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Developmental Biology

एक सेल प्रकार विशिष्ट पैमाने पर अरबीdopsis थैलियाना रूट विकास की जांच करने के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (ट्रैप) का अनुवाद

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/60919
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Summary

राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) का अनुवाद करने से अंगों और ऊतकों के न्यूनतम प्रसंस्करण के साथ विकासात्मक कार्यक्रमों को विच्छेदन करने की संभावना प्रदान होती है। प्रोटोकॉल एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल राइबोसोमल उपइकाई के साथ लक्षित कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए पैदावार । डाउनस्ट्रीम विश्लेषण उपकरण, जैसे क्यूआरटी-पीसीआर या आरएनए-सीक्यू, ऊतक और सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रकट करते हैं।

Abstract

इस लेख में, हम अनुवादराइसोम एफ़िनिटी शुद्धि (ट्रैप) विधि और लगातार अनुकूलित कम इनपुट लाइब्रेरी तैयारी के माध्यम से विभिन्न अरबीडोप्सिस थैलियाना रूट सेल प्रकारों से अनुवाद डेटा प्राप्त करने के लिए हाथ पर निर्देश देते हैं।

प्रारंभिक सामग्री के रूप में, हम पौधे की लाइनों को नियोजित करते हैं जो पर्याप्त प्रमोटरों के उपयोग से सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से जीएफपी-टैग किए गए राइबोसोमल प्रोटीन आरपीएल18 को व्यक्त करते हैं। इम्यूनोशुद्धि और आरएनए निष्कर्षण से पहले, ऊतक स्नैप फ्रोजन है, जो ऊतक अखंडता को बरकरार रखता है और साथ ही उच्च लौकिक संकल्प के साथ समय श्रृंखला अध्ययन के निष्पादन की अनुमति देता है। विशेष रूप से, सेल दीवार संरचनाएं बरकरार रहती हैं, जो वैकल्पिक प्रक्रियाओं में एक प्रमुख खामी है जैसे फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई-आधारित दृष्टिकोण जो अलग सेल आबादी को अलग करने के लिए ऊतक प्रोटोस्टॉन्स्तक पर भरोसा करते हैं। इसके अतिरिक्त, लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन-आधारित तकनीकों के रूप में कोई ऊतक निर्धारण आवश्यक नहीं है, जो उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को प्राप्त करने की अनुमति देता है।

हालांकि, कोशिकाओं की उपआबादी से नमूना और केवल पॉलीसम से जुड़े आरएनए को अलग करना आरएनए पैदावार को गंभीर रूप से सीमित करता है। इसलिए आरएनए-सीक्यू द्वारा सफल डेटा अधिग्रहण के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील पुस्तकालय तैयार करने के तरीकों को लागू करना आवश्यक है।

ट्रैप पौधे अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है क्योंकि कई विकासात्मक प्रक्रियाओं में सेल दीवार से संबंधित और यांत्रिक सिग्नलिंग रास्ते शामिल हैं। विशिष्ट सेल आबादी को लक्षित करने के लिए प्रमोटरों का उपयोग अंग और एकल-कोशिका स्तर के बीच अंतर को पाट रहा है जो बदले में थोड़ा संकल्प या बहुत अधिक लागत से पीड़ित है। यहां, हम पार्श्व जड़ गठन में सेल-सेल संचार का अध्ययन करने के लिए ट्रैप लागू करते हैं।

Introduction

अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों के बढ़ते आवेदन से प्रेरित होकर विकासात्मक जीव विज्ञान में स्थानिक संकल्प को बढ़ाया जा सकता है । समकालीन अध्ययनों का उद्देश्य ऊतकों को विशेष कोशिका प्रकारों से विभाजित करना है, यदि एकल-कोशिका स्तर1,,2,,3,44नहीं है। इसके लिए पिछले पचास वर्षों में विभिन्न तरीकों की अधिकता तैयार की गई है (देखें चित्रा 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.,

संयंत्र विज्ञान में कई उपकरण तकनीकों के अनुकूलन रहे हैं जिन्हें पशु अनुसंधान में बीड़ा उठाया गया था। यह तरीका हम यहां विस्तार से शुरू कर रहे है के लिए मामला नहीं है । 2005 में, प्रोटीन अनुवाद में एक मजबूत पृष्ठभूमि से लैस, बेली-सेरेस लैब ने बाद में आत्मीयता शुद्धि16के लिए राइबोसोमल प्रोटीन इंजीनियर के लिए तैयार किया। इस प्रकार, वे समय लेने वाली और श्रम-प्रधान पॉलीसम प्रोफाइलिंग से बच सकते हैं, जो एक सुक्रोज ढाल के साथ अल्ट्रासेंट्रोइफेशन पर आधारित है और 1 9 60 के दशक17,,18के बाद से राइबोसोम ्स के अनुवाद का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था। विधि के बाद से अनुवादीय राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (TRAP)16के रूप में संदर्भित किया गया है । पौधों में सफल अनुवाद अध्ययन के बाद, हीमैन एट अल. जानवरों के लिए अनुकूलित ट्रैप19 और अन्य ने खमीर20, ड्रोसोफिला21, ज़ेनोपस22 और जेब्राफिश23,,24तक अपना आवेदन बढ़ाया।

हालांकि मॉडल प्रणाली के आनुवंशिक संशोधन जाल के लिए एक शर्त है, जो आनुवंशिक परिवर्तन के लिए उत्तरदायी प्रजातियों के लिए अपने आवेदन सीमा है, एक साथ25 इस आपत्ति का दोहन करने के लिए कोशिकाओं के सबसेट है कि विशेष रुचि के है और अंयथा बेहद मुश्किल बरकरार ऊतक से अलग करने के लिए कर सकते है/ पौधों में, सभी कोशिकाओं को सेल दीवारों के माध्यम से जगह में रखा जाता है जो हाइड्रोस्टैटिक कंकाल26का आधार बनाते हैं। इस मैट्रिक्स से एक संयंत्र कोशिका को मुक्त करने के लिए, वैज्ञानिकों ने या तो शारीरिक रूप से लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम)27 के माध्यम से अपने आसपास के ऊतकों से बाहर कोशिका को काट दिया है या सेल दीवारों28के एंजाइमेटिक पाचन प्रदर्शन किया है । बाद की कोशिकाओं में, तथाकथित प्रोटोप्लास्ट, ब्याज की आबादी फ्लोरोसेंटी लेबल है और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS)7के माध्यम से अलग किया जा सकता है । एलसीएम को आमतौर पर मोम में तय और एम्बेडेड होने के लिए एक नमूना की आवश्यकता होती है, जो अंततः इसके आरएनए29की गुणवत्ता को खराब कर देता है। FACS आधारित तरीकों उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए उपज है, लेकिन प्रोटॉपअनेशन की प्रक्रिया ही जीन अभिव्यक्ति30 में मतभेदों का परिचय और संशोधित और मोटी माध्यमिक सेल दीवारों के साथ ऊतकों का इलाज करने के लिए बेहद मुश्किल हैं । इसके अलावा, पौधों में कई विकासप्रक्रियाओं को यांत्रिक रूप से प्रेषित संकेतों पर भरोसा करने के लिए माना जाता है और इसलिए सेल की दीवार की अखंडता31सर्वोपरि महत्व की है। दो तरीके, जो न्यूक्ली के स्तर पर परिचालन करके सेल अलगाव को दरकिनार करने के लिए शॉर्टकट का उपयोग करते हैं, फ्लोरेसेंस-सक्रिय परमाणु छंटाई (प्रशंसक) और विशिष्ट सेल प्रकार (बरकरार) में टैग किए गए नाभिक के अलगाव हैं। ट्रैप के रूप में, वे नाभिक को चिह्नित करने के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करते हैं, जो बाद में क्रमशः8,,15को छंटाई या नीचे खींचने के माध्यम से समृद्ध हो जाते हैं। इन सभी दृष्टिकोणों के लिए एक बड़ी चुनौती ऊतक में कोशिकाओं के सबसेट से पर्याप्त आरएनए सामग्री प्राप्त करना है। चूंकि ट्रैप सेलुलर आरएनए के केवल एक अंश को कैप्चर करता है, नमूना संग्रह काफी अड़चन है। इसलिए, कम इनपुट राशि से उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील पुस्तकालय तैयार करने के प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

अपनी स्थापना के बाद से, ट्रैप का उपयोग या तो डीएनए माइक्रोरे के संयोजन में किया गया है या, क्योंकि अनुक्रमण लागत हाल के वर्षों में काफी गिरा, आरएनए-सीक्यू10,,32,,33। सबलोक एट अल३४में समीक्षा के रूप में अनुसंधान प्रश्नों की एक भीड़ पहले से ही स्पष्ट किया गया है । हम आश्वस्त है कि अधिक रिपोर्ट आने वाले वर्षों में पालन करेंगे के रूप में तकनीक बहुत बहुमुखी है जब विभिंन प्रमोटरों के संयोजन के लिए विशिष्ट सेल प्रकार को लक्षित । अंततः, यह भी एक inducible तरीके से किया जाएगा, और कई बायोटिक और अजैविक तनाव कारकों के लिए संयंत्र की प्रतिक्रिया की जांच के साथ संयुक्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, जहां स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनें उपलब्ध नहीं हैं, बालों वाली रूट अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग टमाटर और मेडिगो35,,36में ट्रैप करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) का अनुवाद "ओमिक्स" विश्लेषण पोर्टफोलियो का पूरक है। A. विश्लेषणात्मक परिशुद्धता के बढ़ते स्तर, एकल सेल या यहां तक कि उपकोशिकीय संकल्प के लिए नीचे तरीकों या उसके संयोजन की अधिकता से प्राप्त किया जा सकता है । यह योजना संयंत्र और पशु क्षेत्र में वर्तमान में उपलब्ध उपकरणों का अवलोकन देती है । सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर ऊतक संग्रह एलसीएम या एफएसीएस जैसे प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो तब मानक प्रतिलेखन या पॉलीसम प्रोफाइलिंग/अनुवाद विश्लेषण के साथ मिलकर होते हैं। ट्रैप और बरकरार ऊतक कैप्चर और आरएनए अलगाव दोनों को एकीकृत करते हैं क्योंकि वे एपिटोप-टैगिंग पर आधारित होते हैं। हालांकि, बरकरार नमूने केवल सेल न्यूक्लिकी और गठन, इसलिए, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण का एक विशेष मामला है । एक छोटा खरगोश आइकन पशु क्षेत्र में नए विकसित तरीकों को चिह्नित करता है: जबकि स्लैम-ITseq और फ्लूरा-सीक्यू स्वतंत्र एंजाइम व्यक्त कोशिकाओं में संशोधित यूसिल ठिकानों के साथ नवजात आरएनए के मेटाबोलिक टारगेटिंग पर भरोसा करते हैं, स्लाइड-सीक्यू डीएनए बारकोड के साथ एक लेपित ग्लास स्लाइड का उपयोग करता है जो सेलुलर रेंज में स्थितीय जानकारी प्रदान करता है। विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बों में आरएनए का नमूना लेने के लिए एपेक्स-सीक्यू में निकटता-लेबलिंग दृष्टिकोण का पालन किया जाता है। विशेष रूप से, बढ़े हुए संकल्प के लिए अक्सर ट्रांसजेनिक सामग्री (तारक) की पीढ़ी की आवश्यकता होती है और इस प्रकार इन तरीकों का उपयोग मुख्य रूप से मॉडल प्रजातियों के लिए किया जाता है। ट्रैप विशेष रूप से पौधे विज्ञान अध्ययनों के लिए अनुकूल है जिसमें सेल वॉल (सीडब्ल्यू) या मैकेनिक सिग्नलिंग के साथ-साथ सेल प्रजातियां शामिल हैं जिन्हें उनके सीडब्ल्यू मैट्रिक्स से छोड़ना मुश्किल है। बी जाल प्रक्रिया के विस्तृत गीले प्रयोगशाला कदम: अलग सेल प्रकार (जैसे रूट एंडोडरमिस) में GFP-टैग राइबोसोमल प्रोटीन व्यक्त रोपण सात दिनों के लिए पेट्री व्यंजन ों पर उगाए जाते हैं और स्नैप फ्रीजिंग द्वारा काटा गया जड़ सामग्री। सेंट्रलाइज्ड के जरिए मलबे को पैलेट करने से पहले एमोजेनाइज्ड क्रूड एक्सट्रैक्ट से कुल आरएनए कंट्रोल सैंपल एकत्र किया जाता है । इम्यूनोप्रिसिप्रिशन करने के लिए क्लीयर किए गए एक्सट्रैक्ट में मैग्नेटिक एंटी-जीएफपी मोतियों को जोड़ा जाता है। इनक्यूबेशन और तीन वॉश स्टेप्स के बाद पॉलीसम से जुड़े आरएनए (ट्रैप/पॉलीसम आरएनए) को सीधे फिनॉल-क्लोरोफॉर्म एक्सट्रैक्शन के जरिए प्राप्त किया जाता है । एलसीएम: लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, FACS/FANS: फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल/ एपेक्स-सीक्यू: इंजीनियर एकोर्सबेट पेरोक्सिडेस पर आधारित विधि, बरकरार: विशिष्ट सेल प्रकारों में टैग किए गए नाभिक का अलगाव, स्लैम-आईटीएसक्यू: थियोल (एसएच) - ऊतक में आरएनए के मेटाबोलिक अनुक्रमण के लिए अल्बाइलेशन से जुड़ा हुआ है, फ्लूरा-सीक्यू: फ्लोरोरासिल-लेबल आरएनए अनुक्रमण (Biorender.com के साथ बनाया गया) कृपया यहां क्लिक करें

इस लेख का लक्ष्य जाल विधि का विस्तृत विवरण प्रदान करना, महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करना और संभावित पुस्तकालय तैयारकरने की विधि के लिए मार्गदर्शन प्रदान करना है।

एक जेनेरिक ट्रैप प्रयोग में अनिवार्य रूप से निम्नलिखित चरण शामिल होंगे (चित्रा 1Bभी): (1) राइबोसोम-टैगिंग निर्माण की क्लोनिंग, ट्रांसजेनिक लाइन उत्पादन और चयन, बीज, नसबंदी और चढ़ाना, और तनाव आवेदन/उपचार (वैकल्पिक) और ऊतक संचयन की क्लोनिंग सहित संयंत्र सामग्री की तैयारी; (2) ऊतक समरूपता और कच्चे तेल के अर्क के समाशोधन, मनका धोने और इम्यूनोशुद्धि, और धोने के कदम सहित इम्यूनोशुद्धि; (3) आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता मूल्यांकन; और (4) पुस्तकालय की तैयारी।

अरबीडोप्सिस रूट एक मॉडल प्लांट37,38के रूप में शुरू होने के बाद से पौधों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली रही है . यहां, ट्रैप के आवेदन को पौधे पार्श्व जड़ विकास के संदर्भ में प्रदर्शित किया जाता है। पौधों में, पूरे रूट सिस्टम का बिल्डअप इस कार्यक्रम के निष्पादन पर निर्भर करता है और इसलिए जीव39के अस्तित्व के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अरबीडोप्सिसमें पार्श्व जड़ें पेरिसाइकिल ऊतक से उत्पन्न होती हैं जो दारू के जहाजों के बगल में रहती हैं और इसलिए दारू ध्रुव पेरिसाइकिल (XPP; देखें चित्रा 2 C)40। कुछ एक्सपीपी कोशिकाएं, जो जड़ के अंदर गहरे स्थित हैं, एक संस्थापक सेल पहचान प्राप्त करती हैं और एक स्थानीय हार्मोनल ट्रिगर पर, सूजन और एंटीक्लिनली41को विभाजित करके पैदा होना शुरू कर देती हैं। हालांकि, एक कठोर सेल दीवार मैट्रिक्स की उपस्थिति के कारण, यह प्रक्रिया आसपास के ऊतकों पर यांत्रिक तनाव डालती है। विशेष रूप से, अंतर्निहित एंडोडरमिस प्रभावित होता है, क्योंकि यह पार्श्व जड़ वृद्धि धुरी42,43,44के रास्ते में है। दरअसल, नए बनाने वाले प्राइमोर्डियम को ओवरलाइंग एंडोडरमिस सेल(चित्रा 2C2)के माध्यम से विकसित करना होगा जबकि कॉर्टेक्स और एपिडर्मिस कोशिकाओं को प्राइमोर्डियम के लिए अंत में45,,46उभरने के लिए अलग धकेल दिया जाता है। हमारी प्रयोगशाला में हाल के काम से पता चला है कि एंडोडरमिस सक्रिय रूप से pericycle में प्रसार को समायोजित करने के लिए योगदान दे रहा है । एंडोडरमल हार्मोनल सिग्नलिंग को लक्षित अवरुद्ध करना एक्सपीपी कोशिकाओं47में प्रथम श्रेणी को बाधित करने के लिए पर्याप्त है । इसलिए, पेरिसाइकिल-एंडोडरमिस संचार अरबीडोप्सिसमें पार्श्व जड़ विकास के लिए एक बहुत ही प्रारंभिक चौकी का गठन करता है। हालांकि यह पता नहीं चल पाया है कि यह क्रॉसटॉक कैसे किया जाता है । इस रहस्य को जानने के लिए, हमने एक्सपीपी और एंडोडरमल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ट्रैप-सीक्यू दृष्टिकोण चुना। पार्श्व रूट कार्यक्रम में कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए, हमने एक ऑक्सिन एनालॉग (1-नेफ्थेलेनेटिक एसिड, एनएए)48को लागू करके हार्मोनल ट्रिगर की नकल की, जिसने साथ ही पार्श्व जड़ गठन के प्रारंभिक चरण को अस्थायी रूप से हल करने की अनुमति दी।

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Protocol

1. ट्रांसजीन, ट्रांसजेनिक लाइन उत्पादन और चयन की क्लोनिंग

  1. उचित प्रवेश वेक्टर में पसंद के प्रमोटर क्लोन। एक पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग विधि(सामग्री की तालिका)का उपयोग करें और pDONRP4-P1r. क्लोन RPL18 (पसंद के आत्मीयता टैग या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ) में प्रमोटरों को फिर से मिलाने pDONRP1-P249में पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग का उपयोग करें।
  2. ट्रांसजेनिक बीजों के प्रत्यक्ष चयन की सुविधा के लिए फास्ट-रेड चयन कैसेट50 के साथ उपयुक्त गंतव्य वेक्टर में प्रमोटर युक्त प्रवेश वेक्टर के साथ आरपीएल18 युक्त प्रवेश वेक्टर को मिलाएं।
  3. अनुक्रमण द्वारा पुनर्संयोजन वेक्टर को सत्यापित करें और इसे उपयुक्त, सक्षम एग्रोबैक्टीरिया में बदल दें। फूल डुबकी अरबीडोप्सिस पौधों और 3-4 सप्ताह फसल के बाद और T1 बीज५१का चयन करें ।
  4. अच्छी तरह से व्यक्त लाइनों की पहचान करने और कई स्वतंत्र लाइनों में रिपोर्ट प्रमोटर गतिविधि के अनुसार अभिव्यक्ति पैटर्न को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। एक ही टी डीएनए प्रविष्टि के साथ एक प्रतिनिधि अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा लाइनों का चयन करें। यह मुंह को कम करने में मदद कर सकता है और आनुवंशिक क्रॉस के लिए लाभप्रद होगा।
  5. मार्कर जीन के लिए होमोज़िगौस है कि T3 संतानों का चयन करें।

2. प्रचार और नसबंदी

  1. सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रैप प्रति रूट लक्ष्य कोशिकाओं की सीमित संख्या से आरएनए को अलग करता है। आवश्यक प्रारंभिक सामग्री उत्पन्न करने के लिए, होमोज़िगौस लाइनों का प्रचार करें। इस उद्देश्य के लिए, फंगल विकास नियंत्रण पर विशेष ध्यान देने के साथ मानक विकास की स्थिति का उपयोग करें।
    नोट: यदि एकल प्रविष्टि लाइनों प्राप्त नहीं किया जा सकता है, टी डीएनए प्रेरित ट्रांसजेनरेशनल मुंह से बचने के लिए कुछ पीढ़ियों में बड़ी आबादी में बैचों को विकसित करें ।
  2. क्लोरीन गैस के एक दौर और 70% EtOH के एक दौर के साथ अरबीडोप्सिस बीज की बड़ी मात्रा में स्टरलाइज करें।
    1. बीज को समान रूप से 12 सेमी x 12 सेमी वर्ग पेट्री व्यंजन (0.3 mL बीज/प्लेट से कम) पर फैलाएं और उन्हें एक डिसिकाटर या अन्य उपयुक्त कंटेनर में ढेर करें। झुरमुट या ढेर गठन से बचें क्योंकि बीजों को गैस के लिए सुलभ होने की आवश्यकता होती है। ब्लीच और एचसीएल की मात्रा के साथ रात भर गैस नसबंदी करें रिपोर्ट के रूप में५२:ब्लीच के १०० मिलीएल (13%) एक 60 एल desiccator में conc. HCl के 6 mL के साथ। एक बाँझ कंटेनर में बीज इकट्ठा करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए Defumigate।
      सावधानी: 37% एचसीएल अत्यधिक संक्षारक है और सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता है। क्लोरीन गैस विषाक्त है, एक धुएं हुड का उपयोग करें।
    2. प्रति प्लेट सूखे, गैस-निष्फल बीजों के 0.1 मिलील लें और उन्हें कमरे के तापमान पर नसबंदी समाधान (70% EtOH, 0,01% ट्वीन) के साथ मिलाएं। 20 मिन, डेजेंट EtOH के लिए इनक्यूबेट और बाँझ एच2ओ के साथ बीज 3-4 बार धोने।
    3. भिगोए गए बीजों को 50 मिलीएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और बाँझ 0.1% आगर के साथ पतला करें प्रति प्लेट प्रति बीज घोल (0.1 मिलीएल बीज/1 एमएल घोल) के 1 मिलील प्राप्त करने के लिए।
      नोट: ट्रांसजीन एकीकरण की घटनाओं के कारण, पौधे की रेखाएं विभिन्न नसबंदी तकनीकों के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती हैं; विशेष रूप से EtOH इनक्यूबेशन समय के लिए महत्वपूर्ण पाया गया था । हमारे हाथों में प्रयोगों के दौरान फंगल संदूषण से बचने के लिए दोहरी नसबंदी के कदम जरूरी थे। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एक ही समय बिंदु के संदूषण के रूप में समय श्रृंखला प्रदर्शन पूरे प्रयोग में बाधा डालती है । यह अच्छी तरह से हो सकता है कि दोहरी नसबंदी हमेशा की जरूरत नहीं है, स्थानीय बढ़ती स्थितियों पर निर्भर करता है ।

3. चढ़ाना

  1. इन स्टेप्स को पहले से तैयार करें। प्रयोग के लिए आवश्यक मात्रा ओं में 1% आगर के साथ 1/2 एमएस प्लेटें (पीएच 5.8) डालें (20-30 प्रति नमूना/टाइम पॉइंट)। सीए के लिए टिप व्यास को बड़ा करने के लिए 1 mL पिपेट टिप्स काटें। 3-4 मिमी रेजर ब्लेड के साथ। सुझावों को ऑटोक्लेव करें। स्क्वायर पेट्री डिश ढक्कन के साथ प्रति प्लेट बीजों की तीन पंक्तियों को चढ़ाना के लिए एक टेम्पलेट धारक बनाएं। एक बाँझ काम वातावरण प्रदान करने के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड तैयार करें और प्लेटों को संसाधित करने के लिए लेबल करें।
    नोट: यदि कई प्लेटों को एक ही समय में संसाधित किया जाता है, तो रंगीन लेबल लेबलिंग को गति दे सकते हैं।
  2. टेम्पलेट धारक में खाली आगर प्लेटें रखें और तीन पंक्तियों पर समान रूप से आत्मसात बीजों के 1 मिलील वितरित करें। प्रसंस्कृत प्लेटों को स्टैक में लैमिनार प्रवाह में तब तक रखें जब तक कि बीज सूखन न हों (यानी, आगर की सतह से चिपके रहें)। प्लेटों को लंबे समय तक न छोड़ें क्योंकि आगर भी सूख जाएगा।
  3. एक बार बीज पर्याप्त रूप से शुष्क होने के बाद, ढक्कन बंद करें और प्रत्येक प्लेट को माइक्रोपोर टेप के साथ सील करें। दो दिनों के लिए बीज को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्ट्रैटिफाई करें और बाद में उन्हें ग्रोथ चैंबर में रखें।

4. ऊतक उपचार (वैकल्पिक)

नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम सिंथेटिक ऑक्सिन संस्करण एनएए के साथ अरबीडोप्सिस जड़ों के बहिर्जात उपचार की रूपरेखा तैयार करते हैं। हाथ में प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, इस भाग को समायोजित करने की आवश्यकता है या पूरी तरह से छोड़ा जा सकता है।

  1. ऊंचाई में 1.5 - 2 सेमी और लंबाई में 10 सेमी के ऊतक कागज की स्ट्रिप्स तैयार करें। विस्तारित इनक्यूबेशन बार ऊतक का उपयोग करने से पहले स्वचालित करने की आवश्यकता होती है।
  2. हार्मोन ट्रीटमेंट से गुजरना है कि सभी प्लेटों से माइक्रोपोर टेप निकालें। तरल के 1 एल में 10 एमएम एनएए (डीएमएसओ में भंग) का पतला 1 मिलीएल, 1/2 एमएस समाधान (पीएच 5.8) को ऑटोक्लेव किया गया और ऊतक कागज को समाधान (10 माइक्रोएम एनएए) में भिगो दें।
  3. जड़ों की प्रत्येक पंक्ति पर ऊतक कागज की एक पट्टी लागू करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए धीरे-धीरे उंगलियों का उपयोग करें। प्लेट से खाली अतिरिक्त तरल, ढक्कन बंद करें और समय के साथ प्लेट को लेबल करें। विस्तारित इनक्यूबेशन बार के लिए, प्लेटों को वापस विकास कक्ष में रखें।

5. कटाई

  1. प्रत्येक जैविक प्रतिकृति/समय बिंदु/उपचार के लिए प्लेटों को पुनः प्राप्त करें । विभिन्न ऊतक नमूनों के लिए एक स्वच्छ देवर पोत और लेबल ट्यूब (15 या 50 मीटर) में तरल नाइट्रोजन एकत्र करें। स्टायरोफोम धारक तैयार करें।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन हैंडलिंग प्रक्रियाओं (वातारण, ठंढ, संभावित विस्फोट ट्यूबों) से परिचित बनें।
  2. प्लेट खोलें और संदंश के साथ ऊतक कागज को हटा दें, सावधान रहें कि आगर सतह से जड़ों को अलग न करें। एक सर्जिकल ब्लेड के साथ, एक एकल, निर्धारित स्ट्रोक में शूट-रूट-जंक्शन के साथ प्रति पंक्ति एक बार काटें। तीखेपन की गारंटी देने के लिए नमूनों और विनिमय के बीच ब्लेड को बार-बार साफ करें।
  3. चिमटी के साथ, उन्हें तीन बंडलों में इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक पंक्ति की जड़ों के साथ स्वाइप करें। जड़ों को पकड़ो और उन्हें एक 50 mL तरल नाइट्रोजन से भरा ट्यूब में खाली करने के लिए फ्रीज तस्वीर.
    नोट: जड़ों को घने संरचनाओं (गेंदों की तरह) में इकट्ठा करने की कोशिश न करें क्योंकि उन्हें अगले चरण में पीसना मुश्किल है।
  4. उन सभी प्लेटों के साथ आगे बढ़ें जो एक नमूना (इनक्यूबेशन बार के क्रम में) का गठन करते हैं और अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन डालते हैं। जड़ों को बिखरने से रोकने के लिए ट्यूब के ढक्कन का इस्तेमाल करें। इसके बाद ढक्कन बंद कर देवर के बर्तन में सभी ट्यूब इकट्ठा कर लेते हैं। रूट टिश्यू को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. इम्यूनोशुद्धि

नोट: इस कदम का उद्देश्य उच्च गुणवत्ता वाले ट्रैप/पॉलीसम आरएनए प्राप्त करना है । इसलिए, आरएनए हैंडलिंग के लिए अच्छे अभ्यास सलाह का कड़ाई से पालन करें। एक बाँझ बेंच में इस खंड में सभी कदम प्रदर्शन और एक RNase हटाने समाधान(सामग्री की तालिका)के साथ सभी उपकरणों और प्रयोगशालाओं साफ । दस्ताने पहनें और उन्हें तुरंत बदलें जब नमूना, बर्फ, या अन्य स्रोतों से दूषित होता है जिन्हें साफ नहीं किया गया है। चूंकि यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण पहलू है, इसलिए अपशिष्ट निपटान सलाह के साथ उपकरणों के पुन: उपयोग पर एक वर्ग शामिल है।

  1. बफर तैयारी
    1. टेबल 1 और ऑटोक्लेव (ए) या फिल्टर स्टरलाइज () के अनुसार स्टॉक समाधान तैयार करें। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट नहीं किया जाता है, सॉल्वेंट RNase-मुक्त पानी है।
    2. टेबल 1 में इंगित किए गए अपने संबंधित सॉल्वैंट्स में डिथिओथ्रिटॉल (डीटीटी), फिनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), साइक्लोहेक्सिमिड (सीएचएक्स) और क्लोरम्फेनिकोल (कैम) को भंग और विवरणी करें। अन्य सभी स्टॉक कमरे के तापमान पर रह सकते हैं।
    3. पूर्व शेयरमिश्रण-धोने बफर (WB) के लिए सामग्री 1-4 और पॉलीसम निष्कर्षण बफर (पीईबी) के लिए 1-6 के साथ-हर निष्कर्षण से पहले समय लेने वाले बफर मिश्रण से बचने के लिए । इस प्रकार, केवल निकासी के दिन पानी और जमे हुए अवयवों (7-10) जोड़ें। प्री-मिक्स्ड स्टॉक और रनौज-फ्री पानी को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: डीटीटी एकाग्रता Zanetti एट अल २००५ से रिपोर्ट एकाग्रता का 1/5 है, के रूप में GFP के साथ naकोई बातचीत उच्च डीटीटी सांद्रता के प्रति संवेदनशील है ।
सामग्री स्टॉक एकाग्रता डब्ल्यूबी के 50 एमसीएल के लिए एल में वॉल्यूम जोड़ें * पीईबी के 50 एमएल के लिए एल में वॉल्यूम जोड़ें *
1 ट्रिस, पीएच 9 एक 2 एम 5 5
2 केसीएल एक 2 एम 5 5
3 ईटीए एक 0.5 मीटर 2.5 2.5
4 एमजीसीएल2 एक 1 एम 1.75 1.75
5 Pte एक 20% (v/v) 0 2.5
6 डिटर्जेंट मिश्रण एक 0 2.5
ट्वीन 20 20% (v/v)
ट्राइटन-एक्स 100 20% (v/v)
बृज-35 20% (w/v)
इगेपाल 20% (v/v)
7 डीटीटी ₳ 0.5 मीटर 0.1 0.1
8 पीएमएसएफ ₳ 0.1 एम (आइसोप्रोपेनॉल) 0.5 0.5
9 साइक्लोहेक्सिमाइड ₳ 25 मिलीग्राम/mL (EtOH) 0.1 0.1
10 क्लोरम्फेनिकोल ₳ 50 मिलीग्राम/mL (EtOH) 0.05 0.05

तालिका 1: बफर संरचना और मिश्रण सलाह। दी गई मात्रा में मिश्रित दिए गए स्टॉक सांद्रता के साथ सामग्री डब्ल्यूबी या पीईबी के 50 मिलीएल की उपज करती है। ट्रिस: ट्रिस-(हाइड्रोक्सीमेथिल) - अमीनोमीथेन, ईटीए: एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (एन,एन',एन-टेट्रा-एसेटिक एसिड, पीटीई: पॉलीऑक्सीथीलीन-(10) - ट्राइडेकिल ईथर, ए: ऑटोक्लेव, : फिल्टर-स्टरलाइज; * RNase मुक्त पानी के साथ 50 mL तक भरें।

  1. ऊतक समरूपता/पीस
    1. अपकेंद्रित्र को ठंडा करें और बर्फ पर समरूपता और अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें। डीटीटी, पीएमएसएफ, सीएचएक्स और कैम के गल एलिकोट्स । दिन (नमूनों के#) की आवश्यकताओं के अनुसार 50 मिलील ट्यूबों में स्टॉक समाधान से पीईबी और डब्ल्यूबी मिलाएं और बर्फ पर ठंडा करें।
      नोट: उपयोग से कुछ ही समय पहले पीएमएसएफ जोड़ें, क्योंकि पानी में पीएमएसएफ का आधा जीवन केवल 30 मिन है।
    2. एक देवर पोत में तरल नाइट्रोजन के बहुत तैयार है और -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से ऊतक के नमूने पुनः प्राप्त करते हैं। ठंडे मोर्टार से जलने को रोकने के लिए मानक प्रयोगशाला दस्ताने के नीचे सूती दस्ताने पहनें। मोर्टार और पेस्टल में तरल नाइट्रोजन डालो जब तक वे पीसने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त ठंडा कर रहे हैं । मोर्टार (लेबल या एक निश्चित क्रम में रखने) को अलग करने के लिए एक प्रणाली ईजाद करने की सिफारिश की जाती है।
    3. एक मोर्टार में खाली ऊतक नमूना और ध्यान से पीसने जब तक सभी सामग्री एक सफेद पाउडर है । जरूरत पड़ने पर टिश्यू को फ्रोजन रखने या बेहतर पीसने की सुविधा के लिए लिक्विड नाइट्रोजन डालें।
    4. नमूने में पीईबी के 5 मिलील जोड़ें और बफर फ्रीज होने से पहले पाउडर के साथ जल्दी से मिलाएं। जबकि यह नमूना गल (समय-समय पर मिश्रण) एक और नमूना प्रक्रिया।
    5. जैसे ही मिश्रण को स्थानांतरित किया जा सकता है, घोल को ग्लास होमोजेनेज़र में खाली करें और बर्फ पर रखें। पीईबी के अतिरिक्त 2 मिलील के साथ, मोर्टार और मूसल को कुल्ला करें और इसे समरूपमें नमूने में जोड़ें।
      नोट: पूरी तरह से तरल नमूने से बचें क्योंकि यह आरएनए क्षरण की अनुमति देता है।
    6. घोल को मैन्युअल रूप से तब तक पीसलें जब तक कि निकालने का समरूप न हो जाए। हम कम से कम 4 से 5 डालता है।
      नोट: यह कुछ अतिरिक्त प्रतीक्षा समय के लिए घोल आगे गल करने की अनुमति की आवश्यकता हो सकती है । समरूपों की हैंडलिंग के लिए कुछ परिश्रम की आवश्यकता होती है। जानवर बल लागू न करें और सक्शन बलों से सावधान रहें। यदि ध्यान में नहीं रखा जाता है, तो इससे होमोजेनेर का बिखराव, संदूषण या विनाश होगा।
    7. क्रूड रूट निकालने को 50 मीटर सेंट्रलाइज ट्यूब (बर्फ पर रखें) में डालें।
      नोट: आमतौर पर कई नमूने हस्तांतरण से पहले जमीन हो सकते हैं। पीसने, स्थानांतरित करने और समरूपता की समानांतर हैंडलिंग की आवश्यकता है। जल्दी से काम करने की कोशिश करो, लेकिन जल्दी नहीं है; शांत रहें। बर्फ पर हमेशा समरूप नमूने रखें।
  2. कुल आरएनए नमूना संग्रह
    1. प्रत्येक कच्चे तेल के नमूने के 200 माइक्रोनल एलिकोज़ को एक साफ माइक्रोसेंटिफ्यूज ट्यूब (बर्फ पर पहले से लेबल और ठंडा) में स्थानांतरित करें।
    2. 7.1 और 7.2 अंक में जाल नमूनों के लिए विस्तृत के रूप में आरएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें। ये कदम करें जबकि सैंपल सेंट्रलाइज में क्लियर हो रहे हैं।
    3. डीएनए संदूषण को खत्म करने और वाणिज्यिक किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके प्रतिक्रिया को साफ करने के लिए पुनः निलंबित कुल आरएनए के साथ एक DNase उपचार करें।
      नोट: कुल आरएनए निष्कर्षण आमतौर पर उच्च सांद्रता उपज और नमूनों को काफी पतला करने की जरूरत है । हम संवेदनशील Qubit प्रोटोकॉल द्वारा कमजोर पड़ने के बाद एकाग्रता को मापने की सलाह देते हैं।
  3. क्रूड निकालने को साफ करना
    1. 6.2.7 से नमूनों के साथ आइस बाल्टी लें और उन्हें 15 किमी के लिए 16,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें।
      नोट: अपकेंद्रित्र को संतुलित करने के लिए, तदनुसार नमूने जोड़े। यदि यह पूरी तरह से संभव नहीं है, तो पीईबी जोड़कर एक नमूने को समायोजित करें।
    2. एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब (पहले से बर्फ पर ठंडा) और दोहराने अपकेंद्रित्र (16,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 min) के लिए supernatant डालो । यह स्थानांतरण जल्दी से अपकेंद्रित्र के बगल में किया जा सकता है।
    3. जबकि क्रूड निकालने समाशोधन है, 6.6 कदम के लिए GFP-मोतियों की धुलाई शुरू करें।
      नोट: शेखर पर कमाल के लिए इस बर्फ बाल्टी रखें, लेकिन बाँझ बेंच में वापस जगह नहीं है के रूप में यह दूषित हो सकता है ।
  4. बीड वॉश
    1. अलीकोट चुंबकीय जीएफपी-मोतियों (#samples x 60 माइक्रोन, टेबल ऑफ मैटेरियल)को 1.5 एमएल ट्यूब में उद्धृत करें। चुंबकीय स्टैंड पर रखें। एक बार मोतियों को एकत्र करने के बाद, अधिनेता को हटा दें।
    2. ठंड पश्चिम पश्चिम पश्चिम की 1 मिलीएल जोड़ें, मोतियों को फिर से निलंबित करें और उन्हें फिर से इकट्ठा करें। वॉश बफर को त्यागें और डब्ल्यूबी के 1 mL के साथ एक बार और दोहराएं।
    3. अंततः, पश्चिम पश्चिम पश्चिम में मोतियों को चरण 6.5.1 में उपयोग की जाने वाली प्रारंभिक मात्रा में फिर से निलंबित करें।
  5. इम्यूनोशुद्धि (आईपी)
    1. केंद्रीकरण के तुरंत बाद, लेबल 15 मिलील ट्यूबों में मंजूरी दे दी अतिशयोक्ति डालना और नमूना प्रति धोया मोती के ६० μL जोड़ें ।
    2. सभी नमूनों को क्षैतिज रूप से आइस बाल्टी में रखें और इसे एक शेखर पर रखें। जीएफपी लेबल वाले पॉलीसोम को मोतियों में बांधने के लिए मिश्रण को 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 15 mL ट्यूब (बर्फ पर) के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मोती ले लीजिए और शेष पीईबी में पीएमएसएफ जोड़ें। अधिस्थान त्यागें। मोतियों के लिए पीईबी के लगभग 5 mL डालो और उन्हें झुकाव द्वारा फिर से निलंबित। धारा 6.6.2 में एक ही सेटअप में 15 मिन के लिए नमूने हिला।
    4. डब्ल्यूबी के साथ वॉश को कुल 3 वॉश (1 एक्स पीईबी, 2 एक्स डब्ल्यूबी) में दोहराएं। प्रत्येक बफर एक्सचेंज से पहले, पीएमएसएफ जोड़ें।
    5. बरूपियों को डब्ल्यूबी के 1 एमएल में एकत्र करें और उन्हें 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। अंत में, चुंबकीय स्टैंड पर एक और समय मोतियों को इकट्ठा करें और सभी तरल को हटा दें। ट्यूब को बंद करें और बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि सभी नमूनों पर कार्रवाई न हो जाए।
    6. आरएनए निष्कर्षण के लिए एक धुएं हुड के लिए नमूनों परिवहन।
  6. अपशिष्ट निपटान और प्रयोगशाला की आपूर्ति की पुनर्कंडीशनिंग।
    1. यदि अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास के अनुसार प्रदर्शन किया जाता है (धारा 2.2.1 देखें), तो नसबंदी प्रक्रिया एक जलीय नैसीएल समाधान पैदा करती है। धुएं के हुड में डिटुमीगेट करने के लिए क्लोरीन गैस के साथ-साथ अवशिष्ट एचसीएल और ब्लीच को छोड़ दें।
    2. पीईबी और डब्ल्यूबी निपटान: चूंकि सीएचएक्स उच्च पीएच पर विघटित हो जाता है, सभी तरल पदार्थ एकत्र करते हैं और पीएचएंडजीटी 9 पर लाते हैं। हैलोजनयुक्त रासायनिक कचरे में तरल कचरे का निपटान करें। सभी ठोस (ऊतक, सीरोलॉजिकल पिपेट, दस्ताने, आदि) को रासायनिक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए।
    3. फिनॉल युक्त तरल पदार्थ अलग से इकट्ठा करें, साथ ही फिनॉल-दूषित सामग्री (युक्तियां, ट्यूब और दस्ताने)।
    4. साबुन के साथ हैंड-वॉश मोर्टार, पेस्टल और समरूपता (स्पंज और ब्रश) और अच्छी तरह से कुल्ला। बाद में, सामग्री को रात भर 220 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें। या तो उपचार से पहले टिन पन्नी में लपेटें या गर्मी प्रूफ, कवर कंटेनर में रखें।
    5. डिटर्जेंट के साथ साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब ब्रश करें और फिर फ्यूम हुड में डायथिलपिरोकार्बोनेट (डीईपीसी) का इलाज करें। इस उद्देश्य के लिए, डिओनाइज्ड पानी (डीईपीसी के 1 एमएल को एच2ओ के 1 एल) में तरल डीपीसी जोड़ें और मिलाते हुए मिलाएं। एक ऑटोक्लेवेबल ट्रे पर अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें जो गिरा हुआ डीपीसी-पानी पकड़ता है। निलंबन को ट्यूबों में डालें और 3 घंटे या रात भर के लिए छोड़ दें। डीपीसी बाद की ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया में विघटित हो जाती है।
      सावधानी: DEPC अत्यधिक विषाक्त है ।

7. आरएनए निष्कर्षण और QC

  1. आरएनए निष्कर्षण
    1. टेबलटॉप अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    2. प्रत्येक नमूने में एसिड-ग्वानिडिनियम-फिनॉल-आधारित रिएजेंट(सामग्री की तालिका)का 1 एमएल जोड़ें, बर्फ पर 5 मिन के लिए मोतियों या कुल आरएनए घोल और इनक्यूबेट को फिर से निलंबित करने के लिए उलटा। भंवर मत करो!
    3. बर्फ पर 3 मिन के लिए क्लोरोफॉर्म और इनक्यूबेट के 200 माइक्रोन जोड़ें। फिर नमूनों को अच्छी तरह से भंवर।
    4. चरण जुदाई सहायता करने के लिए, अधिकतम पर अपकेंद्री । 10-15 मिन, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए गति।
    5. लेबल 1.5 mL कम प्रतिधारण ट्यूब(सामग्री की तालिका)और प्रत्येक में आइसोप्रोपेनॉल के 650 माइक्रोन का एलिकोट।
    6. ध्यान से ऊपरी जलीय चरण (सीए 650 μL) लें और आइसोप्रोपेनॉल के साथ तैयार ट्यूबों में स्थानांतरित करें। गुलाबी कार्बनिक चरण को छूने से बचें।
    7. -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आरएनए उपजी।
      नोट: नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर आइसोप्रोपेनॉल में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है और जरूरत पड़ने पर केवल पानी में घुलनशीलता होता है। जलीय आरएनए सप्ताह/महीनों तक संग्रहीत होने पर -80 डिग्री सेल्सियस पर भी कम हो जाता है।
  2. आरएनए वर्षा
    1. टेबलटॉप अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    2. RNase मुक्त पानी के साथ ताजा 80% EtOH तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा (5 मिन पर -80 डिग्री सेल्सियस प्रक्रिया को गति देने के लिए मदद) ।
    3. 30 मिन के लिए अधिकतम गति (सीए 13,000 x ग्राम)पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेटेंट को त्यागें। गोली दिखाई नहीं देगी, इसलिए ध्यान से पिपेट करें जैसे कि यह वहां था। ठंड के 1 मिलीएल 80% EtOH जोड़ें और ट्यूब एक या दो बार उलटा।
    4. अधिकतम गति से 30 मिन के लिए फिर से अपकेंद्रित्र और दो वॉश की कुल करने के लिए धोने दोहराना ।
    5. 2 मिन के लिए नीचे स्पिन और एक 10 μL टिप के साथ सभी अवशिष्ट EtOH हटा दें । कमरे के तापमान पर 3-5 मिन (अधिक नहीं) के लिए सूखने के लिए पैलेट छोड़ दें और 20 μL RNase-मुक्त पानी में फिर से निलंबित करें।
    6. नमूनों को बर्फ पर रखें और जितनी जल्दी हो सके गुणवत्ता नियंत्रण करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें। फ्रीज-गल चक्र से बचें।
  3. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार समर्पित उपकरण(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण।

8. लाइब्रेरी की तैयारी

  1. SMARTer v4 अल्ट्रा कम इनपुट आरएनए किट के साथ सीडीएनए संश्लेषण और प्रवर्धन
    1. प्रत्येक नमूने के कमजोर पड़ने की गणना करें 4.75 माइक्रोन की मात्रा में ट्रैप-आरएनए या कुल आरएनए के 1.5 एनजी हों। RNase-मुक्त पानी के ताजा एलिकोट्स के साथ पीसीआर-ट्यूब और पतला नमूनों में सभी प्रतिक्रियाओं को करें।
    2. 1/2 प्रतिक्रिया संस्करणों के साथ निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सभी चरणों का प्रदर्शन करें। सीडीएनए को 12-13 पीसीआर साइकिलों से बढ़ाना।
    3. 10x लिसिस बफर के 0.5 माइक्रोन और एसपीआई मोतियों के 25 माइक्रोन(टेबल ऑफ मैटेरियल)जोड़कर पीसीआर को साफ करें। यदि कई नमूनों पर कार्रवाई की जाती है तो लिस बफर और मोतियों को प्री-मिक्स किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि मोती पाइपिंग से पहले समान रूप से फैलाया जाता है।
    4. पूर्ण प्रतिक्रिया मात्रा (एल्यूटियन बफर के 17 माइक्रोन) में प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें। मोतियों को 3 मिनट से ज्यादा सूखने न दें। सूखे नमूनों को संभावित रूप से लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार बचाया जा सकता है।
    5. क्वाबिट एचएस डीएनए किट के साथ नमूना सांद्रता को मापें।
      नोट: SMARTer v4 किट २०० स्नातकोत्तर इनपुट करने के लिए नीचे बर्दाश्त कर सकते हैं । हमने उन मामलों में पुस्तकालय प्राप्त किए जहां क्वाबिट मूल्यों का निर्धारण 16 साइकिल पीसीआर के साथ (250 स्नातकोत्तर, डिटेक्शन लिमिट से नीचे) नहीं किया जा सकता था। हालांकि, सीमित इनपुट सामग्री भी कम जटिल पुस्तकालयों उपज हो सकता है ।
  2. नेक्स्टेरा एक्सटी डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट के साथ विखंडन और एडाप्टर लिगेशन पीसीआर
    1. पीसीआर-ट्यूब में 200 पीजी/माइक्रोन और पिपेट 1.25 माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए RNase-मुक्त पानी के साथ सीडीएनए को पतला करें।
    2. 1/4 प्रतिक्रिया की मात्रा के साथ निर्माता के अनुसार सभी चरणों का प्रदर्शन करें। सीडीएनए को 12 पीसीआर चक्रों और एक अनुक्रमण पूल से संबंधित नमूनों के लिए संगत एडाप्टर के साथ बढ़ाना। इलुमिना के इंडेक्स किट ए और डी अप अप के साथ ३८४ नमूनों को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है ।
    3. पीसीआर क्लीन अप के लिए रिस्पेंशन बफर के 12.5 माइक्रोन और एसपीआई मोतियों के 22.5 माइक्रोन (0.9x अनुपात) जोड़ें। एल्यूटन बफर के 22 माइक्रोन के साथ नमूना elute।
      नोट: क्यूसी और पूलिंग अनुक्रमण कंपनी(सामग्री की तालिका)द्वारा किया गया था और इस प्रकार कोई माड आधारित सामान्यीकरण की जरूरत नहीं थी । एंजाइमैटिक विखंडन प्रतिक्रिया (टैगमेंटेशन) सामग्री इनपुट के प्रति बहुत संवेदनशील है क्योंकि हर एंजाइम केवल एक बार कटौती करता है। इसलिए एकाग्रता की सिफारिश से अधिक न करें।

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Representative Results

गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए, उपर्युक्त प्रक्रिया की जांच कई मध्यवर्ती चरणों में की जानी चाहिए: प्लांटा में अभिव्यक्ति पैटर्न सत्यापन, अलग-थलग पॉलीसोमल आरएनए के गुणवत्ता नियंत्रण के साथ-साथ अंतिम पुस्तकालयों का। ज्ञात मार्कर जीन का उपयोग कर क्यूआरटी-पीसीआर, इसके अलावा, उपचार की स्थिति के जवाब की पुष्टि करने के लिए या प्रयोगात्मक स्थितियों को ठीक करने के लिए किया जा सकता है।

जीएफपी सिग्नल वितरण का कॉन्फोकल विश्लेषण
एंडोडरमल और एक्सपीपी अभिव्यक्ति पैटर्न दोनों की जांच करने के लिए, हमने पीकेटीपी की होमोज़िगौस लाइनों का विश्लेषण किया::GFP-RPL18 और pXPP:: GFP-RPL18 confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा। चित्रा 2ए और फिगर 2बी जीएफपी सिग्नल (ग्रीन) के साथ प्रतिनिधि पौधों को दिखाते हैं जिन्हें सेल दीवारों की रूपरेखा तैयार करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (मजेंटा) के साथ प्रतिदागित किया गया है। चित्रा 2A1 में क्रॉस-सेक्शन बाहर से तीसरी सेल परत में एक गाढ़ा अंगूठी दिखाता है, जो एंडोडरमिस से मेल खाती है। एंडोडरमल जीएफपी सिग्नल मेरिस्टेमेटिक जोन(चित्रा 2ए 2)के ऊपर शीघ्र ही शुरू होता है और साइटोसोल में और कोशिकाओं के नाभिक के आसपास दिखाई देता है, जो राइबोसोम्स से मेल खाता है। इसके विपरीत, एक्सपीपी लाइन दो अलग-अलग ध्रुवों को प्रदर्शित करती है, जो एक्सपीपी(चित्रा 2बी 1)से मेल खाती है। प्रत्येक ध्रुव पर लगभग तीन कोशिकाएं एक GFP संकेत प्रदर्शित करने के लिए मेरिस्टेमेटिक क्षेत्र के ऊपर शुरू होती हैं। इस प्रकार, दोनों लाइनें क्रमशः एंडोडरमिस और एक्सपीपी के स्थानीयकरण पैटर्न का अनुपालन करती हैं(चित्रा 2सी)53।

पॉलीसम आरएनए सत्यापन
प्राप्त पॉलीसम आरएनए की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए हमने दो स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम(टेबल ऑफ मैटेरियल)का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण मापन किया जो μL इनपुट मात्रा के साथ काम करते हैं और आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएएन)54की गणना भी करते हैं। मालिकाना एल्गोरिदम प्रत्येक इलेक्ट्रोप्रोग्राम के लिए 1 और 10 के बीच एक आरआईन मूल्य प्रदान करता है और आरएनए गुणवत्ता (यानी, क्षरण) के लिए एक मजबूत और प्रजनन योग्य उपाय है - जितना कम मूल्य अधिक अवक्रमित नमूना है। चित्रा 3 पॉलीकुछ आरएनए से प्राप्त मापों के उदाहरण दिखाता है। अधिकांश नमूनों में 9-10 से लेकर आरआईआर मूल्यों के साथ शायद ही कोई स्पष्ट क्षरण दिखाई देता है, जो पिछली रिपोर्ट55,,56 केअनुसार है। किसी भी अनुचित हैंडलिंग, लंबे समय तक ऊंचा तापमान (जैसे, कमरे के तापमान) या RNase संदूषण की विशेष अवधि इस स्तर पर स्पष्ट हो जाएगा । दोनों उपकरण अपने इलेक्ट्रोहीरोग्राम(चित्रा 3ए)से नमूना सांद्रता की गणना भी करते हैं। ये काफी भिन्न हो सकते हैं और ज्यादातर कम पहचान सीमा पर हैं। इसलिए, हम सांद्रता की सटीक मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लोरोमेट्रिक माप का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

लाइब्रेरी क्यूसी
चूंकि अधिकांश प्रयोगशालाएं घर में आरएनए अनुक्रमण नहीं करती हैं, इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण अक्सर उच्च थ्रूपुट उपकरणों(सामग्री की तालिका)के साथ विशेष सुविधाओं पर चलाए जाते हैं। वे नियमित रूप से गुणवत्ता का आकलन करते हैं और क्यूपीसीआर और फ्लोरोमेट्रिक परख(सामग्री की तालिका)द्वारा सांद्रता की मात्रा निर्धारित करते हैं क्योंकि पुस्तकालय पूलिंग के लिए सटीक माप न हो। फिर भी, यदि पुस्तकालय की तैयारी आउटसोर्स नहीं की जाती है, तो कोई विशेष उपकरण(सामग्री की तालिका)के साथ परिणाम का नमूना ले सकता है। चित्रा 4 हमारे अनुशंसित प्रोटोकॉल (ए) के साथ सफलतापूर्वक तैयार पुस्तकालयों के निशान दिखाता है और स्केल्ड-डाउन रिएक्शन वॉल्यूम (बी) के बावजूद प्रक्रिया की मजबूती पर प्रकाश डालता है। भाग सी घटिया नमूनों कि अधिक/underfragmentation, सफाई या असफल एडाप्टर हटाने के दौरान सामग्री हानि से परिणाम कर सकते है दिखाता है । बाद के मामले में, एक और अधिक कठोर नमूना-bead अनुपात के साथ साफ संदूषण को खत्म करने में मदद कर सकता है । पूरी तरह से विफल नमूने हमारे हाथों में अत्यंत दुर्लभ थे और कई बिंदुओं पर उत्पन्न हो सकते थे (उदाहरण के लिए, स्टोचिओमेट्रिक टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया के लिए बहुत अधिक इनपुट)।

अनुक्रमित पुस्तकालयों के प्रदर्शन हमारे उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में एंडोडरमिस से नमूनों के लिए चित्रा 4डी में उदाहरण है । WT और/या pericycle से पुस्तकालयों समान या भी बेहतर प्रदर्शन करते हैं । रिबोसोमल पढ़ता है औसत न पर 2% के आसपास थे 3% से ऊपर केवल कुछ नमूने के साथ । 30 से ऊपर एक औसत गुणवत्ता स्कोर के साथ पढ़ता है लगातार 90% से ऊपर पहले से ही फ़िल्टरिंग से ऊपर थे. अनुक्रमित पढ़ता है की मानचित्रण क्षमता समान रूप से ८५% पर औसत पर लेकर उच्च था । जैविक प्रतिकृतियों के बीच सहसंबंध निर्धारित करने के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए युग्मित स्पीयरमैन गुणांक की गणना की गई थी। सभी परीक्षणों के परिणामस्वरूप उच्च गुणांक मूल्य हुए।

उपचार प्रतिक्रिया और संवर्धन विश्लेषण
जीनोम-फैले डेटासेट का उत्पादन करने से पहले, एक पायलट प्रयोग से ट्रैप आरएनए की जांच क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा उपचार की सफलता और/या प्रायोगिक स्थितियों को मान्य करने के लिए की जा सकती है । हमने XPP नमूनों(चित्रा 5ए)में उपचार के 2 घंटे के बाद ऑक्सिन प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस प्रकार के विश्लेषण का प्रदर्शन किया। तीन अलग-अलग ऑक्सिन-उत्तरदायी जीन (GH3.3, LBD29 और GATA23) का परीक्षण किया गया था।57 इनक्यूबेशन अवधि के बाद तीनों मामलों में बहुत मजबूत प्रेरण देखा गया, जिससे पता चलता है कि एक्सोजेनस एनएए आवेदन सफल रहा ।

यदि नव विकसित प्रमोटरों का उपयोग किया जाता है तो इस बिंदु पर भी क्यूआरटी-पीसीआर के साथ संवर्धन विश्लेषण करना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, एक ज्ञात मार्कर जीन (यानी, प्रवर्तक द्वारा संचालित जीन) ट्रैप में परिलक्षित होता है और कुल आरएनए नमूना और अभिव्यक्ति के स्तर को कुल आरएनए स्तर तक सामान्यीकृत किया जाता है। यदि विशिष्ट ऊतक से ट्रैप आरएनए का अलगाव सफल रहा था तो एक महत्वपूर्ण गुना परिवर्तन वृद्धि प्राप्त की जानी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, अनुक्रमण डेटा से समकक्ष जानकारी प्राप्त की जा सकती है (चित्रा 5बीदेखें)। दो सॉबिन से संबंधित जीन, GPAT5 और HORST की अभिव्यक्ति, सभी एंडोडरमिस नमूनों में मौजूद है और विशेष रूप से XPP ऊतकों से अनुपस्थित है । इसके विपरीत, पेरिसाइकिल-व्यक्त जीन (PHO1 और SKOR) केवल बहुत नीच एंडोडरमिस में व्यक्त किए जाते हैं और जांच की गई समय सीमा पर ऑक्सिन-प्रेरित डाउन-रेगुलेशन के साथ एक्सपीपी जांच में समृद्ध होते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: अरबीडोप्सिस रूट में जीएफपी-आरपीएल18 की सेल प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति। ए-बी। पीELTPकी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां::GFP-RPL18 (A) और पी XPP::GFP-RPL18 (B) अंकुरण के बाद छह दिनों में जड़ों को व्यक्त ।XPP सेल वॉल रूपरेखा प्रोपिडियम आयोडाइड (मजेंटा) के साथ धुंधला के माध्यम से प्राप्त की गई थी। क्रॉस-सेक्शन A1 और B1 क्रमशः A2 और B2 में धराशायी लाइनों के साथ चिह्नित पदों से हैं । बाद की छवियां रिकॉर्ड किए गए जेड-स्टैक के अधिकतम अनुमानों (अधिकतम) दिखाती हैं। सी. सुदेश (C1) और क्रॉस-सेक्शन (C3) के साथ-साथ पार्श्व रूट प्राइमोर्डियम (C2) में अरबीडोप्सिस जड़ की रचना करने वाले ऊतक प्रकारों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। छवि एफ Bouché से अनुमति के साथ संशोधित किया गया था । स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: जाल/पॉलीकुछ आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन । ए टेपस्टेशन - अपने संबंधित आरआईएनई मूल्यों (ऊपर बाएं) के साथ जेल चित्र प्रतिनिधित्व में 14 मापा नमूनों से प्रतिनिधि परिणाम। इलेक्ट्रोपोग्राम प्रतिनिधित्व नमूना A1 (नीले रंग में हाइलाइट) के लिए दिखाया गया है। सही पर तालिका नमूना सांद्रता के बारे में बताते हैं। B. ए में समान निशान बायोएनालाइजर के साथ प्राप्त किए जाते हैं। सही पर पैनल गिरावट के बढ़ते स्तर के साथ नमूने दिखाते हैं, जो उनके घटते RIN मूल्यों में दर्शाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जाल/पॉलीसम नमूनों से पुस्तकालय प्रोफाइल । A. दो प्रतिनिधि ट्रैप नमूने (बाएं) नेक्स्टेरा एक्सटी उपयोगकर्ता गाइड द्वारा अनुशंसित सफल पुस्तकालयों के निशान के साथ बहुत अच्छी तरह से मेल खाती हैं। B. अलग प्रतिक्रिया की मात्रा मजबूत पुस्तकालय तैयारी परिणाम उपज । उप-इष्टतम परिणामों वाले सी पुस्तकालय: बहुत छोटे टुकड़े (ऊपर बाएं), बेहद लंबे टुकड़े (नीचे बाएं), कम एकाग्रता (ऊपर दाएं) या पूर्ण असफल (नीचे दाएं)। नोट भी अवशिष्ट छोटे टुकड़े (नीले अंडाकार), कि अनुक्रमण से पहले हटा दिया जाना है । बायोएनालाइजर: लाल निशान, लैबचिप: नीले निशान। डी अनुक्रमित ट्रैप नमूनों के लिए चयनित गुणवत्ता उपाय (हमारे पार्श्व रूट मुक्त उत्परिवर्ती के एंडोडरमिस) विभिन्न समय बिंदुओं पर और एक समय बिंदु (एन = 65) के भीतर सभी नमूनों की जोड़ीव तुलना के बीच गणना स्पीयरमैन सहसंबंध गुणांक के वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: क्यूआरटी-पीसीआर और आरएनए-सीक्यू क्रमशः ऑक्सिन-रिस्पॉन्सिवनेस और टिश्यू टाइप एनरिचमेंट दिखाते हैं। A. क्यूआरटी-पीसीआर के माध्यम से 2 घंटे के ऑक्सिन उपचार के बाद तीन ज्ञात ऑक्सिन-उत्तरदायी जीन के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन किया गया था। सभी नमूनों में मजबूत प्रेरण देखा गया। आरटी-पीसीआर 3 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति पर प्रदर्शन किया गया था और आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में UBC21 के साथ गैर इलाज नमूनों को सामान्यीकृत किया गया था । त्रुटि सलाखों के एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं । GH3.3: ग्रेटचेन हेगन ३.३, LDB29: पार्श्व सीमा डोमेन 29, GATA23: GATA-आकृति बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक 23, UBC21: UBIQUITIN-CONJUGATING एंजाइम 21 बी । ट्रैप-सीक्यू डेटासेट से चार मार्कर जीन का अभिव्यक्ति स्तर। बाईं ओर नमूने एंडोडरमिस-व्युत्पन्न (हरे रंग) होते हैं, जबकि दाईं ओर के नमूने एक्सपीपी-व्युत्पन्न (नीले रंग) होते हैं। संख्या घंटे में अंतराल इनक्यूबेशन ऑक्सिन का प्रतिनिधित्व करते हैं। नकारात्मक जेड स्कोर कम अभिव्यक्ति के स्तर को प्रतिबिंबित और इसके विपरीत। एंडोडर्मल मार्कर जीन(GPAT5, HORST)एंडोडरमिस नमूनों में उच्च स्तर के साथ अलग ढंग से व्यक्त कर रहे हैं । इसके विपरीत, पेरिसाइकिल मार्कर(PHO1, SKOR)में XPP कोशिकाओं में उच्च अभिव्यक्ति का स्तर होता है और ऑक्सिन उपचार पर डाउन-रेगुलेशन दिखाता है। GPAT5: ग्लाइसेरोल-3-फॉस्फेट 2-ओ-एसिलट्रांसफरास (सुबेरिन बायोसिंथसिस), हॉर्स्ट: रूट सुबेरीकृत ऊतक का हाइड्रोक्सीलेस, PHO1: फॉस्फेट 1, SKOR: स्टेलर K+ जावक सुधारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: गैर-संविलियन pUBQ10::GFP-RPL18 स्थानीयकरण पैटर्न। छह दिन पुरानी रोपण की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी । सेल वॉल रूपरेखा प्रोपिडियम आयोडाइड (मजेंटा) के साथ धुंधला के माध्यम से प्राप्त की गई थी। क्रॉस-सेक्शन A2 और C1 क्रमशः A3 और C2 में धराशायी लाइनों के साथ चिह्नित पदों से हैं । छवियों के रूप में चिह्नित मैक्स रिकॉर्ड जेड-स्टैक के अधिकतम अनुमानों को दिखाते हैं। A1-A3। UBQ10-संचालितनिर्माण के समान स्थानीयकरण पैटर्न। B1-C2। बाहरी ऊतक परतों में सिग्नल की ताकत में उल्लेखनीय कमी। ए, बी और सी तीन अलग-अलग पौधों में दर्ज हैं। स्केल बार: 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आरपीएल18 स्थानीयकरण पैटर्न का सत्यापन
किसी भी ट्रैप प्रयोग से डेटा की गलत व्याख्या से बचने के लिए महत्वपूर्ण टैग राइबोसोमल उपइकाई का उचित अभिव्यक्ति पैटर्न है। इसलिए, आरपीएल18 के लिए एक एपिटोप टैग के रूप में जीएफपी का समावेश वांछित अभिव्यक्ति पैटर्न के सत्यापन की अनुमति देता है और लगातार, एक ही ऊतक से पॉलीसम अंश का पुलडाउन। उचित प्रमोटर पैटर्न को आश्वस्त करने के लिए अधिक आक्रामक दृष्टिकोण जियाओ और मेयरोविट्ज 2010 द्वारा पीछा किया जाता है, जिसके लिए गस-धुंधला और तियान एट अल में इसकी आवश्यकता होती है। 2019 जो एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी58,,59के साथ इम्यूनोस्टेनिंग पर निर्भर करता है।

हम दृढ़ता से प्रत्येक पीढ़ी में स्थानीयकरण पैटर्न की जांच करने की सलाह देते हैं क्योंकि टी-डीएनए ट्रांसजेनिक लाइनें मुंह से बाहर होने की संभावना हो सकती हैं और इस प्रकार संकेत शक्ति खराब हो सकती है या बीज ों को व्यक्त करने का अनुपात कम हो जाता है। निर्माण में शामिल जीएफपी-टैग के साथ, इन लगातार नियंत्रणों को माइक्रोस्कोपी के माध्यम से आसानी से किया जाता है।

हालांकि, यहां तक कि पूरी तरह से कॉन्फोकल विश्लेषण कुछ उदाहरणों में झूठे निष्कर्षों का कारण बन सकता है। हम एक नियंत्रण जाल लाइन का उत्पादन करने के लिए हमारे असफल प्रयास के साथ इस पर प्रकाश डाला करना चाहते हैं । अब तक, संयंत्र विज्ञान समुदाय सभी सेल परतों में एक समान RPL18 वितरण के साथ एक संयंत्र लाइन बनाने में सक्षम नहीं है । यहां तक कि शुरू में नियोजित 35S प्रमोटर को केवल गैर-समान स्थानीयकरण पैटर्न10के साथ "निकट संविलियन" वितरण दिखाने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। हमारा दृष्टिकोण जीएफपी-आरपीएल18 निर्माण को चलाने के लिए यूबीओटिन10 (UBQ10)के प्रमोटर का उपयोग करना था। T1 पीढ़ी में स्क्रीनिंग बहुत आशाजनक स्थानीयकरण की पेशकश की और इस तरह के लिए प्रचारित किया जा चुना गया था(चित्र6ए)। हालांकि, एक परीक्षण अनुक्रमण रन के डेटा ELTPके बीच तुलना में संवर्धन नहीं दिखा था-और UBQ10-ज्ञातएंडोडरमिस विशिष्ट जीन के लिए लाइनों संचालित । उन पौधों के करीब निरीक्षण पर, वास्तव में हमें बाहरी ऊतक परतों में संकेत में कमी मिली जबकि स्टेले ऊतक ने मजबूत अभिव्यक्ति दिखाई(चित्र6बी)। भविष्य के अध्ययनों को अधिक उपयुक्त उम्मीदवारों के लिए प्रमोटर परिदृश्य खोजना चाहिए और ट्रैप विधि का पूरक होना चाहिए।

नियंत्रण नमूने के रूप में कुल आरएनए
एक बेहतर ट्रैप नियंत्रण रेखा की स्थापना अभी भी लंबित है और इसक्षेत्र द्वारा अत्यधिक प्रत्याशित होगी । इस बात को ध्यान में रखते हुए, अब तक mRNAs के ऊतक-व्यापी समान वितरण प्राप्त करने का एकमात्र तरीका कुल आरएनए एकत्र करना है। जैसा कि, इस मामले में, एक ट्रांसक्रिटोम का नमूना लिया जाता है, इसे आगे बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण में जिम्मेदार होने की आवश्यकता है। विशेष रूप से, कुल आरएनए और पॉलीसम आरएनए अंश दोनों अब सहसंबद्ध हैं क्योंकि वे एक ही ऊतक नमूने से उत्पन्न होते हैं।

एक जाल पुस्तकालय तैयार करने की विधि के लिए खोज में
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ट्रैप दृष्टिकोण की एक बड़ी खामी अलग-अलग और ज्यादातर कम पैदावार है जिसे प्राप्त किया जा सकता है। कुछ एनजी से लेकर कभी-कभी 100 एनजी तक के नमूनों के साथ इलुमिना ट्रूसेक किट (100 एनजी इनपुट आवश्यकता) के साथ एक मानक दृष्टिकोण पर्याप्त गुणवत्ता के पुस्तकालयों के निर्माण के लिए भी असंवेदनशील के रूप में आंका गया था। एक बाजार खोज कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय तैयारकरने किट, कि 5-10 एनजी शुरू सामग्री के रूप में के रूप में कम के साथ काम करने के लिए निर्दिष्ट किया गया पता चला । हमने रेनोसो एट अल 2019 द्वारा उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का परीक्षण नहीं किया, जो टमाटर, चावल और मेडिगो से उनके ट्रैप नमूनों के लिए काम करता है और बीआरडी-सीक्यू दृष्टिकोण60का उपयोग करता है।

हालांकि, बाद के परीक्षण अनुक्रमण के साथ हमारे सभी परीक्षणों से असंतोषजनक परिणाम सामने आए । पॉलीए-संवर्धन चरणों के उपयोग के बावजूद, ट्रैप नमूने उच्च राइबोसोमल संदूषण (पढ़ता है के 30% तक) से पीड़ित थे। इसके अलावा, पुस्तकालय तैयार करने के लिए सफलता की दर परिवर्तनीय और गंभीर रूप से कम सांद्रता या अपेक्षाकृत कम आरआईएन मूल्यों के साथ नमूनों के लिए विशेष रूप से कम थी। हमारा व्यापक परीक्षण हमें निष्कर्ष पर ले जाता है, कि एक ट्रैप नमूने की विशिष्ट आरएनए संरचना, बहुत उच्च rRNA सामग्री और संभवतः मिनट mRNA सांद्रता के साथ, विश्वसनीय पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए अधिक संवेदनशील दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हमने अल्ट्रा-कम इनपुट राशि के लिए अत्याधुनिक समाधानों की ओर रुख किया: स्मार्टर v4 और Nextera XT। आश्वस्त, गीत एट अल भी अपने प्रतिस्पर्धियों को मात देने के लिए इस पुस्तकालय की तैयारी दृष्टिकोण पाया जब वे कई तरीकों और TRAPed जिगर ऊतक६१पर उनके अनुक्रमण उत्पादन का परीक्षण किया । हमने फिगर 4डी में जो क्वालिटी मेट्रिक्स पेश किए हैं, वे कम आरआरएनए-मैपिंग दरों (<3%) उच्च जीन मानचित्रण दरों के साथ समवर्ती। इसके अतिरिक्त, लगातार उच्च स्पीयरमैन सहसंबंध गुणांक बताते हैं कि प्रतिकृति में वास्तव में बहुत समान अभिव्यक्ति प्रोफाइल हैं। दोनों किट का उपयोग मामूली चक्र संख्या के साथ सीधा था और मजबूत और विश्वसनीय परिणाम मिले । अनुक्रमण डेटा 1.5 एनजी शुरू सामग्री के साथ उच्च गुणवत्ता के थे। स्मार्टर किट के साथ 200 पीजी इनपुट के रूप में कम सहन, पौधे शुरू सामग्री की मात्रा अनुकूलित किया जा सकता है। दुर्लभ सेल प्रकार ों के लिए प्रयोज्यता अंततः पर्याप्त आरएनए अर्जित करने के लिए व्यवहार्यता द्वारा निर्धारित की जाएगी।

ट्रैप पौधे विज्ञान टूलकिट का पूरक है
ट्रैप विधि संयंत्र वैज्ञानिकों३४ के साथ तेजी से लोकप्रिय हो गया है और हमें विश्वास है कि यह कई कारणों के कारण एक मानक तकनीक की स्थिति प्राप्त करेगा ।

ट्रैप प्रोटोकॉल में किसी भी कदम को विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे सेल छंटाई मशीन या एक समर्पित लेजर-कैप्चर माइक्रोस्कोप, जो कई प्रयोगशालाओं के लिए प्रयोगों को करना संभव बनाता है। आज तक, सबसे महंगे कारक पुस्तकालय तैयार करने और डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण हैं। फिर भी, अगली पीढ़ी अनुक्रमण तकनीकों की गतिशील उन्नति और एकल सेल अनुक्रमण के लिए बढ़ती मांग के साथ, हम आशा करते हैं कि लागत में काफी कमी आएगी।

इसके अलावा, पॉलीसम-संबद्ध आरएनए के अलगाव का मतलब है कि जानकारी उन RNAs (अनुवाद) की सक्रिय अनुवाद स्थिति पर इकट्ठा की जाती है। इसलिए, ट्रैप अनुवाद के ऊपर होने वाले सभी नियामक चरणों के आउटपुट को कैप्चर करता है और सेलुलर प्रोटीन संरचना के लिए अधिक प्रत्यक्ष प्रॉक्सी का प्रतिनिधित्व करता है। बेशक, ठप राइबोसोम और ट्रांसलेशनल संशोधन अभी भी मायावी बने हुए हैं और अन्य दृष्टिकोणों (जैसे प्रोटेओमिक्स) द्वारा संबोधित किए जाने की आवश्यकता है।

जैसा कि पहले कहा गया है, एक स्पष्ट लाभ जो ट्रैप में पौधे के संदर्भ में है, वह कोशिकाओं के सीडब्ल्यू संरचनाओं और यांत्रिक गुणों का संरक्षण है। जैसा कि हम केवल जटिल कनेक्शन और नियामक कार्यों को समझना शुरू करते हैं जो CW-और यांत्रिक सिग्नलिंग31,,62के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, इन संरचनाओं को संरक्षित करने वाले दृष्टिकोण कई अलग-अलग विकासात्मक संदर्भों में अधिक महत्वपूर्ण हो जाएंगे।

विशेष रूप से अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रजातियों के लिए, ट्रैप विभिन्न प्रमोटरों के धन से लाभ उठा सकता है, जिसे विशेषता दी गई है। अरबीडोप्सिसमें 19 विभिन्न मार्कर जीन प्रमोटरों30,63का उपयोग करके पूरी जड़ को सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से मैप करना संभव था । प्रत्येक आरएनए-एसईक्यू प्रयोग के साथ, इन चयनों में सुधार किया जाएगा और नए, अधिक विशिष्ट प्रमोटर उठेंगे और सेलुलर संकल्प को परिष्कृत करेंगे।

जाल अतिरिक्त सेल आबादी के लिए कई प्रमोटरों के साथ एक संयोजन उपयोग में लागू होता है जहां कोई मार्कर अभी तक ज्ञात नहीं है। यह रूट एंडोडरमिस में विशेष कोशिकाओं के लिए मामला है। तथाकथित मार्ग कोशिकाओं को सुबेरिन परत के अभाव की विशेषता है जो कोट एंडोडरमिस कोशिकाओं को परिपक्व करते हैं53। उपयुक्त प्रमोटरों का संयोजन और बाद में अलग अभिव्यक्ति प्रोफाइल के सिलिको घटाव में उन क्षेत्रों के लिए समृद्ध होगा जो मार्ग कोशिकाओं को बंदरगाह करते हैं। ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर विश्लेषण तो मार्ग सेल मार्कर जीन की पहचान करने में मदद मिलेगी । हालांकि, क्या जाल तो इस आधार पर दुर्लभ सेल आबादी का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित किया जाना बाकी है ।

इस लेख में, हमने अनुवाद-राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण विधि, इसके फायदे और सीमाओं का विस्तृत विवरण प्रदान किया है, और उसके संभावित अनुप्रयोगों पर प्रकाश डाला है। "omics" अध्ययन के पोर्टफोलियो में, यह एक महत्वपूर्ण जगह पर रह रहे हैं और कई जैविक सवालों के जवाब देने में मदद मिलेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के प्रारंभिक चरण में महत्वपूर्ण विशेषज्ञ सलाह के लिए आनुवंशिक विविधता केंद्र ज्यूरिख के जीन-क्लाउड वालसर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। वर्मीयर लैब में काम को जेएमवी को सम्मानित स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएसएफ) से एसएनएफ प्रोफेसरशिप ग्रांट (PP00P3_157524) और एक आर लैस उपकरण अनुदान (316030_164086) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterilization
bleach, 13% Sigma 71696
beaker VWR 214-1172/74/75
desiccator with porcelaine plate (DURAN) Sigma/Merck Z317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
HCl, 37% Roth 4625.1
Tween 20 Sigma P9416
Plate growth + harvesting
MS salts, basal salt mixture, incl. MES buffer Duchefa M0254
agar plant for cell culture Applichem/Panreac A2111.1000
DMSO Sigma D4540
forcepts Rubis Switzerland 5-SA model
KOH Fluka 60370
micropore/surgical tape 3M 1530-0
NAA Duchefa N0903
petri dishes 120x120 mm Greiner bio-one 688102
scalpel VWR/Swann-Morton 233-5454
tissues, neutral, two-layered any supplier of your choice
Immunoprecipitation
GFP-beads: gtma-100 GFP-Trap_MA Chromotek e.g. gtma-100
Brij-35 Sigma P1254-500G
centrifuge tubes (in accordance with centrifuge) Beckman Coulter 357001
Chloramphenicol Applichem C0378-25G
cotton gloves VWR 113-7355
Cycloheximide, HPLC grade Sigma 01810-1G
DEPC VWR E174 might have long delivery times
DTT Fluka 43815
EGTA Sigma 3054.3
homogenizers DUALL 23 KONTES GLASS CO (via VWR) SCERSP885450-0023 (set) SCERSP885451-0023 pestle only - SCERSP885452-0023 cylinder only; long delivery times
Igepal CA-360 Sigma I3021-100ml
KCl Sigma 60130
MgCl2 hexahydrat Roth 2189.2
mortar and pestle VWR 470148-960 & 470019-978
PMSF Roche 10 837 091 001
Polyoxyethylene-(10)-tridecylether/PTE Sigma P2393-500G
RNase-free water Roth T143.3
RNAZap Thermo Fisher AM9780/AM9782 for cleaning surfaces
Tris, >99.3% Roth AE15.3
Triton X-100 Fluka T8787-250ml
Tween 20 Sigma P9416-100ml
RNA extraction
2-Propanol, p.a. Sigma 33539-1L-GL-R
Chloroform, HPLC grade Scharlau CL02181000
EtOH, p.a. Honeywell 02860-1L
low-retention microcentrifuge tubes, 1.5 ml Eppendorf/Sigma Z666548-250EA LoBind
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy MiniElute Cleanup Kit Qiagen 74204
TRIzol reagent ThermoFisher/Ambion 15596018
Library preparation
15/50 mL Tube Magnetic Separator Abraxis PN 472250
AMPure beads Beckman Coulter A63881
Index Kit A Illumina FC-131-2001
Index Kit D Illumina FC-131-2004
neodymium magnets Amazon/other 6 x 1.5 mm range: N42 (NdFeB)
Nextera XT kit Illumina FC-131-1024/1096 https://emea.support.illumina.com/
PCR strips ThermoScientific AB-0266
SMARTer v4 kit Takara Bioscience 634892 https://www.takarabio.com/
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Tapestation Agilent 4200 Tapestation Instrument specialized equipment for RNA/DNA quality control
Fragment Analyzer Agilent 5400 Fragment Analyzer System specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
LabChip PerkinElmer LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer specialized equipment for RNA/DNA quality control (high throughput)
Qubit 4 Fluorometer ThermoFisher Q33239 specialized equipment for RNA/DNA concentration determination
qRT-PCR
GATA23 Microsynth fwd: AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG;
rev: GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3 Microsynth fwd: CAAACCAATCCT
CCAAATGAC;
rev: ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29 Microsynth fwd: TCTCCAACAACA
GGTTGTGAAT;
rev: AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21 Microsynth fwd: TGCGACTCAGGG
AATCTTCT;
rev: TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR Green Bio-Rad #172-5270
iScript Adv cDNA Kit Bio-Rad #172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, Cellstar Greiner bio-one 188261
Falcon tubes 50 ml, Cellstar Greiner bio-one 210261
filter tips 1 ml Axygen TF-1000-R-S
filter tips 10 µl Axygen TF-10-R-S
filter tips 100 µl Axygen TF-100-R-S
filter tips 20 µl Axygen TF-20-R-S
filter tips 200 µl Axygen TF-200-R-S
microcentrifuge tubes 1.5 ml SARSTEDT 72.690.001
Propidium iodide Sigma P4170-100MG
sequencing company Novogene en.novogene.com

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Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale. J. Vis. Exp. (159), e60919, doi:10.3791/60919 (2020).

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