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Developmental Biology

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Abstract

Dans cet article, nous donnons des instructions pratiques pour obtenir des données de traduction de différents types de cellules racinaires Arabidopsis thaliana par l’intermédiaire de la méthode de purification de l’affinité ribosome de traduction (TRAP) et de la préparation continue optimisée de bibliothèque à faible entrée.

En tant que matériau de départ, nous employons des lignées végétales qui expriment la protéine ribosomalE IFFOmalE RPL18 marquée par GFP d’une manière spécifique au type cellulaire par l’utilisation de promoteurs adéquats. Avant l’immunopurification et l’extraction d’ARN, le tissu est gelé, qui préserve l’intégrité des tissus et permet simultanément l’exécution d’études de série temporelle avec une résolution temporelle élevée. Notamment, les structures de mur cellulaire restent intactes, ce qui est un inconvénient majeur dans les procédures alternatives telles que les approches à base de tri cellulaire activée par fluorescence qui reposent sur le protoplasting tissulaire pour isoler les populations cellulaires distinctes. En outre, aucune fixation tissulaire n’est nécessaire comme dans les techniques basées sur la microdissection de capture laser, ce qui permet d’obtenir de l’ARN de haute qualité.

Cependant, l’échantillonnage des sous-populations de cellules et l’arn polysome-associé qui isolent limitent sévèrement les rendements d’ARN. Il est donc nécessaire d’appliquer des méthodes de préparation de bibliothèque suffisamment sensibles pour l’acquisition réussie de données par RNA-seq.

TRAP offre un outil idéal pour la recherche sur les plantes, car de nombreux processus de développement impliquent des voies de signalisation liées aux parois cellulaires et mécaniques. L’utilisation de promoteurs pour cibler des populations cellulaires spécifiques fait le pont entre le niveau d’organe et le niveau unicellulaire qui, à son tour, souffre de peu de résolution ou de coûts très élevés. Ici, nous appliquons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale de racine.

Introduction

Poussé par l’application croissante des techniques de séquençage de nouvelle génération, la résolution spatiale en biologie du développement pourrait être augmentée. Les études contemporaines visent à disséquer les tissus vers le bas pour les types de cellules spécialisées, si ce n’est le niveau unicellulaire1,2,3,4. À cette fin, une pléthore de différentes méthodes a été conçue au cours des cinquante dernières années (voir figure 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

De nombreux outils en science végétale ont été des adaptations de techniques qui ont été pionnières dans la recherche animale. Ce n’est pas le cas pour la méthode que nous introduisons en détail ici. En 2005, doté d’un solide fond de traduction de protéines, le Laboratoire Bailey-Serres a entrepris de concevoir des protéines ribosomales pour la purification ultérieure de l’affinité16. Ainsi, ils pourraient éviter le profilage polysome long et laborieux, qui est basé sur l’ultracentrifugation avec un gradient de saccharose et a été employé pour évaluer la traduction des ribosomes depuis les années 196017,18. La méthode a depuis été appelée purification d’affinité ribosome translationnelle (TRAP)16. Après des études réussies de traduction dans les plantes, Heiman et autres ont adapté TRAP pour les animaux19 et d’autres ont étendu son application à la levure20, Drosophila21, Xenopus22 et le poisson zèbre23,24.

Bien que la modification génétique du système modèle soit une condition préalable pour TRAP, qui limite son application aux espèces qui se prêtent à la transformation génétique, on peut simultanément exploiter cette objection pour cibler des sous-ensembles de cellules qui sont d’intérêt particulier et autrement extrêmement difficiles à isoler du tissu intact/organe25 (p. ex., les cellules dendritiques fortement ramifiées dans un cerveau de souris ou hyphes fongiques dans le tissu végétal infecté). Dans les plantes, toutes les cellules sont maintenues en place par des parois cellulaires qui forment la base du squelette hydrostatique26. Pour libérer une cellule végétale de cette matrice, les scientifiques ont soit physiquement coupé la cellule de son tissu environnant par microdissection de capture laser (LCM)27 ou effectué la digestion enzymatique des parois cellulaires28. Parmi ces dernières cellules, ce que l’on appelle les protoplastes, la population d’intérêt est étiquetée fluorescentement et peut être séparée par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)7. LCM nécessite généralement un échantillon à fixer et intégré dans la cire, ce qui finit par détériorer la qualité de son ARN29. Les méthodes à base de FACS produisent de l’ARN de haute qualité, mais le processus de protoplasting lui-même introduit des différences dans l’expressiongénique 30 et les tissus avec des parois cellulaires secondaires modifiées et épaisses sont notoirement difficiles à traiter. En outre, de nombreux processus de développement dans les plantes sont supposés s’appuyer sur des signaux mécaniquement transmis et donc l’intégrité de la paroi cellulaire est d’une importance primordiale31. Deux méthodes, qui utilisent un raccourci pour contourner l’isolement cellulaire en opérant au niveau des nucléii, sont le tri nucléaire activé par la fluorescence (FANS) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT). Comme dans TRAP, ils utilisent des promoteurs spécifiques au type de cellule pour marquer les noyaux, qui se sont ensuite enrichis par tri ou tirer vers le bas, respectivement8,15. Un défi majeur pour toutes ces approches est d’obtenir suffisamment de matériel d’ARN à partir de sous-ensembles de cellules dans un tissu. Comme TRAP ne capture qu’une fraction des ARN cellulaires, la collecte d’échantillons est un goulot d’étranglement considérable. Par conséquent, des protocoles de préparation de bibliothèque particulièrement sensibles sont nécessaires pour produire des données de haute qualité à partir de faibles quantités d’entrée.

Depuis sa création, TRAP a été utilisé en combinaison avec des microrésions d’ADN ou, comme les coûts de séquençage ont chuté de manière significative ces dernières années, RNA-seq10,32,33. Une multitude de questions de recherche a déjà été élucidée tel qu’il a été examiné dans Sablok et coll.34. Nous sommes convaincus que d’autres rapports suivront dans les années à venir, car la technique est très polyvalente lorsqu’elle combine différents promoteurs pour cibler des types de cellules spécifiques. Finalement, cela se fera même d’une manière inductible, et peut être combiné avec sonder la réaction de la plante à de nombreux facteurs de stress biotiques et abiotiques. En outre, lorsque des lignées transgéniques stables ne sont pas disponibles, les systèmes d’expression des racines poilues ont également été utilisés avec succès pour effectuer TRAP dans la tomate et medicago35,36.

Figure 1
Figure 1 : La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) complète le portefeuille d’analyse « omics ». R. L’augmentation des niveaux de précision analytique, jusqu’à la résolution unicellulaire ou même subcellulaire peut être obtenue par une pléthore de méthodes ou de combinaisons de celui-ci. Le programme donne un aperçu des outils actuellement disponibles dans le domaine des plantes et des animaux. La collecte de tissus à la résolution cellulaire peut être obtenue par des protocoles comme LCM ou FACS, qui sont ensuite couplés à un transcriptome standard ou à une analyse de profilage/traduction polysome. TRAP et INTACT intègrent à la fois la capture des tissus et l’isolement de l’ARN car ils sont basés sur l’épitope-marquage. Cependant, INTACT n’échantillonne que les noyaux cellulaires et constitue, par conséquent, un cas particulier d’analyse de transcriptome. Une petite icône de lapin marque des méthodes nouvellement développées dans le domaine animal : Alors que SLAM-ITseq et Flura-seq s’appuient sur la ciblage métabolique des ARN naissants avec des bases d’uracil modifiées dans les cellules exprimant l’enzyme permissive, Slide-seq utilise une diapositive en verre enduit avec des codes-barres d’ADN qui fournissent des informations de position dans la gamme cellulaire. Une approche d’étiquetage de proximité est suivie dans APEX-seq pour échantillonner les ARN dans des compartiments subcellulaires spécifiques. Notamment, une résolution accrue nécessite souvent la production de matériaux transgéniques (astérisques) et ces méthodes sont donc principalement utilisées pour les espèces modèles. TRAP est particulièrement adapté pour les études scientifiques végétales impliquant la paroi cellulaire (CW) ou la signalisation mécanique ainsi que les espèces cellulaires qui sont difficiles à libérer de leur matrice CW. B. Les étapes détaillées de la procédure TRAP : Les semis exprimant des protéines ribosomal étiquetées GFP dans des types cellulaires distincts (p. ex. endodermis de racine) sont cultivés sur des plats Petri pendant sept jours et des racines récoltées par congélation rapide. Un échantillon total de contrôle de l’ARN est prélevé sur l’extrait brut homogénéisé avant de pelleter les débris par centrifugation. Des perles magnétiques anti-GFP sont ajoutées à l’extrait effacé pour effectuer l’immunoprécipitation. Après l’incubation et trois étapes de lavage, l’ARN polysome-associé (TRAP/ARN polysome) est directement obtenu par extraction de phénol-chloroforme. LCM : microdissection de capture laser, FACS/FANS : tri cellulaire/nucléaire activé par fluorescence, APEX-seq: méthode basée sur l’ascorbate peroxidase, INTACT: isolation des noyaux étiquetés dans des types cellulaires spécifiques, SLAM-ITseq: thiol (SH) alkylation liée à la séquence métabolique de l’ARN dans les tissus, Flura-seq: fluorouracil-étiqueté RNA séquençage (Créé avec Biorender.com) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la méthode TRAP, de mettre en évidence les étapes critiques et de fournir des conseils pour une méthode de préparation possible de la bibliothèque.

Une expérience TRAP générique consistera essentiellement en les étapes suivantes (voir aussi la figure 1B) : (1) Préparation du matériel végétal, y compris le clonage de la construction de ribosome-marquage, la production et la sélection transgéniques de lignées, la culture et l’encombrement des graines, la stérilisation et le placage, et l’application/traitement du stress (facultatif) et la récolte des tissus; (2) l’immunopurification, y compris l’homogénéisation des tissus et le dégagement de l’extrait brut, le lavage et l’immunopurification des perles, et les étapes de lavage; (3) Évaluation de la qualité de l’ARN; et (4) la préparation de la bibliothèque.

La racine Arabidopsis a été un système modèle pour étudier le développement des plantes depuis son introduction comme une plante modèle37,38. Ici, l’application de TRAP est présentée dans le contexte du développement latéral des racines végétales. Dans les plantes, l’accumulation de l’ensemble du système racinaire repose sur l’exécution de ce programme et est donc très importante pour la survie de l’organisme39. Dans Arabidopsis, les racines latérales proviennent de tissu péricycle qui réside à côté des vaisseaux xylèmes et est donc appelé pericycle pôle xylème (XPP; voir figure 2C)40. Certaines cellules XPP, qui sont situées profondément à l’intérieur de la racine, acquièrent une identité cellulaire fondatrice et, sur un déclencheur hormonal local, commencent à proliférer en gonfleant et en divisant anticlinally41. Cependant, en raison de la présence d’une matrice rigide de mur cellulaire, ce processus exerce le stress mécanique sur les tissus environnants. En particulier, l’endoderme overlying est affecté, car il est dans la voie de l’axe de croissance latérale des racines42,43,44. En effet, le primordium nouvellement formé devra se développer à travers la cellule endodermis overlying (figure 2C2) tandis que les cellules cortex et épiderme sont juste repoussées pour que le primordium émerge enfin45,46. Des travaux récents dans notre laboratoire ont montré que l’endoderme contribue activement à la prolifération du péricycle. Le blocage ciblé de la signalisation hormonale endodermique est suffisant pour inhiber même la toute première division dans les cellules XPP47. Par conséquent, la communication péricycle-endodermis constitue un point de contrôle très précoce pour le développement latéral des racines dans Arabidopsis. On ne sait cependant pas comment cette traque est effectuée. Pour percer ce mystère, nous avons choisi l’approche TRAP-seq pour cibler XPP et les cellules endodermiques. Pour enrichir pour les cellules dans le programme de racine latérale, nous avons imité le déclencheur hormonal en appliquant exogènement un analogue auxin (acide à laphthalèneacécéétique, NAA)48, qui en même temps a permis de résoudre temporellement la phase initiale de la formation latérale de racine.

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Protocol

1. Clonage de la production et de la sélection transgéniques transgéniques

  1. Clonez le promoteur de choix dans le vecteur d’entrée approprié. Utilisez une méthode de clonage à base de recombinaison(Tableau des matériaux) et recombiner les promoteurs dans pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (avec étiquette d’affinité ou protéine fluorescente de choix) en utilisant le clonage à base de recombinaison dans pDONRP1-P249.
  2. Combinez le vecteur d’entrée contenant RPL18 avec le vecteur d’entrée contenant le promoteur dans une réaction de recombinaison de deux fragments dans le vecteur de destination approprié avec la cassette de sélection rouge EXPRES50 pour faciliter la sélection directe des graines transgéniques.
  3. Vérifiez le vecteur recombiné par le séquençage et transformez-le en agrobactéries appropriées et compétentes. Trempette de fleurs Plantes Arabidopsis et après 3-4 semaines de récolte et de sélectionner les graines de T151.
  4. Utilisez la microscopie pour identifier les lignes bien exprimantes et vérifier les modèles d’expression en fonction de l’activité du promoteur signalé dans plusieurs lignes indépendantes. Sélectionnez des lignes montrant un modèle d’expression représentatif avec une seule insertion D’ADN T. Cela pourrait aider à minimiser le silence et sera avantageux pour les croix génétiques.
  5. Sélectionnez la progéniture T3 qui est homozygous pour le gène marqueur.

2. Propagation et stérilisation

  1. Cell type-spécifique TRAP isole l’ARN d’un nombre limité de cellules cibles par racine. Pour générer le matériau de départ nécessaire, propager des lignes homozygotes. À cette fin, utilisez des conditions de croissance standard en mettant l’accent sur le contrôle de la croissance fongique.
    REMARQUE : Si des lignes d’insertion simples ne peuvent pas être obtenues, cultivez des lots dans de grandes populations sur quelques générations pour éviter le silence transgénérationnel induit par le T-ADN.
  2. Stériliser de grandes quantités de graines d’Arabidopsis avec une série de gaz de chlore et un tour de 70% EtOH.
    1. Étendre les graines uniformément sur des plats Petri de 12 cm x 12 cm carrés (moins de 0,3 ml de graines/assiette) et les empiler dans un desiccateur ou un autre récipient approprié. Évitez la formation d’amas ou de tas car les graines doivent être accessibles au gaz. Effectuer la stérilisation du gaz pendant la nuit avec des volumes d’eau de Javel et de HCl comme indiqué52: 100 ml d’eau de Javel (13%) avec 6 mL de conc. HCl dans un desiccator de 60 L. Defumigate pendant au moins 1 h avant de recueillir les graines dans un récipient stérile.
      CAUTION: 37% HCl est très corrosif et nécessite une manipulation soigneuse. Le gaz de chlore est toxique, utilisez une hotte à fumée.
    2. Prenez 0,1 mL de graines sèches stérilisées au gaz par assiette et mélangez-les avec une solution de stérilisation (70 % EtOH, 0,01 % tween) à température ambiante. Incuber pendant 20 min, décantEr EtOH et laver les graines 3-4 fois avec stérile H2O.
    3. Transférer les graines trempées dans des tubes de 50 ml et diluer avec une mélo stérile de 0,1 % pour obtenir 1 ml de boue de graines imbibées par plaque (0,1 mL graine/1 mL de boue).
      REMARQUE : En raison d’événements d’intégration transgène, les lignées végétales peuvent être sensibles à différentes techniques de stérilisation; en particulier le temps d’incubation EtOH s’est avéré critique. Dans nos mains, les étapes de stérilisation double ont été nécessaires pour éviter la contamination fongique pendant les expériences. Ceci est particulièrement important lors de l’exécution des séries chronolocuteurs que la contamination d’un point de temps unique entrave l’expérience entière. Il se pourrait bien que la double stérilisation ne soit pas toujours nécessaire, selon les conditions de croissance locales.

3. Plating

  1. Préparer ces étapes à l’avance. Verser 1/2 plaques de MS (pH 5,8) avec 1% d’agar dans les quantités nécessaires à l’expérience (20-30 par échantillon/point de temps). Couper 1 mL de pointes de pipette pour agrandir le diamètre de la pointe à environ 3-4 mm avec une lame de rasoir. Autoclave les conseils. Créez un porte-modèle pour placage de trois rangées de graines par assiette avec des couvercles carrés de plats Petri. Préparer un capot à débit lamineur pour fournir un environnement de travail stérile et étiqueter les plaques à traiter.
    REMARQUE : Si de nombreuses plaques sont traitées en même temps, les étiquettes colorées peuvent accélérer l’étiquetage.
  2. Placez les plaques d’agar vides dans le support du modèle et distribuez 1 ml de graines imbibées uniformément sur trois rangées. Placer les plaques traitées dans des piles dans le flux laminaire jusqu’à ce que les graines soient sèches (c.-à-d., coller à la surface de l’agar). Ne laissez pas les plaques plus longtemps car l’agar se dessèchera aussi.
  3. Une fois que les graines sont suffisamment sèches, fermez les couvercles et scellez chaque assiette avec du ruban adhésif micropore. Stratifier les graines pendant deux jours à 4 oC dans l’obscurité et ensuite les placer dans une chambre de croissance.

4. Traitement tissulaire (facultatif)

REMARQUE : Dans ce protocole, nous décrivons le traitement exogène des racines d’Arabidopsis avec la variante synthétique d’auxin NAA. Selon la question expérimentale à portée de main, cette pièce doit être ajustée ou peut être omise entièrement.

  1. Préparer des bandes de papier de soie de 1,5 à 2 cm de hauteur et de 10 cm de longueur. Les temps d’incubation prolongés exigent que le tissu soit autoclavé avant l’utilisation.
  2. Retirez le ruban micropore de toutes les plaques qui doivent subir le traitement hormonal. Diluer 1 mL de 10 mM NAA (dissous dans DMSO) dans 1 L de solution liquide, autoclaved 1/2 MS (pH 5.8) et tremper le papier tissulaire dans la solution (10 M NAA).
  3. Utilisez des pincettes pour appliquer une bande de papier de soie sur chaque rangée de racines. Utilisez délicatement les doigts pour enlever les bulles d’air. Videz l’excès de liquide de la plaque, fermez le couvercle et étiquetez la plaque avec le temps. Pour des temps d’incubation prolongés, remettez les plaques dans la chambre de croissance.

5. Récolte

  1. Récupérez les plaques pour chaque point/traitement biologique de réplique/temps. Recueillir de l’azote liquide dans un récipient de Dewar propre et des tubes d’étiquette (15 ou 50 ml) pour les différents échantillons de tissus. Préparer un support en polystyrène.
    CAUTION : Familiarisez-vous avec les procédures de manipulation de l’azote liquide (aération, engelures, tubes potentiellement explosifs).
  2. Ouvrez la plaque et retirez le papier de soie avec des forceps, en prenant soin de ne pas détacher les racines de la surface de l’agar. À l’aide d’une lame chirurgicale, coupez une fois par rangée le long de la jonction de pousse-racine dans un seul coup déterminé. Nettoyez les lames entre les échantillons et échangez fréquemment pour garantir la netteté.
  3. À l’égard des pincettes, faites glisser le long des racines de chaque rangée pour les recueillir en trois paquets. Saisissez les racines et videz-les dans un tube de 50 ml rempli d’azote liquide pour geler.
    REMARQUE : N’essayez pas d’assembler les racines en structures denses (comme les boules) car elles sont difficiles à moudre à l’étape suivante.
  4. Procédez avec toutes les plaques qui constituent un échantillon (dans l’ordre des temps d’incubation) et versez l’excès d’azote liquide. Utilisez le couvercle du tube pour empêcher les racines de se renverser. Fermez ensuite le couvercle et collectez tous les tubes du vaisseau Dewar. Conservez le tissu racinaire à -80 oC.

6. Immunopurification

REMARQUE : Cette étape vise à obtenir un TRAP/ARN polysome de haute qualité. Par conséquent, suivez strictement les conseils de bonnes pratiques pour la manipulation de l’ARN. Effectuez toutes les étapes de cette section dans un banc stérile et nettoyez tout l’équipement et le labware avec une solution de suppression de RNase(Tableau des matériaux). Portez-les des gants et modifiez-les immédiatement lorsqu’ils sont contaminés par de l’échantillon, de la glace ou d’autres sources qui n’ont pas été nettoyées. Étant donné qu’il s’agit d’un aspect crucial, une section sur la réutilisation de l’équipement ainsi que des conseils d’élimination des déchets sont incluses.

  1. Préparation de tampon
    1. Préparer des solutions de stock en fonction du tableau 1 et de l’autoclave (A) ou de la stérilisation du filtre( ). Sauf indication contraire, le solvant est de l’eau sans RNase.
    2. Dissoudre et aliquot dithiothreitol (TNT), fluorure phénylméthylsulfonyl (PMSF), cycloheximide (CHX) et chloramphéniicol (CAM) dans leurs solvants respectifs comme indiqué dans le tableau 1 et les stocker à -20 oC. Tous les autres stocks peuvent rester à température ambiante.
    3. Pré-mélanger les stocks - avec les ingrédients 1-4 pour le tampon de lavage (WB) et 1-6 pour le tampon d’extraction polysome (PEB) - pour éviter le mélange de tampon long avant chaque extraction. Ainsi, n’ajoutez que l’eau et les ingrédients congelés (7-10) le jour de l’extraction. Maintenir les stocks pré-mixtes et l’eau sans RNase à 4 oC.
      REMARQUE : La concentration de TNT est de 1/5 de la concentration rapportée de Zanetti et coll. 2005, car l’interaction nanobody avec le GFP est sensible aux concentrations élevées de TNT.
Ingrédients Concentration de stock Ajouter le volume en mL pour 50 ml de BM Ajouter le volume en mL pour 50 ml de PEB
1 Tris, pH 9 Un 2 M 5 5
2 Kcl Un 2 M 5 5
3 EGTA (EN anglais) Un 0,5 M 2.5 2.5
4 MgCl2 Un 1 M 1.75 1.75
5 Pte Un 20% (v/v) 0 2.5
6 mélange de détergent Un 0 2.5
Tween 20 20% (v/v)
Triton-X 100 20% (v/v)
Brij-35 20% (w/v)
Igepal (Igepal) 20% (v/v)
7 Tnt ₳ 0,5 M 0.1 0.1
8 FSM ₳ 0,1 M (isopropanol) 0.5 0.5
9 Cycloheximide ₳ 25 mg/mL (EtOH) 0.1 0.1
10 Chloramphénicol ₳ 50 mg/mL (EtOH) 0.05 0.05

Tableau 1 : Conseils de composition et de mélange tampons. Les ingrédients dont les concentrations de stock données sont mélangées dans les montants donnés donnent 50 ml de BM ou de PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, EGTA: éthylène glycol-bis (-aminoethyl ether)-N,N,N',N',N',N',N'-tetra-acétic acid, PTE: Polyoxyethylene-(10)-tridecyl ether, A: autoclave, ': filtre-sterilize; Remplissez jusqu’à 50 ml d’eau sans RNase.

  1. Homogénéisation/broyage tissulaire
    1. Refroidir la centrifugeuse et placer les homogénéisateurs et les tubes de centrifugeuse sur la glace. Dégel des aliquots de la TNT, du FSM, du CHX et de la CAM. Mélanger PEB et WB à partir des solutions de stock dans des tubes de 50 ml selon les exigences de la journée (d’échantillons) et refroidir sur la glace.
      REMARQUE : Ajouter pmSF seulement peu de temps avant utilisation, car la demi-vie du PMSF dans l’eau n’est que de 30 min.
    2. Préparer beaucoup d’azote liquide dans un vaisseau Dewar et récupérer des échantillons de tissus dans un stockage de -80 oC. Portez des gants de coton sous les gants de laboratoire standard pour éviter les brûlures causées par les mortiers froids. Verser l’azote liquide dans les mortiers et les pilons jusqu’à ce qu’ils soient assez froids pour permettre le broyage. Il est recommandé de concevoir un système pour distinguer les mortiers (étiqueter ou garder dans un certain ordre).
    3. Échantillon vide de tissu dans un mortier et moudre soigneusement jusqu’à ce que tout le matériel soit une poudre blanche. Si nécessaire, ajouter de l’azote liquide pour garder le tissu congelé ou pour faciliter un meilleur broyage.
    4. Ajouter 5 ml de PEB à l’échantillon et mélanger rapidement avec la poudre avant que le tampon ne gèle. Pendant que cet échantillon dégèle (mélange de temps en temps) traiter un autre échantillon.
    5. Dès que le mélange peut être transféré, videz la boue dans un homogénéisant en verre et gardez sur la glace. Avec 2 ml de PEB supplémentaires, rincez le mortier et pilon et ajoutez-le à l’échantillon dans l’homogénéisateur.
      REMARQUE : Évitez un échantillon complètement liquide car cela permet la dégradation de l’ARN.
    6. Broyer la boue manuellement jusqu’à ce que l’extrait soit homogène. Nous recommandons un minimum de 4 à 5 plongeons.
      REMARQUE : Il peut s’agit peut-être d’un temps d’attente supplémentaire pour permettre au dégel de la boue. Le traitement des homogénéisateurs exige une certaine diligence. N’appliquez pas la force brute et méfiez-vous des forces d’aspiration. Si elle n’est pas prise en compte, cela entraînera des déversements, une contamination ou la destruction de l’homogénéisateur.
    7. Verser l’extrait de racine brute dans un tube de centrifugeuse de 50 ml (garder sur la glace).
      REMARQUE : Habituellement, plusieurs échantillons peuvent être broyé avant le transfert. Une manipulation parallèle du broyage, du transfert et de l’homogénéisation est nécessaire. Essayez de travailler rapidement, mais ne vous précipitez pas; rester calme. Conservez toujours des échantillons homogénéisés sur la glace.
  2. Collecte totale d’échantillons d’ARN
    1. Transférer 200 aliquots de l’échantillon brut dans un tube de microcentrifuge propre (étiqueté et refroidi sur la glace à l’avance).
    2. Procédez à l’extraction de l’ARN comme détaillé pour les échantillons TRAP dans les points 7.1 et 7.2. Faites ces étapes pendant que les échantillons sont éclaircissants dans la centrifugeuse.
    3. Effectuer un traitement DNase avec l’ARN total réutilisé pour éliminer la contamination de l’ADN et nettoyer la réaction à l’aide d’un kit commercial (Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les extractions totales d’ARN produisent habituellement des concentrations élevées et les échantillons doivent être dilués considérablement. Nous recommandons de mesurer la concentration après dilution par le protocole sensible Qubit.
  3. Dégagement de l’extrait brut
    1. Prenez le seau à glace avec des échantillons de 6,2,7 et centrifugez-les pendant 15 min à 16 000 x g et 4 oC.
      REMARQUE : Pour équilibrer la centrifugeuse, associez les échantillons en conséquence. Dans le cas où cela n’est pas tout à fait possible, ajustez un échantillon en ajoutant PEB.
    2. Verser le supernatant dans un tube de centrifugeuse frais (refroidi sur la glace à l’avance) et répéter la centrifugation (15 min à 16 000 x g et 4 oC). Ce transfert peut être effectué rapidement à côté de la centrifugeuse.
    3. Pendant que l’extrait brut est clair, lancez le lavage des perles GFP pour l’étape 6.6.
      REMARQUE : Gardez ce seau à glace pour basculer sur le shaker, mais ne remettez pas dans le banc stérile car il pourrait être contaminé.
  4. Lavage de perles
    1. Les perles magnétiques de GFP d’Aliquot (#samples x 60 lil, tableau des matériaux) dans un tube de 1,5 mL. Placez-vous sur le support magnétique. Une fois que les perles se sont accumulées, retirez le supernatant.
    2. Ajouter 1 ml de BM froide, réutilisez les perles et récupérez-les à nouveau. Jetez le tampon de lavage et répétez une fois de plus avec 1 ml de BM.
    3. En fin de compte, réutilisez les perles dans la BANQUE de LaVe au volume initial utilisé à l’étape 6.5.1.
  5. Immunopurification (PI)
    1. Immédiatement après la centrifugation, verser le supernatant autorisé dans des tubes étiquetés de 15 ml et ajouter 60 l de perles lavées par échantillon.
    2. Placez tous les échantillons horizontalement dans le seau à glace et mettez-le sur un shaker. Laisser le mélange incuber pendant 2 h afin de lier les polysomes étiquetés GFP aux perles.
    3. Recueillir les perles sur le support magnétique pour 15 tubes mL (sur la glace) et ajouter PMSF au PEB restant. Jetez le supernatant. Verser environ 5 ml de PEB aux perles et les réutiliser en inclinant. Secouez les échantillons pendant 15 min dans la même configuration que dans la section 6.6.2.
    4. Répétez les lavages avec WB à un total de 3 lavages (1 x PEB, 2 x WB). Avant chaque échange de tampons, ajoutez PMSF.
    5. Recueillir les perles dans 1 ml de WB et les transférer dans un tube de 1,5 mL. Enfin, recueillir les perles une fois de plus sur le support magnétique et enlever tout le liquide. Fermez le tube et restez sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités.
    6. Transportez les échantillons vers une hotte à fumée pour l’extraction de l’ARN.
  6. Élimination des déchets et reconditionnement des fournitures de laboratoire.
    1. Si elle est effectuée selon de bonnes pratiques de laboratoire (voir l’article 2.2.1), la procédure de stérilisation donne une solution NaCl aqueuse. Laissez le gaz de chlore, ainsi que le HCl résiduel et l’eau de Javel, pour décommaner dans le capot de fumée.
    2. Élimination de PEB et de la BM : Comme CHX se décompose à un pH élevé, collectez tous les liquides et apportez à pH -gt;9. Éliminer les déchets liquides dans les déchets chimiques halogènes. Tous les solides (tissus, pipettes sérologiques, gants, etc.) doivent être éliminés comme déchets chimiques.
    3. Recueillir séparément les liquides contenant du phénol, ainsi que les matières contaminées au phénol (bouts, tubes et gants).
    4. Mortiers, pileaux et homogénéisateurs (éponges et brosses) avec du savon et rincez à fond. Par la suite, faites cuire le matériau à l’adresse suivante : 220 oC pendant la nuit. Envelopper dans du papier d’aluminium avant le traitement ou placer dans un contenant couvert résistant à la chaleur.
    5. Badigeonner les tubes de centrifugeuse propre avec du détergent, puis les déthylpyrocarbonate (DEPC) traiter dans le capot de fumée. À cette fin, ajouter du DEPC liquide à l’eau déionisée (1 ml de DEPC à 1 L de H2O) et mélanger par secousses. Placez les tubes de centrifugeuse sur un plateau autoclavable qui attrape l’eau DEPC renversée. Verser la suspension dans les tubes et laisser reposer pendant 3 h ou toute la nuit. DEPC se décompose dans le processus d’autoclaving subséquent.
      CAUTION: DEPC est très toxique.

7. Extraction d’ARN et QC

  1. Extraction d’ARN
    1. Refroidir la centrifugeuse de table à 4 oC.
    2. Ajouter 1 ml de réactif à base de phénol acide-guanidinium(tableau des matériaux)à chaque échantillon, inverser pour résinpender les perles ou la boue totale d’ARN et incuber pendant 5 min sur la glace. Ne vortex!
    3. Ajouter 200 L de chloroforme et incuber pendant 3 minutes sur la glace. Puis complètement vortex les échantillons.
    4. Pour faciliter la séparation de phase, centrifugeuse au maximum. vitesse pendant 10-15 min, 4 oC.
    5. Étiqueter les tubes à faible rétention de 1,5 mL(tableau des matériaux) et l’aliquot 650 'L d’isopropanol dans chacun.
    6. Prenez soigneusement la phase aqueuse supérieure (environ 650 ll) et transférez-les aux tubes préparés avec de l’isopropanol. Évitez de toucher la phase organique rose.
    7. Précipitez l’ARN pendant la nuit à -20 oC.
      REMARQUE : Il est recommandé de stocker les échantillons dans l’isopropanol à -20 oC ou -80 oC et de ne se solubiliser dans l’eau que si nécessaire. L’ARN aqueux se dégrade même à -80 oC lorsqu’il est stocké pendant des semaines/mois.
  2. Précipitations d’ARN
    1. Refroidir la centrifugeuse de table à 4 oC.
    2. Préparer un EtOH frais à 80 % avec de l’eau sans RNase et refroidir à -20 oC (5 min à -80 oC aider à accélérer le processus).
    3. Centrifugez les échantillons à vitesse maximale (environ 13 000 x g)pendant 30 min et jetez le supernatant. La pastille ne sera pas visible, si soigneusement pipette comme si elle était là. Ajouter 1 ml de froid 80% EtOH et inverser le tube une ou deux fois.
    4. Centrifugeuse à nouveau pendant 30 min à vitesse maximale et répéter le lavage à un total de deux lavages.
    5. Faire tourner pendant 2 min et retirer tous les EtOH résiduels avec une pointe de 10 L. Laisser sécher la pastille de 3 à 5 minutes (pas plus) à température ambiante et de la résuspendance dans 20 L d’eau sans RNase.
    6. Gardez les échantillons sur la glace et effectuez un contrôle de la qualité dès que possible. Procédez au stockage des échantillons à -80 oC. Évitez les cycles de gel-dégel.
  3. Contrôle de la qualité àl’aide d’équipements dédiés (Tableau des matériaux)selon les recommandations du fabricant.

8. Préparation de la bibliothèque

  1. Synthèse et amplification cDNA avec le kit d’ARN SMARTer v4 Ultra Low Input
    1. Calculer la dilution de chaque échantillon pour avoir 1,5 ng d’ARN TRAP ou d’ARN total dans un volume de 4,75 lL. Effectuer toutes les réactions dans les tubes PCR et diluer des échantillons avec des aliquots frais d’eau sans RNase.
    2. Effectuez toutes les étapes selon les recommandations du fabricant avec 1/2 les volumes de réaction. Amplifier l’ADN avec 12-13 cycles PCR.
    3. Nettoyez le PCR en ajoutant 0,5 L de tampon de lyse de 10x et 25 L de perles SPRI(Tableau des matériaux). Si de nombreux échantillons sont traités tampon de lyse et perles peuvent être pré-mélangés. Assurez-vous que les perles sont uniformément dispersées avant le tuyautage.
    4. Procédez au protocole en volume de réaction intégral (17 l de tampon d’elution). Ne laissez pas sécher les perles pendant plus de 3 minutes. Les échantillons surchargés peuvent potentiellement être sauvés par des temps d’incubation prolongés.
    5. Mesurer les concentrations d’échantillons avec la trousse d’ADN Qubit HS.
      REMARQUE : Le kit V4 SMARTer peut tolérer jusqu’à 200 pg entrée. Nous avons obtenu des bibliothèques dans les cas où les valeurs Qubit n’ont pas pu être déterminées (en dessous de 250 pg, limite de détection) avec un PCR de 16 cycles. Toutefois, le matériel d’entrée limité pourrait également donner lieu à des bibliothèques moins complexes.
  2. Fragmentation et adaptateur ligation PCR avec le Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. Diluer l’ADNC avec de l’eau sans RNase pour obtenir une concentration de 200 pg/l et pipette 1,25 l dans un tube PCR.
    2. Effectuez toutes les étapes selon le fabricant avec 1/4 les volumes de réaction. Amplifier l’ADNC avec 12 cycles PCR et des adaptateurs compatibles pour les échantillons qui appartiennent à une piscine de séquençage. Avec les kits Index d’Illumina, les kits A et D peuvent être multiplexés.
    3. Pour le nettoyage PCR ajouter 12,5 L de tampon de résuspension et 22,5 L de perles SPRI (rapport 0,9x). Elute l’échantillon avec 22 L de tampon d’elution.
      REMARQUE : QC et la mise en commun ont été effectuées par la société de séquençage(Tableau des matériaux) et donc aucune normalisation basée sur la perle n’était nécessaire. La réaction de fragmentation enzymatique (tagmentation) est très sensible à l’entrée matérielle car chaque enzyme ne coupe qu’une seule fois. Par conséquent, ne dépassez pas la recommandation de concentration.

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Representative Results

Pour l’évaluation de la qualité, la procédure susmentionné devrait être examinée à plusieurs étapes intermédiaires : validation du modèle d’expression dans planta, contrôle de la qualité de l’ARN polysomique isolé ainsi que des bibliothèques finales. qRT-PCR utilisant des gènes marqueurs connus peuvent, en outre, être exécutés pour confirmer la réponse à l’état de traitement ou pour affiner les conditions expérimentales.

Analyse confocale de la distribution de signaux GFP
Pour vérifier les modèles d’expression endodermiques et XPP, nous avons analysé des lignes homozygotes de pELTP::GFP-RPL18 et pXPP::GFP-RPL18 par microscopie confocale. Les figurines 2A et 2B montrent des plantes représentatives avec des signaux GFP (verts) qui ont été contrecarrés avec de l’iodure de propidium (magenta) pour décrire les parois cellulaires. La section transversale de la figure 2A1 montre un anneau concentrique dans la troisième couche cellulaire de l’extérieur, qui correspond à l’endodermis. Le signal endodermique du GFP s’initie peu de temps au-dessus de la zone meristematique(figure 2A2) et apparaît à la fois dans le cytosol et autour des noyaux des cellules, ce qui correspond aux ribosomes. En revanche, la ligne XPP présente deux pôles distincts, ce qui correspond au XPP(figure 2B1). Environ trois cellules à chaque pôle commencent au-dessus de la zone meristematic pour présenter un signal GFP. Ainsi, les deux lignes se conforment au modèle de localisation de l’endodermis et du XPP, respectivement(figure 2C)53.

Validation polysome ARN
Pour déterminer la qualité de l’ARN polysome obtenu, nous avons effectué des mesures de contrôle de la qualité, à l’aide de deux systèmes automatisés d’électrophorèse(Tableau des matériaux) qui fonctionnent avec des montants d’entrée et calculent également un numéro d’intégrité d’ARN (RIN)54. L’algorithme propriétaire attribue une valeur RIN comprise entre 1 et 10 à chaque électrophéogramme et est une mesure robuste et reproductible pour la qualité de l’ARN (c.-à-d., dégradation) - plus la valeur est dégradée, plus l’échantillon est dégradé. La figure 3 montre des exemples des mesures que nous avons obtenues à partir d’ARN polysome. La plupart des échantillons ne montrent guère de dégradation apparente avec des valeurs de RIN allant de 9-10, ce qui est conforme aux rapports précédents55,56. Toute mauvaise manipulation, en particulier les périodes de températures élevées prolongées (p. ex., température ambiante) ou de contamination par la RNase serait évidente à ce stade. Les deux instruments calculent également les concentrations d’échantillons à partir de leurs électrophépogrammes(figure 3A). Ceux-ci peuvent varier considérablement et sont la plupart du temps à la limite de détection inférieure. Nous conseillons donc d’utiliser des mesures fluorométriques pour quantifier avec précision les concentrations.

Bibliothèque QC
Comme la plupart des laboratoires n’effectuent pas le séquençage de l’ARN en interne, les contrôles de qualité sont souvent exécutés dans des installations spécialisées avec des dispositifs à haut débit(Tableau des matériaux). Évaluer régulièrement la qualité et quantifier les concentrations par qPCR et les essais fluorométriques(tableau des matériaux)car des mesures précises sont des conditions préalables à la mise en commun des bibliothèques. Néanmoins, si la préparation de la bibliothèque n’est pas externalisée, on peut échantillonner les résultats avecde l’équipement spécialisé (Tableau des matériaux). La figure 4 montre des traces de bibliothèques préparées avec succès avec notre protocole recommandé (A) et souligne la robustesse de la procédure malgré les volumes de réaction réduits (B). La partie C illustre les échantillons de qualité inférieure qui peuvent résulter de la surfragmentation ou de la sous-environnement, de la perte de matériau pendant le nettoyage ou de l’enlèvement infructueux de l’adaptateur. Dans ce dernier cas, un autre nettoyage avec un rapport échantillon-perles plus strict pourrait aider à éliminer la contamination. Les échantillons complètement défaillants étaient extrêmement rares dans nos mains et pouvaient provenir de plusieurs points (p. ex., entrée trop élevée pour la réaction stochiométrique de tagmentation).

La performance des bibliothèques séquencées est illustrée dans la figure 4D pour les échantillons de l’endodermis dans notre arrière-plan mutant. Les bibliothèques de WT et/ou péricycle fonctionnent comme similaires, voire meilleures. Les lectures ribosomal étaient en moyenne d’environ 2 % avec seulement peu d’échantillons supérieurs à 3 %. Les lectures avec un score de qualité moyen supérieur à 30 étaient constamment au-dessus de 90% déjà avant le filtrage. La capacité de cartographie des lectures séquencées était tout aussi élevée, allant en moyenne à 85 %. Pour déterminer la corrélation entre les répliques biologiques, des coefficients Spearman ont été calculés pour chaque point de temps. Tous les tests ont donné lieu à des valeurs de coefficient élevé.

Analyse de la réponse au traitement et de l’enrichissement
Avant la production d’un ensemble de données génomique, l’ARN TRAP d’une expérience pilote peut être sondé par qRT-PCR pour valider le succès du traitement et/ou des conditions expérimentales. Nous avons effectué ce type d’analyse pour évaluer les réponses auxin après 2 h de traitement dans les échantillons de XPP(figure 5A). Trois gènes différents sensibles auxin (GH3.3, LBD29 et GATA23) ont été testés par l’intermédiaire de la méthode57. L’induction très forte a été observée dans chacun des trois cas après la période d’incubation, ce qui suggère que la demande exogène de NAA ait été réussie.

Si les promoteurs nouvellement développés sont utilisés, il faut à ce stade également effectuer une analyse d’enrichissement avec qRT-PCR. À cette fin, un gène marqueur connu (c.-à-d. le gène entraîné par le promoteur utilisé) est amplifié dans le TRAP et l’échantillon total d’ARN et les niveaux d’expression normalisés au niveau total d’ARN. Si l’isolement de l’ARN TRAP du tissu spécifique a été réussi une augmentation significative de changement de pli devrait être obtenue. Alternativement, des informations équivalentes peuvent être récupérées à partir des données de séquençage (voir la figure 5B). L’expression de deux gènes liés à la sous-énine, GPAT5 et HORST, est présente dans tous les échantillons d’endodermis et notamment absente des tissus XPP. Au contraire, les gènes exprimés par le péricycle (PHO1 et SKOR) ne sont que très faiblement exprimés dans les endodermis et enrichis dans les sondes XPP avec une régulation vers le bas induite par les auxin au cours de la période examinée.

Figure 2
Figure 2 : Expression spécifique de type cellulaire de GFP-RPL18 dans la racine arabidopsis. A-B. Images de microscopie confocale de pELTP::GFP-RPL18 (A) et pXPP::GFP-RPL18 (B) exprimant des racines à six jours après la germination. Les contours de mur de cellules ont été obtenus par la coloration avec l’iodure de propidium (magenta). Les sections transversales A1 et B1 proviennent des positions indiquées avec des lignes pointillées en A2 et B2, respectivement. Ces dernières images montrent des projections maximales (MAX) des z-stacks enregistrés. C. Représentation schématique des types de tissus composant la racine arabidopsis dans le longitudinal (C1) et la section transversale (C3) ainsi que dans un primordium de racine latérale (C2). L’image a été modifiée avec la permission de F. Bouché. Barres d’échelle: 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : ÉVALUATION de la qualité de l’ARN TRAP/polysome. A. Tapestation - Résultats représentatifs de 14 échantillons mesurés en représentation d’image de gel avec leurs valeurs respectives de RINe (en haut à gauche). La représentation de l’électrophéogramme est indiquée pour l’échantillon A1 (mis en évidence en bleu). La table de droite informe sur les concentrations de l’échantillon. B. Des traces similaires comme dans A sont obtenues avec le Bioanalyzer. Les panneaux de droite présentent des échantillons avec des niveaux croissants de dégradation, ce qui reflète dans leurs valeurs RIN décroissantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Profils de bibliothèque d’échantillons TRAP/polysome. R. Deux échantillons de TRAP représentatifs (à gauche) correspondent très bien aux traces des bibliothèques réussies recommandées par le guide utilisateur Nextera XT. B. Les volumes de réaction différents donnent des résultats robustes de préparation de bibliothèque. C. Bibliothèques avec des résultats sous-optimaux : fragments très courts (en haut à gauche), fragments extrêmement longs (en bas à gauche), faible concentration (en haut à droite) ou échec complet (en bas à droite). Notez également les fragments courts résiduels (ellipse bleue), qui doivent être enlevés avant le séquençage. Bioanalyzer: traces rouges, LabChip: traces bleues. D. Mesures de qualité sélectionnées pour les échantillons DE TRAP séquencés (endoderme de notre mutant latéral sans racine) à différents moments et distribution de coefficients de corrélation Spearman calculés entre les comparaisons paires de tous les échantillons dans un délai (n-65). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : qRT-PCR et ARN-seq montrent respectivement l’enine-réactivité et l’enrichissement de type tissu. R. Les niveaux d’expression de trois gènes sensibles auxin connus ont été évalués après 2 h de traitement auxin par qRT-PCR. Une forte induction a été observée dans tous les échantillons. RT-PCR a été exécuté sur 3 répliques biologiques indépendantes et normalisé aux échantillons non traités avec UBC21 comme gène de référence interne. Les barres d’erreur représentent le SEM. GH3.3: Gretchen Hagen 3.3, LDB29: LATERAL BOUNDARY DOMAIN 29, GATA23: GATA-motif binding transcription factor 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME 21 B. Niveaux d’expression de quatre gènes marqueurs du jeu de données TRAP-seq. Les échantillons à gauche sont dérivés de l’endodermis (nuances vertes), tandis que les échantillons de droite sont dérivés de XPP (nuances bleues). Les chiffres représentent les intervalles d’incubation auxin en heures. Les z-scores négatifs reflètent de faibles niveaux d’expression et vice versa. Les gènes marqueurs endodermiques (GPAT5, HORST) sont exprimés différemment avec des niveaux élevés dans les échantillons d’endodermis. Au contraire, les marqueurs péricycleaux (PHO1, SKOR) ont des niveaux d’expression élevés dans les cellules XPP et montrent la régulation vers le bas sur le traitement auxin. GPAT5: glycérol-3-phosphate 2-O-acyltransferas (biosynthèse de suberine), HORST: hydroxylase de tissu subérisé racine, PHO1: phosphate 1, SKOR: stéraire K' rectifier extérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : PUBQ10 non constitutif::GFP-RPL18 modèles de localisation. Microscopie confocienne des semis de six jours. Les contours de mur de cellules ont été obtenus par la coloration avec l’iodure de propidium (magenta). Les sections transversales A2 et C1 proviennent des positions indiquées avec des lignes pointillées en A3 et C2, respectivement. Les images marquées MAX montrent des projections maximales des z-stacks enregistrés. A1-A3. Modèles de localisation uniformes de la construction UBQ10-conduite. B1-C2. Diminution notable de la force du signal dans les couches de tissu externe. A, B et C sont enregistrés dans trois plantes différentes. Barres d’échelle: 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Vérification du modèle de localisation RPL18
Crucial pour éviter une mauvaise interprétation des données de toute expérience TRAP est le modèle d’expression approprié du sous-unité ribosomal marqué. Par conséquent, l’incorporation de GFP comme une étiquette d’épitope à RPL18 permet très élégamment la vérification du modèle d’expression désiré et consécutivement, retirer la fraction polysome du même tissu. Des approches plus invasives pour assurer des modèles de promoteurs appropriés sont suivies par Jiao et Mayerowitz 2010, qui nécessite guS-coloring et dans Tian et al. 2019 qui repose sur l’immunostaining avec des anticorps anti-FLAG58,59.

Nous conseillons fortement de vérifier le modèle de localisation dans chaque génération que les lignes transgéniques T-ADN peuvent être sujettes au silence et ainsi la force du signal peut se détériorer ou la proportion de graines exprimant diminue. Avec l’étiquette GFP incorporée dans la construction, ces contrôles fréquents sont facilement effectués par microscopie.

Cependant, même une analyse confocale approfondie peut, dans certains cas, mener à de fausses conclusions. Nous tenons à souligner cela avec notre tentative ratée de produire une ligne de contrôle TRAP. Jusqu’à présent, la communauté des sciences végétales n’a pas été en mesure de créer une ligne végétale avec une distribution uniforme de RPL18 dans toutes les couches cellulaires. Même le promoteur 35S initialement employé a été attribué à seulement montrer "presque constitutive" distribution avec un modèle de localisation non uniforme10. Notre approche était d’utiliser le promoteur d’UBIQUITIN10 (UBQ10) pour conduire la construction GFP-RPL18. Le dépistage de la génération T1 offrait une localisation très prometteuse et a donc été choisi pour être propagé(figure 6A). Cependant, les données d’une course de séquençage de test n’ont pas montré l’enrichissement dans les comparaisons entre elTP- et UBQ10- lignes pilotées pour les gènes spécifiques connus endodermis. En y regardant de plus près ces plantes, nous avons en effet constaté une diminution du signal dans les couches de tissu externe alors que le tissu de stèle montrait une expression forte(figure 6B). Les études futures devraient rechercher le paysage promoteur pour des candidats plus appropriés et compléter la méthode TRAP.

L’ARN total comme échantillon de contrôle
La mise en place d’une meilleure ligne de contrôle TRAP est toujours en attente et sera très attendue par le terrain. Dans cet esprit, jusqu’à présent, la seule façon d’obtenir une distribution uniforme de mouchoirs est de recueillir l’ARN total. Comme, dans ce cas, un transcriptome est échantillonné, cela doit être pris en compte dans la suite de l’analyse bioinformatique. Notamment, les fractions totales d’ARN et d’ARN polysome sont maintenant corrélées car elles proviennent du même échantillon de tissu.

À la recherche d’une méthode de préparation de la bibliothèque TRAP
Comme nous l’avons mentionné précédemment, un inconvénient majeur de l’approche TRAP sont les rendements variables et, surtout faibles, qui peuvent être atteints. Avec des échantillons allant de peu de ng à parfois jusqu’à 100 ng une approche standard avec le kit Illumina TruSeq (100 ng exigence d’entrée) a été jugé trop insensible pour la construction de bibliothèques de qualité suffisante. Une recherche sur le marché a révélé plusieurs kits de préparation de bibliothèque disponibles dans le commerce, qui ont été spécifiés pour travailler avec aussi peu que 5-10 ng matériel de départ. Nous n’avons pas testé le protocole utilisé par Reynoso et coll. 2019, qui fonctionne pour leurs échantillons TRAP de tomate, riz et Medicago et utilise l’approche BrAD-seq60.

Tous nos essais, cependant, avec le séquençage des tests ultérieurs ont donné des résultats insatisfaisants. Malgré l’utilisation d’étapes d’enrichissement polyA, les échantillons de TRAP ont souffert de fortes contaminations ribosomiques (jusqu’à 30 % des lectures). De plus, le taux de réussite pour la préparation de la bibliothèque était variable et particulièrement faible pour les échantillons dont les concentrations étaient extrêmement faibles ou dont les valeurs d’RIN étaient relativement faibles. Nos tests approfondis nous amènent à la conclusion, que la composition spécifique de l’ARN d’un échantillon TRAP, avec une teneur en ARN très élevée et probablement des concentrations d’ARNm minuscule, nécessite une approche plus sensible pour obtenir des bibliothèques fiables. Ainsi, nous nous sommes tournés vers des solutions de pointe pour des montants d’entrée ultra-faibles: SMARTer v4 et Nextera XT. Rassurant, Song et coll. ont également trouvé cette approche de préparation de bibliothèque pour surpasser leurs concurrents quand ils ont testé plusieurs méthodes et leur sortie de séquençage sur le tissu hépatique TRAPed61. Les mesures de qualité que nous avons présentées dans la figure 4D montrent des lectures de haute qualité (Q-gt;30) à de faibles taux de cartographie de l’ARR (lt;3%) en même temps que les taux élevés de cartographie génétique. En outre, des coefficients de corrélation Spearman constamment élevés montrent que les répliques ont en effet des profils d’expression très similaires. L’utilisation des deux kits a été simple avec des nombres de cycles modestes et a donné des résultats robustes et fiables. Les données de séquençage étaient de haute qualité avec 1,5 ng matériel de départ. Avec le kit SMARTer tolérant aussi bas que 200 pg entrée, la quantité de matériel de démarrage de la plante peut être optimisée. L’applicabilité pour les types de cellules plus rares sera finalement déterminée par la faisabilité d’accumuler suffisamment d’ARN.

TRAP complète la boîte à outils de la science végétale
La méthode TRAP est devenue de plus en plus populaire auprès des scientifiques des plantes34 et nous sommes confiants qu’elle va acquérir le statut d’une technique standard pour plusieurs raisons.

Aucune des étapes du protocole TRAP n’a besoin d’équipement spécialisé, comme une machine de tri cellulaire ou un microscope dédié à la capture laser, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’effectuer les expériences. À ce jour, les facteurs les plus coûteux sont la préparation des bibliothèques et le séquençage en aval. Néanmoins, avec l’avancement dynamique des techniques de séquençage de nouvelle génération et la demande croissante de séquençage à cellule unique, nous prévoyons que les coûts diminueront considérablement.

En outre, l’isolement des ARN associés au polysome signifie que des renseignements sont recueillis sur le statut de traduction active de ces ARN (traduction). Par conséquent, TRAP capture la production de toutes les étapes réglementaires qui sont en amont de la traduction et représente un proxy plus direct pour la composition des protéines cellulaires. Bien sûr, les ribosomes au point mort et les modifications post-traductionnelles restent insaisissables et doivent être abordés par d’autres approches (par exemple la protéomique).

Comme indiqué précédemment, un avantage évident que TRAP a dans un contexte végétal est la préservation des structures CW et des propriétés mécaniques des cellules. Comme nous commençons seulement à comprendre les connexions complexes et les fonctions réglementaires qui se posent par CW et la signalisation mécanique31,62,approches qui préservent ces structures deviendra plus important dans de nombreux contextes de développement différents.

En particulier pour les espèces modèles bien établies, TRAP peut profiter d’une richesse de différents promoteurs, qui ont été caractérisés. Dans Arabidopsis, il a donc été possible de cartographier l’ensemble de la racine d’une manière spécifique au type cellulaire en utilisant 19 différents promoteurs de gènes marqueurs30,63. À chaque expérience ARN-seq, ces sélections seront améliorées et de nouveaux promoteurs plus spécifiques surgiront et affineront la résolution cellulaire.

TRAP est en outre applicable dans une utilisation combinatoire avec de nombreux promoteurs pour les populations cellulaires où aucun marqueur n’est encore connu. C’est le cas des cellules spécialisées dans l’endoderme racine. Les cellules dites de passage sont caractérisées par l’absense de la couche de sous-estine qui recouvre les cellules endodermis matures53. La combinaison de promoteurs appropriés et de soustraction silico des profils d’expression distincts enrichira pour les régions qui abritent des cellules de passage. L’analyse transcriptionnelle des reporters aidera ensuite à identifier les gènes des marqueurs cellulaires de passage. Cependant, il reste à déterminer si TRAP peut ensuite analyser la population cellulaire rare sur cette base.

Dans cet article, nous avons fourni une description détaillée de la méthode de purification de l’affinité traduire-ribosome, ses avantages et ses limites, et mis en évidence des applications potentielles de celui-ci. Dans le portefeuille d’études « omics », il occupe un créneau important et aidera à répondre à de nombreuses questions biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Jean-Claude Walser du Centre de diversité génétique de Zurich pour les conseils d’experts cruciaux dans la première phase de ce projet. Les travaux du laboratoire Vermeer ont été soutenus par une subvention de la Chaire SNF (PP00P3_157524) et une subvention d’équipement R’EQUIP (316030-164086) de la Fondation nationale suisse des sciences (SNSF) décernée à JEMV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

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References

  1. Van Verk, M. C., Hickman, R., Corné, M. J., Pieterse, M., Van Wees, S. C. RNA-Seq: Revelation Of The Messengers. Trends In Plant Science. 18 (4), 175-179 (2013).
  2. Libault, M., Pingault, L., Zogli, P., Schiefelbein, J. Plant Systems Biology At The Single-Cell Level. Trends In Plant Science. 22 (11), 949-960 (2017).
  3. Mustroph, A., et al. Profiling Translatomes Of Discrete Cell Populations Resolves Altered Cellular Priorities During Hypoxia In Arabidopsis. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 106 (44), 18843-18848 (2009).
  4. Karve, R., Iyer-Pascuzzi, A. S. Digging Deeper: High-Resolution Genome-Scale Data Yields New Insights Into Root Biology. Current Opinion In Plant Biology. 24, 24-30 (2015).
  5. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A Multiple Ribosomal Structure In Protein Synthesis. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 49 (1), 122-129 (1963).
  6. Gautam, V., Sarkar, A. K. Laser Assisted Microdissection, An Efficient Technique To Understand Tissue Specific Gene Expression Patterns And Functional Genomics In Plants. Molecular Biotechnology. 57 (4), 299-308 (2015).
  7. Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Fluorescence Activated Cell Sorting Of Plant Protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (36), e1673 (2010).
  8. Deal, R. B., Henikoff, S. The Intact Method For Cell Type-Specific Gene Expression And Chromatin Profiling In Arabidopsis Thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  9. Dougherty, J. D. The Expanding Toolkit Of Translating Ribosome Affinity Purification. The Journal of Neuroscience: The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 37 (50), 12079-12087 (2017).
  10. Mustroph, A., Juntawong, P., Bailey-Serres, J. Isolation Of Plant Polysomal mRNA By Differential Centrifugation And Ribosome Immunopurification Methods. Methods in Molecular Biology. 553, 109-126 (2009).
  11. Matsushima, W., et al. SLAM-ITseq: Sequencing Cell Type-Specific Transcriptomes Without Cell Sorting. Development. 145 (13), (2018).
  12. Basnet, H., et al. Flura-Seq Identifies Organ-Specific Metabolic Adaptations During Early Metastatic Colonization. Elife. 8, (2019).
  13. Rodriques, S. G., et al. Slide-Seq: A Scalable Technology For Measuring Genome-Wide Expression At High Spatial Resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  14. Fazal, F. M., et al. Atlas Of Subcellular RNA Localization Revealed By Apex-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  15. Slane, D., Bayer, M. Cell Type-Specific Gene Expression Profiling Using Fluorescence-Activated Nuclear Sorting. Plant Gene Regulatory Networks: Methods And Protocols. Kaufmann, K., Mueller-Roeber, B. , Springer. New York, NY. 27-35 (2017).
  16. Zanetti, M. E., Chang, I. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification Of Polyribosomal Complexes Of Arabidopsis For Global Analysis Of Gene Expression. Plant Physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  17. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome Profiling: Methods For Genome-Scale Analysis Of mRNA Translation. Briefings In Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2016).
  18. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome Analysis And RNA Purification From Sucrose Gradients. RNA: Methods And Protocols. Nielsen, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 293-309 (2011).
  19. Heiman, M., et al. A Translational Profiling Approach For The Molecular Characterization Of Cns Cell Types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  20. Halbeisen, R. E., Scherrer, T., Gerber, A. P. Affinity Purification Of Ribosomes To Access The Translatome. Methods. 48 (3), 306-310 (2009).
  21. Thomas, A., et al. A Versatile Method For Cell-Specific Profiling Of Translated mRNAs In Drosophila. Plos One. 7 (7), e40276 (2012).
  22. Watson, F. L., et al. Cell Type-Specific Translational Profiling In The Xenopus Laevis Retina. Developmental Dynamics. 241 (12), 1960-1972 (2012).
  23. Lam, P. Y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility In Zebrafish. Plos One. 8 (12), e84436 (2013).
  24. Fang, Y., et al. Translational Profiling Of Cardiomyocytes Identifies An Early Jak1/Stat3 Injury Response Required For Zebrafish Heart Regeneration. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  25. Mustroph, A., Zanetti, M. E., Girke, T., Bailey-Serres, J. Isolation And Analysis Of mRNAs From Specific Cell Types Of Plants By Ribosome Immunopurification. Methods In Molecular Biology. 959, 277-302 (2013).
  26. Monshausen, G. B., Gilroy, S. Feeling Green: Mechanosensing In Plants. Trends In Cell Biology. 19 (5), 228-235 (2009).
  27. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be More Specific! Laser-Assisted Microdissection Of Plant Cells. Trends In Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  28. Sheen, J. Signal Transduction In Maize And Arabidopsis Mesophyll Protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  29. Datta, S., et al. Laser Capture Microdissection: Big Data From Small Samples. Histology And Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  30. Birnbaum, K., et al. A Gene Expression Map Of The Arabidopsis Root. Science. 302 (5652), 1956 (2003).
  31. Hamant, O., Haswell, E. S. Life Behind The Wall: Sensing Mechanical Cues In Plants. BMC Biology. 15 (1), 1354 (2017).
  32. Vragović, K., et al. Translatome Analyses Capture Of Opposing Tissue-Specific Brassinosteroid Signals Orchestrating Root Meristem Differentiation. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 923-928 (2015).
  33. Wang, Y., Jiao, Y. Translating Ribosome Affinity Purification (Trap) For Cell-Specific Translation Profiling In Developing Flowers. Methods In Molecular Biology. 1110, 323-328 (2014).
  34. Sablok, G., Powell, J. J., Kazan, K. Emerging Roles And Landscape Of Translating mRNAs In Plants. Frontiers in Plant Science. 8, 1443 (2017).
  35. Ron, M., et al. Hairy Root Transformation Using Agrobacterium Rhizogenes As A Tool For Exploring Cell Type-Specific Gene Expression And Function Using Tomato As A Model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
  36. Reynoso, M. A., et al. Evolutionary Flexibility In Flooding Response Circuitry In Angiosperms. Science. 365 (6459), 1291-1295 (2019).
  37. Dolan, L., et al. Cellular Organisation Of The Arabidopsis Thaliana Root. Development. 119 (1), 71 (1993).
  38. Ristova, D., Barbez, E. Root Development. , Springer. New York, NY. (2018).
  39. Shekhar, V., Stӧckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. M. The Role Of Plant Root Systems In Evolutionary Adaptation. Current Topics in Developmental Biology. 131, 55-80 (2019).
  40. Malamy, J. E., Benfey, P. N. Down And Out In Arabidopsis: The Formation Of Lateral Roots. Trends in Plant Science. 2 (10), 390-396 (1997).
  41. de Smet, I., et al. Bimodular Auxin Response Controls Organogenesis In Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 107 (6), 2705-2710 (2010).
  42. Péret, B., et al. Arabidopsis Lateral Root Development: An Emerging Story. Trends In Plant Science. 14 (7), 399-408 (2009).
  43. Vilches-Barro, A., Maizel, A. Talking Through Walls: Mechanisms Of Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 23, 31-38 (2015).
  44. Porco, S., et al. Lateral Root Emergence In Arabidopsis Is Dependent On Transcription Factor Lbd29 Regulation Of Auxin Influx Carrier Lax3. Development. 143 (18), 3340-3349 (2016).
  45. Stoeckle, D., Thellmann, M., Vermeer, J. E. Breakout-Lateral Root Emergence In Arabidopsis Thaliana. Current Opinion in Plant Biology. 41, 67-72 (2018).
  46. Banda, J., et al. Lateral Root Formation In Arabidopsis: A Well-Ordered Lrexit. Trends in Plant Science. 24 (9), 826-839 (2019).
  47. Vermeer, J. E. M., et al. A Spatial Accommodation By Neighboring Cells Is Required For Organ Initiation In Arabidopsis. Science. 343 (6167), 178-183 (2014).
  48. Vanneste, S., et al. Cell Cycle Progression In The Pericycle Is Not Sufficient For Solitary Root/Iaa14-Mediated Lateral Root Initiation In Arabidopsis Thaliana. The Plant Cell. 17 (11), 3035-3050 (2005).
  49. Marques-Bueno, M. M., et al. A Versatile Multisite Gateway-Compatible Promoter And Transgenic Line Collection For Cell Type-Specific Functional Genomics In Arabidopsis. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 85 (2), 320-333 (2016).
  50. Shimada, T. L., Shimada, T., Hara-Nishimura, I. A Rapid And Non-Destructive Screenable Marker, Fast, For Identifying Transformed Seeds Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal : For Cell and Molecular Biology. 61 (3), 519-528 (2010).
  51. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral Dip: A Simplified Method For Agrobacterium Mediated Transformation Of Arabidopsis Thaliana. The Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  52. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method For High-Throughput Sterilization Of Arabidopsis Seeds. Journal Of Visualized Experiments. (128), e56587 (2017).
  53. Andersen, T. G., et al. Diffusible Repression Of Cytokinin Signalling Produces Endodermal Symmetry And Passage Cells. Nature. 555, 529-533 (2018).
  54. Schroeder, A., et al. The Rin: An Rna Integrity Number For Assigning Integrity Values To Rna Measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  55. Vragović, K., Bartom, E., Savaldi-Goldstein, S. Quantitation Of Cell Type-Specific Responses To Brassinosteroid By Deep Sequencing Of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods in Molecular Biology. 1564, 81-102 (2017).
  56. Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. Trap-Rc, Translating Ribosome Affinity Purification From Rare Cell Populations Of Drosophila Embryos. Journal Of Visualized Experiments. (103), e52985 (2015).
  57. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis Of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR And The 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  58. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-Type Specific Analysis Of Translating Rnas In Developing Flowers Reveals New Levels Of Control. Molecular Systems Biology. 6, 419 (2010).
  59. Tian, C., et al. A Gene Expression Map Of Shoot Domains Reveals Regulatory Mechanisms. Nature Communications. 10 (1), 141 (2019).
  60. Townsley, B. T., Covington, M. F., Ichihashi, Y., Zumstein, K., Sinha, N. R. Brad-Seq: Breath Adapter Directional Sequencing: A Streamlined, Ultra-Simple And Fast Library Preparation Protocol For Strand Specific mRNA Library Construction. Frontiers in Plant Science. 6, 366 (2015).
  61. Song, Y., et al. A Comparative Analysis Of Library Prep Approaches For Sequencing Low Input Translatome Samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  62. Basu, D., Haswell, E. S. Plant Mechanosensitive Ion Channels: An Ocean Of Possibilities. Current Opinion in Plant Biology. 40, 43-48 (2017).
  63. Brady, S. M., et al. A High-Resolution Root Spatiotemporal Map Reveals Dominant Expression Patterns. Science. 318 (5851), 801 (2007).

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Biologie du développement Numéro 159 Arabidopsis TRAP TRAP-seq profilage de traduction cell type spécifique ARN-seq formation latérale de racine différenciation endodermis
Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine <em>d’Arabidopsis thaliana</em> à une échelle spécifique au type cellulaire
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Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

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