ontworpen ascorbate peroxidase, INTACT: isolatie van kernen die zijn getagd in specifieke celtypen, SLAM-ITseq: thiol(SH)-gekoppelde alkylation voor de metabole sequencing van RNA in weefsel, Flura-seq: fluorourcila-label RNA-sequencing (Gemaakt met Biorender.com) Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Het doel van dit artikel is om een gedetailleerde beschrijving van de TRAP-methode te geven, om kritieke stappen te markeren en om richtlijnen te bieden voor een mogelijke methode voor het voorbereiden van bibliotheken.

Een generiek TRAP-experiment zal hoofdzakelijk bestaan uit de volgende stappen (zie ook figuur 1B):(1) Bereiding van plantaardig materiaal, met inbegrip van het klonen van ribosoom-tagging constructie, transgene lijnproductie en -selectie, het kweken en ophopen van zaden, sterilisatie en beplating, en stresstoepassing/behandeling (optioneel) en weefseloogsten; (2) immunozuivering, met inbegrip van weefselhomogenisatie en clearing van het ruwe extract, de wassen van de kraal en de immunozuivering, en de wasstappen; (3) RNA-extractie en kwaliteitsbeoordeling; en (4) bibliotheekvoorbereiding.

De Arabidopsis wortel is een modelsysteem om plantontwikkeling te bestuderen sinds de introductie als een model plant37,38. Hier wordt de toepassing van TRAP getoond in de context van de ontwikkeling van de wortel van planten. Bij planten is de opbouw van het gehele wortelstelsel afhankelijk van de uitvoering van dit programma en is daarom zeer belangrijk voor de overleving van het organisme39. In Arabidopsiszijn laterale wortels afkomstig van pericycleweefsel dat naast xylemvaten ligt en daarom xylempaalpericycle (XPP; zie figuur 2C)40. Sommige XPP-cellen, die zich diep in de wortel bevinden, verwerven een identiteit van de stichterscel en beginnen zich, na een lokale hormonale trigger, te vermenigvuldigen door anticlinally te zwellen en te delen41. Echter, als gevolg van de aanwezigheid van een stijve celwand matrix, dit proces oefent mechanische stress op de omliggende weefsels. Met name de bovenliggende endodermis wordt beïnvloed, omdat deze in de weg staat van de laterale wortelgroeias42,43,44. Inderdaad, de nieuw gevormde primordium zal moeten groeien door de bovenliggende endodermis cel (Figuur 2C2), terwijl cortex en opperhuid cellen zijn gewoon opzij geschoven voor de primordium om eindelijk te voorschijn45,46. Recent werk in ons lab heeft aangetoond dat de endodermis actief bijdraagt aan de proliferatie in de pericycle. Gerichte blokkering van endodermale hormonale signalering is voldoende om zelfs de allereerste divisie in de XPP-cellen47te remmen. Vandaar, pericycle-endodermis communicatie vormt een zeer vroege checkpoint voor laterale wortel ontwikkeling in Arabidopsis. Het is echter niet bekend hoe deze crosstalk wordt uitgevoerd. Om dit mysterie te ontrafelen, kozen we voor de TRAP-seq-benadering om XPP- en dodermale cellen te targeten. Om te verrijken voor cellen in het laterale wortelprogramma, bootsten we de hormonale trigger na door een auxine analoog (1-naphthaleneacetisch zuur, NAA)48exogenly toe te passen, waardoor tegelijkertijd de eerste fase van laterale wortelvorming tijdelijk kon worden opgelost.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klonen van transgene, transgene lijnproductie en selectie

  1. Kloon de promotor van keuze in de juiste ingangsvector. Gebruik een op recombinatie gebaseerde kloonmethode (Table of Materials)en combineer de promotors in pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (met affiniteitstag of fluorescerend eiwit naar keuze) met behulp van recombinatie-gebaseerd klonen in pDONRP1-P249.
  2. Combineer de instapvector die RPL18 bevat met de promotorbevattende ingangsvector in een tweefragmentrecombinatiereactie in de juiste bestemmingsvector met FAST-red selectiecassette50 om directe selectie van transgene zaden te vergemakkelijken.
  3. Controleer de opnieuw gecombineerde vector door te rangschikken en om te zetten in geschikte, competente agrobacteriën. Bloem dip Arabidopsis planten en na 3-4 weken oogsten en selecteer T1 zaden51.
  4. Gebruik microscopie om goed uitdrukkende lijnen te identificeren en expressiepatronen te verifiëren op basis van de gerapporteerde promotoractiviteit in meerdere onafhankelijke lijnen. Selecteer regels met een representatief expressiepatroon met één T-DNA-invoeging. Dit kan helpen om het zwijgen te minimaliseren en zal voordelig zijn voor genetische kruisen.
  5. Selecteer T3-nakomelingen die homozygous zijn voor het markergen.

2. Voortplanting en sterilisatie

  1. Celtype-specifieke TRAP isoleert RNA van een beperkt aantal doelcellen per wortel. Om het benodigde uitgangsmateriaal te genereren, propageer je homozygouslijnen. Gebruik hiervoor standaard groeiomstandigheden met een speciale focus op schimmelgroeicontrole.
    OPMERKING: Als afzonderlijke invoeglijnen niet kunnen worden verkregen, groeien partijen in grote populaties over enkele generaties om T-DNA-geïnduceerde transgenerationele uitschakeling te voorkomen.
  2. Steriliseren grote hoeveelheden Arabidopsis zaden met een ronde chloorgas en een ronde van 70% EtOH.
    1. Verdeel de zaden gelijkmatig over 12 cm x 12 cm vierkante petrischaaltjes (minder dan 0,3 mL zaden/plaat) en stapel ze in een desiccator of andere geschikte container. Vermijd klonterof of hoop vorming als de zaden moeten toegankelijk zijn voor het gas. Voer gassterilisatie 's nachts uit met bleekmiddel en HCl-volumes zoals gerapporteerd52: 100 mL bleekmiddel (13%) met 6 mL conc. HCl in een 60 L desiccator. Defumigate gedurende ten minste 1 uur alvorens de zaden te verzamelen in een steriele container.
      LET OP: 37% HCl is zeer corrosief en vereist een zorgvuldige behandeling. Chloorgas is giftig, gebruik een rookkap.
    2. Neem 0,1 mL droge, gasgesteriliseerde zaden per plaat en meng ze met sterilisatieoplossing (70% EtOH, 0,01% Tween) bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 20 min, decantet etoh en was de zaden 3-4 keer met steriele H2O.
    3. Breng de geweekte zaden in buizen van 50 mL en verdun met steriele 0,1% agar om 1 mL gegoten zaaddrijfmest per plaat te verkrijgen (0,1 mL zaad/1 mL drijfmest).
      OPMERKING: Als gevolg van transgene integratiegebeurtenissen kunnen plantlijnen gevoelig zijn voor verschillende sterilisatietechnieken; vooral EtOH incubatietijd bleek kritisch te zijn. In onze handen waren de dubbele sterilisatiestappen nodig om schimmelbesmetting tijdens de experimenten te voorkomen. Dit is vooral belangrijk bij het uitvoeren van tijdreeksen als verontreiniging van een enkel tijdspunt belemmert het hele experiment. Het zou goed kunnen dat dubbele sterilisatie niet altijd nodig is, afhankelijk van de lokale groeiomstandigheden.

3. Plating

  1. Bereid deze stappen van tevoren voor. Giet 1/2 MS-platen (pH 5,8) met 1% agar in de hoeveelheden die nodig zijn voor het experiment (20-30 per monster/tijdpunt). Knip 1 mL pipettips om de tipdiameter te vergroten tot ca. 3-4 mm met een scheermesje. Autoclave de tips. Maak een sjabloonhouder voor het beplaten van drie rijen zaden per bord met vierkante petrischaaldeksels. Bereid een laminaire stroomkap voor om een steriele werkomgeving te bieden en de te verwerken platen te etiketteren.
    OPMERKING: Als veel platen tegelijkertijd worden verwerkt, kunnen gekleurde labels de etikettering versnellen.
  2. Plaats lege agarplaten in de sjabloonhouder en verdeel 1 mL van ingelegde zaden gelijkmatig over drie rijen. Plaats de verwerkte platen in stapels in de laminaire stroom totdat de zaden droog zijn (d.w.z. vasthouden aan het agar-oppervlak). Laat de platen niet langer als de agar zal uitdrogen ook.
  3. Zodra de zaden voldoende droog zijn, sluit u de deksels en sluit u elke plaat af met microporetape. Bevredig de zaden twee dagen bij 4 °C in het donker en plaats ze daarna in een groeikamer.

4. Weefselbehandeling (optioneel)

OPMERKING: In dit protocol schetsen we de exogene behandeling van Arabidopsis wortels met de synthetische auxine variant NAA. Afhankelijk van de experimentele vraag die bij de hand is, moet dit onderdeel worden aangepast of volledig worden weggelaten.

  1. Bereid stroken tissuepapier van 1,5 - 2 cm hoog en 10 cm lang. Langere incubatietijden vereisen dat het weefsel moet worden autoclaved voorafgaand aan het gebruik.
  2. Verwijder de micropore tape van alle platen die de hormoonbehandeling moeten ondergaan. Verdun 1 mL van 10 mM NAA (opgelost in DMSO) in 1 L vloeistof, autoclaved 1/2 MS oplossing (pH 5.8) en week het tissuepapier in de oplossing (10 μM NAA).
  3. Gebruik een pincet om een strook van tissue papier toe te passen op elke rij wortels. Gebruik voorzichtig vingers om luchtbellen te verwijderen. Leeg overtollige vloeistof van de plaat, sluit het deksel en bewaar de plaat met de tijd. Voor langere incubatietijden plaatst u de platen terug in de groeikamer.

5.

  1. Haal platen op voor elke biologische replica/tijdpunt/behandeling. Verzamel vloeibare stikstof in een schoon Dewar-vat en etiketbuizen (15 of 50 mL) voor de verschillende weefselmonsters. Bereid een piepschuimhouder voor.
    LET OP: Maak kennis met vloeibare stikstof behandelingsprocedures (beluchting, bevriezingen, mogelijk exploderende buizen).
  2. Open de plaat en verwijder het tissuepapier met tangen, wees voorzichtig om de wortels niet los te maken van het agar-oppervlak. Met een chirurgisch mes, snijd eenmaal per rij langs de shoot-root-splitsing in een enkele, vastberaden slag. Maak de messen tussen de monsters schoon en wissel regelmatig uit om scherpte te garanderen.
  3. Veeg met een pincet langs de wortels van elke rij om ze in drie bundels te verzamelen. Pak de wortels en leg ze in een 50 mL buis gevuld met vloeibare stikstof te breken bevriezen.
    OPMERKING: Probeer niet om wortels te monteren in dichte structuren (zoals ballen) als ze moeilijk te malen in de volgende stap.
  4. Ga verder met alle platen die één monster vormen (in volgorde van incubatietijd) en giet overtollige vloeibare stikstof uit. Gebruik het buisdeksel om te voorkomen dat de wortels morsen. Sluit vervolgens het deksel en verzamel alle buizen in het Dewar schip. Bewaar het wortelweefsel op -80 °C.

6. Immunozuivering

OPMERKING: Deze stap is gericht op het verkrijgen van hoogwaardige TRAP / polysome RNA. Volg daarom strikt het advies van goede praktijken voor RNA-behandeling. Voer alle stappen in deze sectie uit in een steriele bank en reinig alle apparatuur en labware met een RNase-verwijderende oplossing (Table of Materials). Draag handschoenen en verander ze onmiddellijk wanneer ze besmet zijn met monster, ijs of andere bronnen die niet zijn gereinigd. Aangezien dit een zeer cruciaal aspect is, is een gedeelte over hergebruik van apparatuur en advies over afvalverwijdering opgenomen.

  1. Buffervoorbereiding
    1. Bereid voorraadoplossingen voor volgens tabel 1 en autoclave (A) of filtersteriliseren (?). Tenzij anders aangegeven, is het oplosmiddel RNase-vrij water.
    2. Oplossen en aliquot dithiothreitol (DTT), fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), cycloheximide (CHX) en chlooramphenicol (CAM) in hun respectieve oplosmiddelen zoals aangegeven in tabel 1 en bewaar ze op -20 °C. Alle andere voorraden kunnen op kamertemperatuur blijven.
    3. Meng de voorraden voor - met ingrediënten 1-4 voor wasbuffer (WB) en 1-6 voor polysome extractiebuffer (PEB) - om tijdrovende buffermente vóór elke extractie te voorkomen. Voeg dus alleen water en de bevroren ingrediënten (7-10) toe op de dag van de extractie. Houd de voorgemengde voorraden en RNase-vrij water op 4 °C.
      OPMERKING: De DTT-concentratie is 1/5 van de gerapporteerde concentratie van Zanetti et al. 2005, omdat de nanobody-interactie met de GFP gevoelig is voor hoge DTT-concentraties.
Ingrediënten Voorraadconcentratie Voeg volume in mL toe voor 50 mL WB* Voeg volume in mL toe voor 50 mL PEB*
1 Tris, pH 9 A 2 M 5 5
2 Kcl A 2 M 5 5
3 EGTA (EGTA) A 0,5 m 2.5 2.5
4 MgCl2 A 1 M 1.75 1.75
5 Pte A 20% (v/v) 0 2.5
6 wasmiddelmix A 0 2.5
Tween 20 20% (v/v)
Triton-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (w/v)
Igepal (Igepal) 20% (v/v)
7 Dtt ₳ 0,5 m 0.1 0.1
8 PMSF PMSF ₳ 0.1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cycloheximide ₳ 25 mg/mL (EtOH) 0.1 0.1
10 Chlooramfenicol ₳ 50 mg/mL (EtOH) 0.05 0.05

Tabel 1: Buffersamenstelling en mengadvies. Ingrediënten met de gegeven voorraadconcentraties gemengd in de gegeven hoeveelheden leveren 50 mL WB of PEB op. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan, EGTA: ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N',N'-tetra-azijnzuur, PTE: Polyoxyethyleen-(10)-tridecylether, A: autoclave, ?: filter-steriliseren; *vul tot 50 mL met RNase-vrij water.

  1. Weefselhomogenisatie/slijpen
    1. Koel de centrifuge af en plaats homogenisatoren en centrifugebuizen op ijs. Ontdooi aliquots van DTT, PMSF, CHX en CAM. Meng PEB en WB uit de voorraadoplossingen in 50 mL buizen volgens de eisen van de dag (# van monsters) en koel op ijs.
      OPMERKING: Voeg PMSF pas kort voor gebruik toe, omdat de halveringstijd van PMSF in water slechts 30 minuten is.
    2. Bereid veel vloeibare stikstof in een Dewar-vat en haal weefselmonsters op uit -80 °C-opslag. Draag katoenen handschoenen onder de standaard labhandschoenen om brandwonden door koude mortieren te voorkomen. Giet vloeibare stikstof in mortieren en stamperen tot ze koud genoeg zijn om malen mogelijk te maken. Het wordt aanbevolen om een systeem te bedenken om mortels te onderscheiden (label of in een bepaalde volgorde te bewaren).
    3. Leeg weefsel monster in een mortel en zorgvuldig malen totdat al het materiaal is een wit poeder. Voeg indien nodig vloeibare stikstof toe om het weefsel bevroren te houden of om beter slijpen te vergemakkelijken.
    4. Voeg 5 mL PEB toe aan het monster en meng snel met het poeder voordat de buffer bevriest. Terwijl dit monster ontdooit (mix van tijd tot tijd) verwerken een ander monster.
    5. Zodra het mengsel kan worden overgedragen, leg de drijfmest in een glazen homogenisator en blijf op ijs. Spoel met nog eens 2 mL PEB de mortel en stamper af en voeg deze toe aan het monster in de homogenisator.
      LET OP: Vermijd een volledig vloeibaar monster, omdat dit RNA-afbraak mogelijk maakt.
    6. Maal de drijfmest handmatig tot het extract homogeen is. Wij raden een minimum van 4 tot 5 duiken.
      LET OP: Het kan enige extra wachttijd vereisen om de drijfmest verder te laten ontdooien. Behandeling van homogenisatoren vereist enige zorgvuldigheid. Pas niet brute kracht toe en pas op voor zuigkrachten. Indien geen rekening wordt gehouden, zal dit leiden tot morsen, contaminatie of vernietiging van de homogenisator.
    7. Giet het ruwe wortelextract in een centrifugebuis van 50 mL (blijf op ijs).
      OPMERKING: Meestal kunnen meerdere monsters worden gemalen voor de overdracht. Parallelle behandeling van slijpen, overzetten en homogeniseren is vereist. Probeer snel te werken, maar haast je niet; blijf kalm. Bewaar altijd gehomogeniseerde monsters op ijs.
  2. Totale RNA-monsterverzameling
    1. Breng 200 μL aliquots van elk ruw monster over op een schone microcentrifugebuis (vooraf gelabeld en gekoeld op ijs).
    2. Ga verder met de RNA-extractie zoals beschreven voor TRAP-monsters in de punten 7.1 en 7.2. Doe deze stappen terwijl de monsters in de centrifuge worden gewist.
    3. Voer een DNase behandeling uit met het geresuspendeerde totale RNA om DNA-contaminatie te elimineren en de reactie op te ruimen met behulp van een commerciële kit(Table of Materials).
      OPMERKING: De totale RNA-extracties leveren meestal hoge concentraties op en monsters moeten aanzienlijk worden verdund. Wij raden aan de concentratie na verdunning te meten aan de door het gevoelige Qubit-protocol.
  3. Het ruwe extract wissen
    1. Neem de ijsemmer met monsters van 6.2.7 en centrifugeer ze gedurende 15 min bij 16.000 x g en 4 °C.
      LET OP: Om de centrifuge in evenwicht te brengen, paar je monsters dienovereenkomstig. Als dit niet helemaal mogelijk is, past u één monster aan door PEB toe te voegen.
    2. Giet de supernatant aan een verse centrifugebuis (vooraf gekoeld op ijs) en herhaal de centrifugatie (15 min bij 16.000 x g en 4 °C). Deze overdracht kan snel naast de centrifuge worden uitgevoerd.
    3. Terwijl het ruwe extract is clearing, start het wassen van GFP-kralen voor stap 6.6.
      LET OP: Houd deze ijsemmer voor schommelen op de shaker, maar niet terug te plaatsen in de steriele bank als het zou kunnen worden besmet.
  4. Kraalwassen
    1. Aliquot magnetische GFP-kralen (#samples x 60 μL, Materiaaltafel)in een buis van 1,5 mL. Plaats op de magnetische standaard. Zodra de kralen hebben verzameld, verwijder de supernatant.
    2. Voeg 1 mL koude WB toe, hang de kralen opnieuw op en verzamel ze opnieuw. Gooi de wasbuffer weg en herhaal nogmaals met 1 mL WB.
    3. Uiteindelijk, resuspend de kralen in WB aan het oorspronkelijke volume gebruikt in stap 6.5.1.
  5. Immunopurification (IP)
    1. Giet onmiddellijk na de centrifugatie de gerooide supernatant in gelabelde 15 mL-buizen en voeg 60 μL gewassen kralen per monster toe.
    2. Plaats alle monsters horizontaal in de ijsemmer en leg het op een shaker. Laat het mengsel 2 uur uitbroeden om de polyssomeen met gfp-label aan de kralen te binden.
    3. Verzamel de kralen op de magnetische standaard voor 15 mL buizen (op ijs) en voeg PMSF toe aan de resterende PEB. Gooi de supernatant weg. Giet ongeveer 5 mL PEB aan de kralen en resuspend ze door kantelen. Schud de monsters gedurende 15 min in dezelfde opstelling als in punt 6.6.2.
    4. Herhaal de wasbeurten met WB tot een totaal van 3 wasbeurten (1 x PEB, 2 x WB). Voeg voor elke bufferuitwisseling PMSF toe.
    5. Verzamel de kralen in 1 mL wb en breng ze over naar een buis van 1,5 mL. Tot slot, verzamel de kralen nog een keer op de magnetische standaard en verwijder alle vloeistof. Sluit de buis en houd op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt.
    6. Transporteer de monsters naar een rookkap voor RNA extractie.
  6. Afvalverwerking en reconditionering van laboratoriumbenodigdheden.
    1. Indien uitgevoerd volgens goede laboratoriumpraktijken (zie punt 2.2.1), levert de sterilisatieprocedure een waterige NaCl-oplossing op. Laat het chloorgas, evenals de resterende HCl en bleekmiddel, te defumigate in de rookkap.
    2. PEB en WB verwijdering: Als CHX ontleedt bij hoge pH, verzamel alle vloeistoffen en breng naar pH>9. Gooi het vloeibare afval in het gehalogeneerde chemische afval. Alle vaste stoffen (weefsels, serologische pipetten, handschoenen, enz.) moeten als chemisch afval worden verwijderd.
    3. Verzamel fenolhoudende vloeistoffen afzonderlijk, evenals fenol-verontreinigd materiaal (tips, buizen en handschoenen).
    4. Handwasmortels, stampers en homogenisatoren (sponzen en borstel) met zeep en spoel grondig af. Bak het materiaal vervolgens 's nachts op >220 °C. Wikkel in aluminiumfolie voor de behandeling of plaats in een warmtebestendige, overdekte container.
    5. Borstel schone centrifugebuizen met wasmiddel en vervolgens diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandelen in de rookkap. Voeg hiervoor vloeibare DEPC toe aan gedeïoniseerd water (1 mL DEPC tot 1 L van H2O) en meng via schudden. Plaats de centrifugebuizen op een autoclavable lade die gemorst DEPC-water vangt. Giet de suspensie in de buizen en laat voor 3 uur of 's nachts. DEPC ontleedt in het daaropvolgende autoclavingproces.
      LET OP: DEPC is zeer giftig.

7. RNA-extractie en QC

  1. RNA-extractie
    1. Koel de tafelcentrifuge af tot 4 °C.
    2. Voeg 1 mL zuur-guanidinium-fenolgebaseerdrea(Tabel van materialen)toe aan elk monster, omte keren om de kralen of totale RNA-drijfmest opnieuw op te schorten en 5 min op ijs in te broeden. Niet vortex!
    3. Voeg 200 μL chloroform toe en incubeer gedurende 3 min op ijs. Dan grondig vortex de monsters.
    4. Om fasescheiding te helpen, centrifugeer op max. snelheid van 10-15 min, 4 °C.
    5. Label 1,5 mL low-retention tubes (Table of Materials) en aliquot 650 μL isopropanol in elk.
    6. Neem voorzichtig de bovenste waterfase (ca. 650 μL) en breng over op de voorbereide buizen met isopropanol. Vermijd het aanraken van de roze organische fase.
    7. Neerslag RNA 's nachts bij -20 °C.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de monsters op te slaan in isopropanol bij -20 °C of -80 °C en alleen te solubilize in water wanneer dat nodig is. Waterig RNA degradeert zelfs bij -80 °C wanneer het weken/maanden wordt opgeslagen.
  2. RNA neerslag
    1. Koel de tafelcentrifuge af tot 4 °C.
    2. Bereid verse 80% EtOH met RNase-vrij water en koel af bij -20 °C (5 min bij -80 °C helpt het proces te versnellen).
    3. Centrifugeer de monsters met een maximumsnelheid (ca. 13.000 x g)gedurende 30 min en gooi de supernatant weg. De pellet zal niet zichtbaar zijn, zo zorgvuldig pipetteeralsof het er was. Voeg 1 mL koude 80% EtOH toe en omkeren de buis een of twee keer.
    4. Centrifugeer opnieuw gedurende 30 minuten bij maximale snelheid en herhaal de was tot een totaal van twee wasbeurten.
    5. Draai 2 min naar beneden en verwijder alle resterende EtOH met een 10 μL tip. Laat de pellet 3-5 min drogen (niet meer) bij kamertemperatuur en laat de pellet opnieuw opschorten in 20 μL RNase-vrij water.
    6. Houd de monsters op ijs en voer zo snel mogelijk kwaliteitscontrole uit. Ga verder met het opslaan van de monsters op -80 °C. Vermijd vries-dooi cycli.
  3. Kwaliteitscontrole met behulp van speciale apparatuur (Tabel van materialen)volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

8. Voorbereiding van de bibliotheek

  1. cDNA synthese en versterking met de SMARTer v4 Ultra Low Input RNA Kit
    1. Bereken de verdunning van elk monster met 1,5 ng TRAP-RNA of totaal RNA in een volume van 4,75 μL. Voer alle reacties uit in PCR-buizen en verdun monsters met verse aliquots van RNase-vrij water.
    2. Voer alle stappen uit volgens de aanbevelingen van de fabrikant met 1/2 van de reactievolumes. Versterk de cDNA met 12-13 PCR cycli.
    3. Ruim de PCR op door 0,5 μL van 10x lysisbuffer en 25 μL SPRI-kralen (Materiaaltafel)toe te voegen. Als veel monsters worden verwerkt lysis buffer en kralen kunnen worden voorgemengd. Zorg ervoor dat de kralen gelijkmatig worden verspreid voordat pipetteren.
    4. Ga verder met het protocol in volledige reactievolumes (17 μL elutiebuffer). Laat de kralen niet langer dan 3 minuten drogen. Overgedroogde monsters kunnen mogelijk worden gered door langdurige incubatietijden.
    5. Meet de monsterconcentraties met de Qubit HS DNA-kit.
      LET OP: De SMARTer v4 kit kan verdragen tot 200 pg input. We hebben bibliotheken in gevallen waar Qubit waarden niet kon worden bepaald (onder 250 pg, detectie limiet) met een 16 cyclus PCR. Het beperkte invoermateriaal kan echter ook minder complexe bibliotheken opleveren.
  2. Fragmentatie en adapterligatie PCR met de Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. Verdun het cDNA met RNase-vrij water om een concentratie van 200 pg/μl en pipet 1,25 μL in een PCR-buis te verkrijgen.
    2. Voer alle stappen volgens de fabrikant met 1/4 de reactievolumes uit. Versterk het cDNA met 12 PCR-cycli en compatibele adapters voor de monsters die deel uitmaken van één sequencingpool. Met Illumina's Index Kits A en D kunnen tot 384 monsters worden gemultiplexed.
    3. Voeg voor de PCR-opruiming 12,5 μL resuspensiebuffer en 22,5 μL SPRI-kralen (0,9x verhouding) toe. Los het monster op met 22 μL elutiebuffer.
      OPMERKING: QC en pooling werd uitgevoerd door de sequencing bedrijf (Tabel van materialen) en dus geen kraal-gebaseerde normalisatie nodig was. De enzymatische fragmentatiereactie (tagmentatie) is zeer gevoelig voor materiaalinvoer omdat elk enzym slechts één keer snijdt. De concentratieaanbeveling daarom niet overschrijden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor kwaliteitsbeoordeling moet de bovengenoemde procedure worden onderzocht in verschillende tussenstappen: expressiepatroonvalidatie in planta, kwaliteitscontrole van het geïsoleerde polysomale RNA en van de uiteindelijke bibliotheken. qRT-PCR met behulp van bekende markergenen kan bovendien worden uitgevoerd om de respons op de behandelingstoestand te bevestigen of om de experimentele omstandigheden te verfijnen.

Confocale analyse van gfp-signaaldistributie
Om te controleren op zowel endodermale als XPP-expressiepatronen, analyseerden we homozygouslijnen van pELTP::GFP-RPL18 en pXPP::GFP-RPL18 door confocale microscopie. Figuur 2A en figuur 2B tonen representatieve planten met GFP-signalen (groen) die zijn tegengewerkt met propidiumjodide (magenta) om celwanden te schetsen. De doorsnede in figuur 2A1 toont een concentrische ring in de derde cellaag van buitenaf, die overeenkomt met de endodermis. Het endodermale GFP-signaal initieert kort boven de meristematische zone (figuur 2A2) en verschijnt zowel in de cytosol als rond de kernen van de cellen, wat overeenkomt met ribosomen. De XPP-lijn daarentegen vertoont twee verschillende polen, wat overeenkomt met de XPP (figuur 2B1). Ongeveer drie cellen bij elke pool beginnen boven de meristematic streek om een gfp signaal tentoon te stellen. Beide lijnen voldoen dus aan het lokalisatiepatroon van respectievelijk endodermis en XPP (figuur 2C)53.

Polysome RNA-validatie
Om de kwaliteit van het verkregen polysome RNA te bepalen hebben we kwaliteitscontrolemetingen uitgevoerd met behulp van twee geautomatiseerde elektroforesesystemen (Tabel van materialen) die werken met μL-invoerhoeveelheden en ook een RNA-integriteitsnummer (RIN)54berekenen. Het gepatenteerde algoritme kent een RIN-waarde toe tussen 1 en 10 aan elk elektropherogram en is een robuuste en reproduceerbare maat voor RNA-kwaliteit (d.w.z. degradatie) - hoe lager de waarde hoe meer gedegradeerd het monster is. Figuur 3 toont voorbeelden van de metingen die we verkregen uit polysome RNA. De meeste monsters vertonen nauwelijks een schijnbare afbraak met RIN-waarden variërend van 9-10, wat in overeenstemming is met eerdere rapporten55,56. Elke onjuiste behandeling, met name perioden van langdurige verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld kamertemperatuur) of RNase besmetting zou duidelijk zijn in dit stadium. Beide instrumenten berekenen ook de monsterconcentraties van hun elektropherogrammen (figuur 3A). Deze kunnen wezenlijk variëren en zijn meestal bij de lagere opsporingsgrens. Wij adviseren daarom fluorometrische metingen te gebruiken om concentraties nauwkeurig te kwantificeren.

Bibliotheek QC
Aangezien de meeste laboratoria de RNA-sequencing niet in huis uitvoeren, worden kwaliteitscontroles vaak uitgevoerd in gespecialiseerde faciliteiten met apparaten met een hoge doorvoer(Tabel van materialen). Ze beoordelen routinematig de kwaliteit en kwantificeren concentraties door qPCR en fluorometrische testen (Table of Materials) als nauwkeurige metingen zijn voorwaarde voor bibliotheek pooling. Niettemin, als de bibliotheek voorbereiding niet wordt uitbesteed, kan men het resultaat met gespecialiseerde apparatuur (Tabel van Materialen) monster. Figuur 4 toont sporen van met succes voorbereide bibliotheken met ons aanbevolen protocol (A) en benadrukt de robuustheid van de procedure ondanks verkleinde reactievolumes (B). Deel C illustreert substandaard monsters die het gevolg kunnen zijn van over-/onderfragmentatie, materiaalverlies tijdens het opruimen of mislukte adapterverwijdering. In het laatste geval kan een andere sanering met een strengere monster-kraal-verhouding helpen de verontreiniging te elimineren. Volledig mislukte monsters waren uiterst zeldzaam in onze handen en konden ontstaan op meerdere punten (bijvoorbeeld te hoge input voor de stochiometrische tagmentatie reactie).

De prestaties van gesequencede bibliotheken worden geïllustreerd in figuur 4D voor monsters van de endodermis in onze gemuteerde achtergrond. Bibliotheken van WT en/of pericycle presteren vergelijkbaar of zelfs beter. Ribosomal leest waren gemiddeld rond de 2% met slechts enkele monsters boven de 3%. Reads met een gemiddelde kwaliteitsscore boven de 30 waren constant boven de 90% al voor het filteren. De mapping vermogen van de gesequenced leest was even hoog variërend gemiddeld op 85%. Om de correlatie tussen biologische repliceert pairwise Spearman coëfficiënten werden berekend voor elk tijdspunt. Alle tests resulteerden in hoge coëfficiëntenwaarden.

Behandelingsrespons en verrijkingsanalyse
Voordat een genoom-spanning dataset wordt geproduceerd, kan TRAP RNA uit een pilot-experiment door qRT-PCR worden onderzocht om het succes van de behandeling en/of experimentele omstandigheden te valideren. We hebben dit type analyse uitgevoerd om de auxineresponsen na 2 uur behandeling in de XPP-monsters (figuur 5A) te beoordelen. Drie verschillende auxine-responsieve genen (GH3.3, LBD29 en GATA23) werden getest via de ∙∙Ct-methode57. Zeer sterke inductie werd waargenomen in alle drie de gevallen na de incubatietijd, wat suggereert dat de exogene NAA-toepassing succesvol was.

Als nieuw ontwikkelde promotors worden gebruikt moet men op dit punt ook uitvoeren verrijking analyse met qRT-PCR. Hiertoe wordt een bekend markergen (d.w.z. het gen dat door de gebruikte promotor wordt aangedreven) versterkt in de TRAP en wordt het totale RNA-monster- en expressieniveau genormaliseerd tot het totale RNA-niveau. Als de isolatie van TRAP RNA uit het specifieke weefsel succesvol was, moet een significante toename van de verandering van de vouw worden verkregen. Als alternatief kan gelijkwaardige informatie worden opgehaald uit de sequencinggegevens (zie figuur 5B). Expressie van twee suberin-gerelateerde genen, GPAT5 en HORST, is aanwezig in alle endodermis monsters en met name afwezig in de XPP weefsels. Integendeel, pericycle-uitgedrukte genen (PHO1 en SKOR) zijn slechts zeer laag uitgedrukt in de endodermis en verrijkt in de XPP sondes met een auxin-geïnduceerde down-regulatie over het onderzochte tijdsbestek.

Figure 2
Figuur 2: Celtype-specifieke expressie van GFP-RPL18 in de Arabidopsis wortel. A-B. Confocale microscopiebeelden van pELTP::GFP-RPL18 (A) en pXPP::GFP-RPL18 (B) die wortels uitdrukken na zes dagen na kieming. Celwandcontouren werden verkregen door vlekken met propidiumjodide (magenta). De doorsnedes A1 en B1 zijn afkomstig van de posities die zijn aangeduid met stippellijnen in respectievelijk A2 en B2. De laatste beelden tonen maximale projecties (MAX) van de opgenomen z-stacks. C. Schematische weergave van de weefseltypen die de Arabidopsiswortel vormen in longitudinale (C1) en dwarsdoorsnede (C3) en in een zijwortelprimordium (C2). Het beeld werd gewijzigd met toestemming van F. Bouché. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: TRAP/polysome RNA kwaliteitsbeoordeling. A. Tapestation - Representatieve resultaten van 14 gemeten monsters in gel beeld vertegenwoordiging met hun respectieve RINe waarden (linksboven). De weergave van electropherogram wordt weergegeven voor monster A1 (blauw gemarkeerd). De tabel rechts informeert over de monsterconcentraties. B. De gelijkaardige sporen zoals in A worden verkregen met Bioanalyzer. De panelen aan de rechterkant tonen monsters met toenemende degradatieniveaus, die in hun dalende RIN-waarden weerkaatsen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Bibliotheekprofielen van TRAP/polysome samples. A. Twee representatieve TRAP-samples (links) komen zeer goed overeen met de sporen voor succesvolle bibliotheken die worden aanbevolen door de Nextera XT-gebruikershandleiding. B. Verschillende reactievolumes leveren robuuste resultaten voor de voorbereiding van de bibliotheek op. C. Bibliotheken met suboptimale uitkomsten: zeer korte fragmenten (linksboven), extreem lange fragmenten (linksonder), lage concentratie (rechtsboven) of volledige fail (rechtsonder). Let ook op resterende korte fragmenten (blauwe ellips), die moeten worden verwijderd voordat sequencing. Bioanalyzer: rode sporen, LabChip: blauwe sporen. D. Geselecteerde kwaliteitsmaatregelen voor gesequencede TRAP-monsters (endodermis van onze laterale wortelvrije mutant) op verschillende tijdspunten en verdeling van spearman-correlatiecoëfficiënten berekend tussen pairwise vergelijkingen van alle monsters binnen een tijdspunt (n=65). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: qRT-PCR en RNA-seq tonen respectievelijk auxine-responsiviteit en weefseltypeverrijking. A. Expressieniveaus van drie bekende auxine-responsieve genen werden beoordeeld na 2 uur auxinebehandeling via qRT-PCR. Sterke inductie werd waargenomen in alle monsters. RT-PCR werd uitgevoerd op 3 onafhankelijke biologische replicaties en genormaliseerd naar de niet-behandelde monsters met UBC21 als intern referentiegen. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: GATA-motif binding transcription factor 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B. Expressieniveaus van vier markergenen uit de TRAP-seq-gegevensset. Monsters aan de linkerkant zijn endodermis-afgeleide (groene tinten), terwijl monsters aan de rechterkant zijn XPP-afgeleide (blauwe tinten). Getallen vertegenwoordigen de auxine incubatieintervallen in uren. Negatieve z-scores weerspiegelen lage expressieniveaus en vice versa. Endodermale marker genen (GPAT5, HORST) worden differentieel uitgedrukt met hoge niveaus in endodermis monsters. Integendeel, pericycle markers (PHO1, SKOR) hebben een hoog expressieniveau in XPP-cellen en tonen down-regulatie bij auxinebehandeling. GPAT5: glycerol-3-fosfaat 2-O-acyltransferas (suberin biosynthsis), HORST: hydroxylase van wortelsuberized weefsel, PHO1: fosfaat 1, SKOR: stelar K+ outward rectifier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Niet-constitutieve pUBQ10:GFP-RPL18 lokalisatiepatronen. Confocale microscopie van zes dagen oude zaailingen. Celwandcontouren werden verkregen door vlekken met propidiumjodide (magenta). Dwarsdoorsnedes A2 en C1 zijn van de posities aangeduid met stippellijnen in respectievelijk A3 en C2. Afbeeldingen met de vermelding MAX tonen maximale projecties van de opgenomen z-stacks. A1-A3. Uniforme lokalisatiepatronen van de UBQ10-gedrevenconstructie. B1-C2. Opmerkelijke afname van de signaalsterkte in buitenste weefsellagen. A, B en C worden geregistreerd in drie verschillende planten. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Verificatie van rpl18-lokalisatiepatroon
Cruciaal om verkeerde interpretatie van gegevens uit een TRAP-experiment te voorkomen, is het juiste expressiepatroon van de gelabelde ribosomale subeenheid. Daarom maakt de integratie van GFP als epitoop tag aan RPL18 zeer elegant verificatie van het gewenste expressiepatroon en achtereenvolgens, pulldown van de polysome fractie uit hetzelfde weefsel. Meer invasieve benaderingen om de juiste promotorpatronen te verzekeren worden gevolgd door Jiao en Mayerowitz 2010, wat GUS-vlekken vereist en in Tian et al. 2019 dat is gebaseerd op immunostaining met anti-FLAG antilichamen58,59.

We raden ten zeerste aan om het lokalisatiepatroon in elke generatie te controleren, omdat T-DNA transgene lijnen gevoelig kunnen zijn voor het uitschakelen en dus de signaalsterkte kan verslechteren of het aandeel van het uitdrukken van zaden afneemt. Met de GFP-tag in de constructie worden deze frequente controles eenvoudig uitgevoerd via microscopie.

Echter, zelfs een grondige confocale analyse kan in sommige gevallen leiden tot valse conclusies. We willen dit benadrukken met onze mislukte poging om een controle TRAP lijn te produceren. Tot nu toe is de plant science community niet in staat geweest om een plantenlijn te creëren met een uniforme RPL18 verdeling over alle cellagen. Zelfs de aanvankelijk te werk gestelde 35S promotor werd toegeschreven aan alleen tonen "bijna constitutieve" distributie met een niet-uniforme lokalisatie patroon10. Onze aanpak was om de promotor van UBIQUITIN10 (UBQ10)te gebruiken om de GFP-RPL18 construct te besturen. Screening in de T1 generatie bood zeer veelbelovende lokalisatie en werd dus gekozen om te worden gepropageerd (Figuur 6A). Gegevens van een testsequencingrun toonden echter geen verrijking in vergelijkingen tussen ELTP- en UBQ10-gestuurdelijnen voor bekende endodermisspecifieke genen. Bij nadere inspectie van deze planten, inderdaad vonden we een afname van het signaal in de buitenste weefsellagen, terwijl stele weefsel toonde sterke expressie (Figuur 6B). Toekomstige studies moeten het promotorlandschap doorzoeken naar meer geschikte kandidaten en de TRAP-methode aanvullen.

Totaal RNA als controlemonster
De totstandbrenging van een betere TRAP-controlelijn is nog in behandeling en zal zeer worden verwacht door het veld. Met dit in gedachten, tot nu toe de enige manier om een weefsel-brede uniforme verdeling van mRNAs te verkrijgen is het verzamelen van totale RNA. Aangezien in dit geval een transcriptoom wordt bemonsterd, moet dit worden verantwoord in de verdere bioinformatica-analyse. Met name, zowel het totale RNA en polysome RNA fracties zijn nu gecorreleerd als ze afkomstig zijn van hetzelfde weefsel monster.

Op zoek naar een TRAP-bibliotheekvoorbereidingsmethode
Zoals eerder vermeld, een groot nadeel van de TRAP aanpak zijn de wisselende en meestal lage opbrengsten die kunnen worden bereikt. Met monsters variërend van weinig ng tot soms tot 100 ng een standaard aanpak met de Illumina TruSeq kit (100 ng input eis) werd beoordeeld als te ongevoelig voor de bouw van bibliotheken van voldoende kwaliteit. Een marktonderzoek openbaarde verscheidene commercieel beschikbare uitrustingen van de bibliotheekvoorbereiding, die werden gespecificeerd om met zo laag zoals 5-10 ng beginmateriaal te werken. We hebben het protocol van Reynoso et al. 2019, dat werkt voor hun TRAP-monsters van tomaat, rijst en Medicago, niet getest en gebruik maakt van de BrAD-seq-aanpak60.

Al onze proeven, echter, met latere test sequencing leverde onbevredigende resultaten. Ondanks het gebruik van polyA-verrijkingstappen, leden de TRAP-monsters aan hoge ribosomale verontreinigingen (tot 30% van de reads). Bovendien was het slagingspercentage voor de voorbereiding van de bibliotheek variabel en vooral laag voor monsters met kritisch lage concentraties of relatief lagere RIN-waarden. Onze uitgebreide tests leiden ons tot de conclusie, dat de specifieke RNA samenstelling van een TRAP monster, met een zeer hoog rRNA-gehalte en vermoedelijk minieme mRNA concentraties, vereist een meer gevoelige aanpak om betrouwbare bibliotheken te verkrijgen. Zo hebben we ons gewend aan state-of-the-art oplossingen voor ultra-lage input bedragen: SMARTer v4 en Nextera XT. Geruststellend, Song et al. vond ook deze bibliotheek voorbereiding aanpak om beter te presteren dan hun concurrenten toen ze verschillende methoden en hun sequencing output getest op TRAPed leverweefsel61. De kwaliteitsstatistieken die we in figuur 4D hebben gepresenteerd, vertonen hoogwaardige reads (Q>30) bij lage rRNA-mapping rates (<3%) gelijktijdig met hoge genmappingpercentages. Bovendien tonen consequent hoge Spearman correlatiecoëfficiënten aan dat repliceert inderdaad zeer vergelijkbare expressieprofielen hebben. Het gebruik van beide kits was eenvoudig met bescheiden cyclusnummers en leverde robuuste en betrouwbare resultaten op. Sequencing gegevens waren van hoge kwaliteit met 1,5 ng uitgangsmateriaal. Met de SMARTer kit gedogen zo laag als 200 pg input, kan de hoeveelheid plant uitgangsmateriaal worden geoptimaliseerd. De toepasbaarheid voor zeldzamere celtypen zal uiteindelijk worden bepaald door de haalbaarheid om voldoende RNA op te bouwen.

TRAP vult de plant science toolkit aan
De TRAP-methode is steeds populairder geworden bij plantenwetenschappers34 en we zijn ervan overtuigd dat het om verschillende redenen de status van standaardtechniek zal verwerven.

Geen van de stappen in het TRAP-protocol heeft gespecialiseerde apparatuur nodig, zoals een celsorteermachine of een speciale lasercapturemicroscoop, waardoor veel laboratoria de experimenten kunnen uitvoeren. Tot op heden zijn de meest kostbare factoren de voorbereiding van de bibliotheek en downstream sequencing. Niettemin, met de dynamische vooruitgang van de volgende generatie sequencing technieken en toenemende vraag naar single-cell sequencing, verwachten we dat de kosten aanzienlijk zullen dalen.

Bovendien betekent de isolatie van polysome-geassocieerde RNA's dat informatie wordt verzameld over de actieve vertaalstatus van die RNAs (translationome). Daarom vangt TRAP de output van alle regelgevende stappen die stroomopwaarts van de vertaling zijn en vertegenwoordigt een meer directe proxy voor de cellulaire eiwitsamenstelling. Natuurlijk blijven vastgelopen ribosomen en posttranslationele modificaties nog steeds ongrijpbaar en moeten ze worden aangepakt door andere benaderingen (bijvoorbeeld proteomics).

Zoals eerder vermeld, een duidelijk voordeel dat TRAP heeft in een plant context is het behoud van CW structuren en mechanische eigenschappen van de cellen. Als we pas beginnen te begrijpen van de ingewikkelde verbindingen en regelgevende functies die ontstaan door CW- en mechanische signalering31,62, benaderingen die deze structuren te behouden zal belangrijker worden in veel verschillende ontwikkelingscontexten.

Vooral voor gevestigde modelsoorten kan TRAP profiteren van een schat aan verschillende promotors, die zijn gekenmerkt. In Arabidopsiswas het dus mogelijk om de gehele wortel op een celtype-specifieke manier in kaart te brengen met behulp van 19 verschillende marker genpromotoren30,63. Met elk RNA-seq-experiment worden deze selecties verbeterd en zullen nieuwe, meer specifieke promotors ontstaan en de cellulaire resolutie verfijnen.

TRAP is bovendien toepasbaar in een combinatorisch gebruik met veel promotors voor celpopulaties waar nog geen markers bekend zijn. Dit is het geval voor gespecialiseerde cellen in de wortel endodermis. De zogenaamde passagecellen worden gekenmerkt door de absense van de suberinlaag die volwassen endodermiscellen53bedekt. Het combineren van geschikte promotors en de daaropvolgende silico aftrekking van de verschillende expressieprofielen zal verrijken voor regio's die doorgangscellen herbergen. Transcriptie reporter analyse zal dan helpen bij het identificeren van passage cel marker genen. Echter, of TRAP kan worden gebruikt om vervolgens te analyseren van de zeldzame celpopulatie op deze basis moet nog worden bepaald.

In dit artikel hebben we een gedetailleerde beschrijving gegeven van de vertaal-ribosoomaffiniteitszuiveringsmethode, de voordelen en beperkingen ervan, en mogelijke toepassingen daarvan uitgelicht. In de portefeuille van "omics" studies, het neemt een belangrijke niche en zal helpen om veel biologische vragen te beantwoorden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen Jean-Claude Walser van het Genetic Diversity Center Zürich bedanken voor cruciaal deskundig advies in de beginfase van dit project. Het werk in het Vermeer-lab werd ondersteund door een SNF Professorship grant (PP00P3_157524) en een R'EQUIP equipment grant (316030_164086) van de Swiss National Science Foundation (SNSF) toegekend aan JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

Tags

Ontwikkelingsbiologie nummer 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq translationoom profilering celtype-specifieke RNA-seq laterale wortelvorming endodermis differentiatie
Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om <em>Arabidopsis thaliana</em> Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thellmann, M., Andersen, T. G.,… More

Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter