Summary
Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидковидных биоинков (желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток.
Abstract
Во время экструзио-основанного трехмерного процесса биопечати, жидко-подобные биоинки с низкой вязкостью могут защитить клетки от повреждения мембраны, вызванного стрессом сдвига и улучшить выживание инкапсулированных клеток. Однако быстрое гравитационно-управляемое осадок клеток в резервуаре может привести к неоднородному распределению клеток в биопечатных структурах и, следовательно, затруднить применение жидковидных биоинков. Здесь мы разработали новую многослойную модифицированную стратегию для жидкого биоинка (например, желатиновый метакрилоил с низкой вязкостью) для предотвращения осаждения инкапсулированных клеток. В многослойной биоинкации манипулировали несколькими жидкими интерфейсами, чтобы обеспечить межфрусное удержание. Следовательно, действие осаждения клеток, идущее через соседние слои в многослойной системе, было отложено в биоинковом резервуаре. Было установлено, что межфрагментальное удержание было гораздо выше, чем осадочный притяжение клеток, демонстрируя важную роль межфрагментационного удержания в предотвращении осаждения клеток и содействии более однородной дисперсации клеток в многослойной биомарке.
Introduction
Трехмерная (3D) биопечать была перспективным методом для производства сложных архитектурных и функциональных копий местных тканей в биофабрике и регенеративной медицине1,2,3. Общие стратегии биопечати, в том числе струйной, экструзии и стереолитографии печати, имеют плюсы и минусы с разных точек зрения4. Среди этих методов, экструзионная процедура наиболее часто используется из-за его рентабельности. Биоинк играет ключевую роль в процессе стабильности экструзионной биопечати. Идеальный клеточный биоинков должен быть не только биосовместимым, но и подходит для механических свойств5. Биоинки с низкой вязкостью обычно представлены как жидкое состояние. Эти биоinks могут быть легко и быстро хранение и избежать повреждения клеточной мембраны, вызванной высоким стрессом сдвига во время экструзии. Однако, в сложных случаях, требующих длительных периодов печати, низкая вязкость часто приводит к неизбежной осадки инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре, который обычно приводит к гравитации и приводит к дисперсии inhomogeneous клеток в биоинке6,7. Следовательно, биоинк с дисперсиями inhomogeneous клетки препятствует биопечати в пробирке функциональной конструкции ткани.
Несколько недавних исследований, посвященных биоинксам, сообщили о продвижении однородной дисперсии инкапсулированных клеток. Модифицированный биоинкт альгината на основе двухсценировки двухсценивания использовался для экструзионной биопечати8. Альгинатный полимер был модифицирован с пептидами и белками в этом исследовании. Клетки представили более однородное распределение в этом модифицированном альгинате, чем в широко используемом альгинате из-за участков вложения, предоставляемых пептидами и белками. Кроме того, смешанные биоинки были использованы для решения осаждения клеток в биоинк. В другом исследовании9был использован смешанный биоинк, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ) и желатин или желатиновый метакрилоил (GelMA) с улучшенной механической прочностью. Инкапсулированные клетки представляли однородное распределение главным образом потому, что вязкость смешанного биоинка была улучшена. В целом, существует несколько факторов, влияющих на дисперсию инкапсулированных клеток в биоинке, такие как вязкость биоинка, гравитация клеток, плотность клеток и продолжительность рабочего периода. Среди этих факторов, гравитация клеток играет важную роль в содействии осаждения. Плавучесть и трение, предоставляемые вязкой биоинка были исследованы в качестве основных сил против тяжести на сегодняшний день10.
При этом мы разработали новую стратегию, направленную на содействие однородной дисперсии инкапсулированных клеток в биоинке путем манипулирования несколькими жидкими интерфейсами в биоинковом резервуаре. Эти жидкие интерфейсы, созданные многослойной модификацией биоинка, могут не только обеспечить межфодное удержание, которое замедляет осадок клеток, но и поддерживать подходящую биосовместимость и реологическое поведение биоинка. На практике мы модифицировали aqueous раствор GelMA (5%, w/v) с шелковым фиброном (SF) многослойным способом, чтобы продольно производить четыре интерфейса, обеспечивая межпараленийные напряжения в смешанном биоинке. В результате гравитационная нагрузка на клетки была компенсирована антропогенным межвидовым напряжением, и почти однородная дисперсия инкапсулированных клеток в биоинке была получена из-за меньшего осаждения через соседние слои клеток. До настоящего времени не было зарегистрировано ни одного подобного протокола, чтобы замедлить осаждение инкапсулированных клеток путем манипулирования межфомационным удержанием жидких бионавов. Мы представляем наш протокол здесь, чтобы продемонстрировать новый способ решения осаждения клеток в биопечати.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеточного нагруженных SF-GelMA
- Стериллизовать все материалы с помощью 0,22 м шприц фильтр единиц. Выполните все шаги в кабинете биологической безопасности.
- Теплый 1x PBS до 50 градусов по Цельсию, и растворить желатин в нагретом 1x PBS с перемешиванием. Окончательная концентрация желатина в PBS должна составлять 10% (w/v).
- Добавить метакриковый андирид в раствор желатина (соотношение веса метакрикового андирида до желатина 0,6 к 1) медленно с перемешиванием, и смешать комплекс, по крайней мере 1 ч (50 градусов по Цельсию). Как правило, подготовить 200 мл 10% раствора желатина с 12 г метакрила ангидрид; объем зависит от потребностей исследования.
- Перенесите смешанный раствор, содержащий желатин и метакриковый андилидид, в стерильную трубку 50 мЛ.
- Центрифуга смешанного раствора на 3500 х г. Это обычно занимает 3-5 мин, чтобы получить два слоя. Соберите верхний слой (GelMA) и отбросьте нижний слой (нереактированный метакриловый десидрид).
- Разбавить раствор верхнего слоя, полученный в шаге 1.5, двумя томами деионизированной воды (40–50 градусов по Цельсию).
- Диализ раствор, полученный в шаге 1.6 с 12-14 kDa молекулярной мембраны диализа веса против деионизированной воды в течение 5-7 дней (40-50 градусов по Цельсию). Меняйте воду два раза в день.
- Соберите и заморозьте раствор GelMA при цене 80 градусов по Цельсию на ночь.
- Лиофилизировать раствор GelMA в течение 3–5 дней в морозильной сушилке с температурой, установленной до -45 градусов по Цельсию, а давление устанавливается до 0,2 мбар.
- Растворите лиофилизированный гельма (степень замены примерно 75%) в 1x PBS, содержащий 10% FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота, v/v), 25 mM HEPES (N-2-гидроксиэтилпатразин-N-этан-сульфоновая кислота) и фотоинициативатор (0,5%, ж/в) для получения препарата GelMA биоинков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Степень замещения GelMA может быть рассчитана по анализу нинигидрина3. - Смешайте раствор GelMA (10%, w/v) с различными объемами первоначального решения SF (5%, w/v) и различными объемами 1x PBS для получения биоинков SF-GelMA с различными концентрациями SF. Пропорция на 1 мл раствор GelMA и SF в различных биоинксах представлена в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все биоинтоны должны содержать окончательную концентрацию 5% (w/v) GelMA, но концентрация SF варьируется: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, и 1.5% (w/v) в различных биоинках SF-GelMA. Используйте SF-M-Layered-GelMA, чтобы термин GelMA биоинки изменены с SF в слой за слоем образом. Используйте SF-X-GelMA для того чтобы терминировать те GelMA доработанное с SF в однородной манере (например, GelMA с изменением 1% SF было названо SF-1-GelMA). - Sonicate все биоинки в течение 10-20 мин.
- Расти NIH3T3 клетки с использованием DMEM (Dulbecco в модифицированной Eagle среды) содержащие 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию с 5% CO2). Прохождение ячеек в соотношении 1:3, когда плотность достигает 80%.
- Центрифуга суспензия клеток NIH3T3 при 1500 об/мин в течение 5 мин. Удалить супернатант с всасыванием и повторно перенапись клеточной гранулы со свежим раствором биомарка в 15 мл стерильной трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация инкапсулированных клеток в биоинке должна быть 1 х 106 клеток/мЛ, а концентрация должна быть рассчитана с помощью цитометра. - Используйте 2 мЛ различных биоинков SF-GelMA, чтобы приостановить клеточные гранулы для получения различных клеточных биоинков.
2. Загрузка, разогрев и биопечать SF-M-Layered-GelMA
- Загрузите 0,4 мл клеточного SF-0.5-GelMA в нижний слой шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприц 2 mL в качестве биомаркового резервуара в этом исследовании. Загрузите различные биоинки SF-GelMA в шприц с слоем. - Поместите шприц в ледяную водяную ванну (0 градусов по Цельсию) в течение 5 минут, чтобы привести к превращению биоинка нижнего слоя в состояние геля.
- Нагрузка 0,4 мл клеточного нагруженного SF-0.75-GelMA биоинк над нижним слоем.
- Поместите шприц с двумя слоями биоinks в ванну с ледяной водой (0 градусов по Цельсию) в течение 5 минут, чтобы вызвать два слоя биоinks превратиться в состояние геля.
- Цикл погрузки и охлаждения шаги еще 3 раза с оставшимися 3 вида биоинков (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA), чтобы получить многослойную биоинковую систему с различными концентрациями SF в различных слоях. Объем, используемый для загрузки всех биоинков, должен составлять 0,4 мл.
- Разогреть многослойный биоинк, поместив шприц в инкубатор (37 градусов по Цельсию) в течение 30 минут до биопечати.
- Используйте шприц 2 мЛ в качестве биомаркивного резервуара с соплом для печати 27 Г. Установите скорость потока на уровне 50 мл/мин, скорость движения сопла на 2 мм/с, а высота сопла - 1 мм. Выполните процедуру биопечати при комнатной температуре (примерно 20 градусов по Цельсию).
- Печать ткани построить в экструзии образом с помощью заказ биопринтера по параметрам, адаптированным из наших предыдущих исследований11,12.
- Используйте ультрафиолетовый свет (365 нм, 800 мВт) в течение 40 с для перекрестного пересечения конструкции биопечатной ткани.
- Культура поперечной ткани построить в DMEM (Dulbecco в модифицированных Eagle среды), содержащей 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию с 5% CO2). Среда менялась каждые 8 ч в течение первых 2 дней и каждые 2-3 дня после этого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема подготовки клеточного биоинкаса показана на рисунке 1. После подготовки различных биоinks, погрузка, разогрев и биопечать были выполнены(рисунок 2). Для оценки распределения инкапсулированных клеток в биоинковом резервуаре была проведена процедура биопечати с использованием трех различных бионков, нагруженных клетками, в трех 96-ну пластинах(рисунок 3A). Для исследования дисперсии инкапсулированных клеток (bioinks) были использованы две контрольные группы (нетронутые биоинституты GelMA иSF-1-GelMA)и экспериментальная группа (bioink) SF-M-Layered-GelMA). Шестьдесят микролитров клеточного биоинка были выдавлены в каждом колодце из трех 96-х пластин. Общий объем трех видов биоинка составил 2 мл, и в результате период биопечати составил более 30 мин. С дополнительной инкубацией до печати (30 мин), общий рабочий период составил более 1 ч и был признан подходящим сроком изготовления для биопечати крупных тканей и органов. Количество клеток в целевых скважинах, помеченных на рисунке 3A,в трех пластинах было подсчитано. Подсчет клеток в различных скважинах может отражать диспергность инкапсулированных клеток между различными группами. Результаты показали, что по мере развития процедуры биопечати плотность клеток в целевых скважинах уменьшалась во всех группах. В группе SF-0-GelMA примерно 70% ячеек были отложены в нижнем слое после общей процедуры. В группе SF-1-GelMA примерно 40% ячеек были отложены в нижнем слое, и примерно 5% ячеек были отложены в верхнем слое. В группе SF-M-Layered-GelMA осаждение инкапсулированных клеток было более однородным, чем у контрольных групп(рисунок 3C и 3D).
Рисунок 1: Схема биоинка SF-GelMA. SF-GelMA был подготовлен путем смешивания шелкового фиброина (SF) и GelMA/photoinitiator (PI) комплекс следуют ультразвуковой обработки в течение 10-20 мин. Затем, целевые клетки в смеси SF-GelMA были приостановлены для подготовки клетки груженый SF-GelMA биоинк. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Процедура погрузки, разогрева и биопечати. Ячейка, груженная SF-GelMA, как биоинк (ак), была загружена в биоинковой резервуар и преобразована в состояние геля от процедуры охлаждения. Процедура погрузки и охлаждения повторялась 5 раз с использованием бионанк (ак) с различными концентрациями SF (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, и 1.5%) для получения SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA). Состояние геля SF-M-Layered-GelMA было разогрето путем размещения биоинка в инкубаторе в течение 30 минут. Биоинкв состояния геля после инкубации превратился в жидкое состояние. Затем подготовленный биоинк был использован для печати с использованием шприца 2 мл в качестве биоинка резервуара с сопло печати 27 G. Печатная конструкция ткани была скреничной с помощью уф-излучения. Aq означает aqueous решение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Процедура биопечати использовала три различных бионагруженных клеток. (A), Шестьдесят микролитров биоинка были экструдированы в соответствующую 96-хорошо пластины в минуту, и потребовалось более 30 минут для достижения процедуры биопечати в 96-хорошо пластины. (B), Три различных вида биоинков были использованы для исследования дисперсии инкапсулированных клеток в процедуре биопечати: две контрольные группы (нетронутые gelMA и SF-1-GelMA биоинтонки) и экспериментальная группа (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), Плотность клеток No 1, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 скважин в трех пластинах была обнаружена с окрашивания, показывая распределение инкапсулированных клеток в трех биоинков, и осаждение инкапсулированных клеток в группе SF-M-Layered-GelMA было более однородным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Биоинки | Материалы (мл) | ||
| Гельма | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Таблица 1: Подготовка биоинков SF-GelMA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стабильность многослойной системы является ключевым моментом для успешного выполнения этого протокола. Теоретически мы рассчитали диффузию молекул SF в решении GelMA на основе исследования Наумана13. Выяснилось, что диффузия белков в растворе связана с их молекулярным весом. Средний молекулярный вес (МВт) альбумина сыворотки крупного рогатого скота (BSA) составляет 66,5 кДа, а коэффициент диффузии составляет 64-72 мкм2/с. Средний МВт фибриногена составляет 339,7 кДа, а коэффициент диффузии составляет 23-34 мкм2/с. Средний МВт молекул SF в нашем исследовании составляет около 100 кДа. На основе результатов исследования Наумана коэффициент диффузии одной молекулы SF составляет 23-72 мкм2/св воде при 25 градусов по Цельсию. Согласно уравнению Стокса-Эйнштейна, коэффициент диффузии определяется следующим образом:
где D является коэффициентом диффузии, K - консистенцией, T - абсолютной температурой, й - вязкостью раствора, а d - диаметром. Можно сделать вывод, что разница в коэффициенте диффузии молекул SF в воде и в растворе GelMA определяется разницей в вязкости этих двух окружающих растворов. Кроме того, радиус диффузии можно вычислить следующим образом:
где R является радиусом диффузии, D является коэффициентом диффузии, а T — временем диффузии. Чистая вода представляет вязкость на 8,9 х 10-4 Па, и вязкость GelMA при нулевом скорости сдвига в нашем исследовании была выше, чем 1000 па., Следовательно, радиус диффузии одной молекулы SF на 25 градусов по Цельсию меньше, чем 0,66-1,18 мкм/час в решении GelMA. Это означает, что SF вряд ли может распространяться по соседним слоям в системе SF-M-Layered-GelMA, что демонстрирует стабильность многослойной системы.
Гравитационно-управляемые осадочные породы инкапсулированных клеток неизбежны при биопечати с жидкой биоинксами. В нашем исследовании мы разработали новую модификацию низкой вязкости GelMA биоинк с циклической нагрузкой-охлаждением, чтобы замедлить осадок клеток, создавая межфазное удержание. Многослойное межфомационное удержание должно компенсировать действие гравитации инкапсулированных клеток и, следовательно, предотвратить осаждение инкапсулированных клеток через соседние слои в биоинковом резервуаре. Межфудное удержание было представлено продольно в биоинковом резервуаре между каждым соседним слоем из-за разницы между реологическим поведением различных биоинков, загруженных в разные слои. Эти межфоменционные напряжения начали работать, как только инкапсулированные клетки отложены на интерфейс. В результате гравитационное притяжение было смещено, а осадок остановлен. Хотя этот протокол является новым, больше приложений, использующих этот протокол в других жидкостных биоинковых системах, должны быть изучены для продвижения и оптимизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают гранты Национального фонда естественных наук Китая (81771971, 81970442, 81703470 и 81570422), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2018YFC1005002), Комиссия по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (17JC1400200), Шанхайский муниципальный научно-технический крупный проект (Грант No 2017H'S'X01), и Шанхайская комиссия по муниципальному образованию (Инновационная программа 2017-01-07) -00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
