Summary
ここでは、封入細胞の沈沈を防ぐために、液体状バイオインク(低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。
Abstract
押出ベースの3次元バイオプリンティングプロセス中に、低粘度の液体状のバイオインクは、剪断応力によって誘発される膜損傷から細胞を保護し、封入された細胞の生存を改善することができます。しかし、貯水池の急速な重力駆動細胞沈下は、バイオプリント構造における不均一な細胞分布を引き起こし、したがって液体のようなバイオインクの適用を妨げる可能性がある。ここでは、封入細胞の沈沈を防止するために、液体状バイオインク(例えば、低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。多層バイオインクで複数の液体界面を操作し、界面保持を提供した。その結果、多層系の隣接する層を横切る細胞沈め作用は、バイオインク貯留層において遅滞した。界面保持率は細胞の堆積物プルよりもはるかに高く、細胞沈沈を予防し、多層バイオインクにおける細胞のより均質な分散を促進する界面保持の重要な役割を示すことがわかった。
Introduction
三次元(3D)バイオプリンティングは、バイオファブリケーションと再生医療11、2、32,3におけるネイティブ組織の複雑な建築および機能的レプリカを製造する有望な方法である。インクジェット、押出し、立体撮影印刷を含むバイオプリンティングの一般的な戦略は、異なる視点から見た長所と短所を持っています4.これらの技術の中で、押し出し手順は、その費用対効果のために最も一般的に使用されます。バイオインクは、押出バイオプリンティングのプロセス安定性において重要な役割を果たしています。理想的な細胞を含むバイオインクは生体適合性であるだけでなく、機械的特性5にも適しているべきである。低粘度のバイオインクは、典型的には液体状の状態として提示される。これらのバイオインクは容易かつ迅速に堆積し、押出の間に高いせん断応力によって誘発される細胞膜損傷を避けることができる。しかし、長期印刷期間を要する複雑な場合には、低粘度がしばしば、生体インク貯蔵所内のカプセル化された細胞の沈下を起こし、これは通常重力によって駆動され、バイオインク66,77における不均一な細胞分散を引き起こします。その結果、不均一な細胞分散性を有するバイオインクは、機能的組織構築物のインビトロバイオプリンティングを妨げる。
バイオインクに焦点を当てたいくつかの最近の研究は、カプセル化された細胞の均質な分散性の促進を報告しています。.二重段架橋に基づく修飾アルギン酸バイオインクを押出バイオプリンティング8に使用した。本研究では、アルギン酸ポリマーをペプチドおよびタンパク質で改変した。細胞は、ペプチドおよびタンパク質によって提供される結合部位に起因して、一般的に使用されるアルギン酸塩よりも、この修飾アルギン酸においてより均質な分布を提示した。あるいは、ビオインク中の細胞の沈下を解くために、配合されたバイオインクが利用されている。ポリエチレングリコール(PEG)とゼラチンまたはゼラチンメタクリロイル(GelMA)を含むブレンドバイオインクを、機械的堅牢性の向上を有する別の研究9で使用した。カプセル化された細胞は、主として、配合されたバイオインクの粘度が改善されたため、均質な分布を提示した。一般に、バイオインクの粘度、細胞の重力、細胞の密度、および作業期間の持続性など、バイオインク中のカプセル化された細胞の分散に影響を与えるいくつかの要因がある。これらの要因の中で、細胞の重力は沈積を促進する上で重要な役割を果たす。粘性バイオインクによって提供される浮力と摩擦は、現在までに重力に対する主な力として調査されてきた。
ここで、バイオインク貯留層内の複数の液体インターフェースを操作することにより、バイオインク中のカプセル化された細胞の均質な分散を促進する新しい戦略を開発した。バイオインの多層的な修飾によって作成されたこれらの液体界面は、細胞の沈沈を遅らせる界面保持を提供するだけでなく、バイオインクの適切な生体適合性およびレオロジー挙動を維持することができる。実際には、シルクフィブロイン(SF)を用いた水性GelMA溶液(5%、w/v)を多層的に改変し、4つの界面を縦方向に生成し、ブレンドされたバイオインクに界面緊張を与えました。その結果、人工界面張力によって細胞への重力負荷が相殺され、細胞の隣接する層にわたる沈み込みが少ないため、バイオインク中のカプセル化された細胞のほぼ均質な分散が得られた。液体バイオインク中の界面保持を操作することによってカプセル化された細胞の沈降を遅くする同様のプロトコルは、現在までに報告されていない。ここでは、バイオプリンティングにおける細胞沈積を解決する新しい方法を実証するために、プロトコルを紹介します。
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Protocol
1. 細胞を含むSF-GelMAの調製
- 0.22 μmのシリンジフィルターユニットを使用して、すべての材料を殺菌します。生物学的安全キャビネットのすべての手順を実行します。
- 1xPBSを50°Cに温め、攪拌しながら加熱した1xPBSにゼラチンを溶解させた。PBS中のゼラチンの最終濃度は10%(w/v)でなければなりません。
- メタクリル無水物をゼラチン溶液(0.6~1のゼラチンに対するメタクリル無水物の重量比)を攪拌しながらゆっくりと加え、少なくとも1時間(50°C)の錯体を混合する。典型的には、12gのメタクリル無水で200mLのゼラチン溶液を調製する。容積は、研究の必要性に依存する。
- ゼラチンとメタクリル無水を含む混合溶液を50 mL滅菌チューブに移します。
- 3,500 x gで混合溶液を遠心分離します。通常、2つの層を得るのに3〜5分かかります。上層(GelMA)を回収し、底層(未反応メタクリル無水)を廃棄する。
- ステップ1.5で得られた上層溶液を2体積の脱イオン水(40-50°C)で希釈します。
- ステップ1.6で得られた溶液を、12-14 kDaの分子量遮断透析膜を用いて、脱イオン水に対して5-7日間(40-50°C)に透析します。毎日2回水を交換します。
- GelMA溶液を一晩で−80 °Cで回収し、凍結してください。
- 温度を-45 °Cに設定し、圧力を0.2 mbarに設定して、凍結乾燥機でGelMA溶液を3〜5日間凍結乾燥させます。
- 凍結乾燥したGelMA(約75%の置換度)を溶解する10% FBS (胎児ウシ血清、 v/v)、25 mM HEPES(N-2-ヒドロキジエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸)、および光基剤(0.5%、w/v)を含有する1x PBSでGelMAバイオインク製剤を得た。
注:GelMAの置換度は、ニンヒドリンアッセイ3によって計算することができる。 - ゲルMA溶液(10%、w/v)を初期SF溶液の異なる体積(5%、w/v)と1x PBSの異なるボリュームと混合して、異なる濃度のSFでSF-GelMAバイオインクを得る。異なるバイオインクにおけるGelMAおよびSF溶液の1mL当たりの割合を表1に示す。
注: すべてのバイオインクは、5%(w/v)GelMA の最終濃度を含んでいる必要がありますが、SF の濃度は異なります: 0.5、0.75、1.0、1.25、および 1.5% (w/v) 異なる SF-GelMA バイオインク。SF-M-層状ゲルMAを使用して、SFで改変されたGelMAバイオインクを層ごとに呼び出します。SF-X-GelMAを用いて、同種の様式でSFで修飾されたものゲルMAを用語する(例えば、1%SFの修飾を伴うGelMAはSF-1-GelMAと呼ばれた)。 - 10-20分間、すべてのバイオインクを超音波処理します。
- インキュベーターで10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM(ダルベックの修飾イーグル培地)を使用してNIH3T3細胞を増殖させる(5%CO2の37°C)。2密度が80%に達すると、細胞を1:3の割合で通過させる。
- 1500 rpmでNIH3T3細胞の懸濁液を5分間遠心分離し、吸引で上清を取り除き、15 mLの滅菌チューブに新鮮なバイオインク溶液で細胞ペレットを再懸濁させます。
注:バイオインク内のカプセル化された細胞の濃度は1 x 106細胞/mLで、濃度はサイトメーターで計算する必要があります。 - 異なるSF-GelMAバイオインクの2 mLを使用して細胞ペレットを一時停止し、様々な細胞を含むバイオインクを得る。
2. SF-M層状ゲルMAのローディング、再加熱、バイオプリンティング
- 細胞を含むSF-0.5-GelMAの0.4 mLをシリンジの最下層に荷重します。
注:この研究では、バイオインク貯留層として2mLシリンジを使用してください。異なるSF-GelMAバイオインクスをシリンジに層ごとにロードします。 - シリンジを氷水浴(0°C)に5分間入れ、下層のバイオインをゲル状態に変えます。
- 細胞を含むSF-0.75-ゲルMAバイオインクの0.4 mLを下層に荷重する。
- 2層のバイオインクを氷水浴(0°C)に5分間置き、2層のバイオインクをゲル状態に変換させます。
- 残りの3種類のバイオインク(SF-1-GelMA、SF-1.25-GelMA、SF-1.5-GelMA)で負荷と冷却のステップをさらに3回サイクルし、異なる層に異なる濃度のSFを有する多層バイオインク系を得る。すべてのバイオインクのローディングに使用されるボリュームは0.4 mLでなければなりません。
- インキュベーター(37°C)にインキュベーター(37°C)をバイオプリンティングの前に30分間置き、多層バイオインクを再加熱します。
- 27 G 印刷ノズルを備えたバイオインク貯留層として 2 mL シリンジを使用してください。流速を50μL/min、ノズルの移動速度を2mm/s、ノズルの高さを1mmに設定し、室温(約20°C)でバイオプリンティングを行います。
- 以前の研究11,12から適応したパラメータの下でカスタムメイドのバイオプリンターを使用して、組織構造を押し12出し方法で印刷する。
- 40 s用紫外光(365nm,800 mW)を使用して、バイオプリント組織構築物を架橋します。
- 10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンをインキュベーターに含むDMEM(ダルベックの改変イーグル培地)で架橋組織構築物を培養する(5%CO2で37°C)。2培地は、最初の2日間および2〜3日ごとに8時間ごとに交換した。
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Representative Results
細胞を含むバイオインクの調製の概略を図1に示す。異なるバイオインクの調製後、ローディング、再加熱およびバイオプリンティングが行われた(図2)。バイオインク貯留層内のカプセル化された細胞の分布を評価するために、3つの96ウェルプレートに3つの異なる細胞を含むバイオインクを用いてバイオプリンティング手順を行った(図3A)。2つの対照群(手付かずのGelMAおよびSF-1-GelMAバイオインク)および実験群(SF-M層状ゲルマバイオインク)を用いて、封入された細胞の分散性を調べた(図3B)。細胞を含むバイオインクの60マイクロリットルは、3つの96ウェルプレートのすべての井戸に押し出された。バイオインクの3種類の総量は2mLであり、その結果、バイオプリンティング期間は30分以上であった。印刷前の追加のインキュベーション(30分)により、総作業期間は1時間を超え、大きな組織および臓器のバイオプリンティングに適した製造期間とみなされた。3枚のプレート中の標的ウェル内の細胞数を、図3Aに示す数をカウントした。異なるウェル内の細胞の数は、異なるグループ間のカプセル化された細胞の分散性を反映することができる。結果は、バイオプリンティング手順が進むにつれて、標的ウェル内の細胞の密度がすべてのグループで減少することを示した。SF-0-GelMA群では、全手順後に細胞の約70%を下層に沈着させた。SF-1-GelMA群では、細胞の約40%を最下層に沈着させ、そして細胞の約5%を最上層に沈着させた。SF-M-層状ゲルMA群では、カプセル化された細胞の堆積物は、対照群のそれよりも均質であった(図3Cおよび3D)。
図1:SF-GelMAバイオインク製剤の概略図。SF-GelMAを、シルクフィブロイン(SF)とGelMA/光刺激体(PI)複合体を混合し、続いて超音波処理を10〜20分間に調製した。次いで、SF-GelMA混合物中の標的細胞を懸濁し、細胞を含んだSF-GelMAバイオインクを調製した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ロード、再加熱、およびバイオプリンティング手順細胞を含んだSF-GelMAを、バイオインク(aq)として、バイオインク貯留層に装填し、冷却手順からゲル状態に変換した。SFの異なる濃度(0.5、0.75、1.0、1.25、および1.5%)のバイオインク(aq)を使用して、負荷と冷却手順を5回繰り返した。SF-多層ゲルMA(SF-M層状ゲルMA)を得た。ゲル状態SF-M-層状ゲルMAを、インキュベーターに30分間インキュベーターに入れることにより再加熱した。ゲル状態のバイオインクはインキュベーション後に液体状態に変わった。次いで、27G印刷ノズルを用いたバイオインク貯留部として2mLシリンジを用いて、調製したバイオインクを使用した。印刷された組織構築物をUV光を用いて架橋した。Aqは水溶液を意味する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:バイオプリンティング手順では、3つの異なる細胞を含むバイオインクを使用した。(A)、60マイクロリットルのバイオインクを毎分対応する96ウェルプレートに押し出し、96ウェルプレートでバイオプリンティング手順を達成するのに30分以上かかりました。(B)、バイオプリンティング手順におけるカプセル化された細胞の分散性を調べるには、2つの対照群(手付かずのGelMAおよびSF-1-GelMAバイオインク)および実験群(SF-M層ゲルMAバイオインク)の3種類のバイオインクが使用された。(C-D)、3枚のプレート中の1、5、10、15、20、25、および30のウェルの細胞密度を染色して検出し、3つのバイオインクにおけるカプセル化された細胞の分布を示し、SF-M層状ゲルMA群中のカプセル化細胞の沈着がより均質であった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| バイオインク | 材料(ml) | ||
| ゲルマ | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-ゲルマ | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-ゲルマ | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-ゲルマ | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-ゲルマ | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-ゲルマ | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
表1:SF-GelMAバイオインクの調製
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Discussion
マルチレイヤ化システムの安定性は、このプロトコルを正常に実行するための重要なポイントです。我々は、Naumanの研究13に基づいてGelMA溶液中のSF分子の拡散を理論的に計算した。溶液中のタンパク質の拡散は、その分子量に関連していることが分かった。牛血清アルブミン(BSA)の平均分子量(MW)は66.5kDaで、その拡散係数は64-72 μm2/sです。フィブリノーゲンの平均MWは339.7 kDaで、拡散係数は23-34 μm2/sです。我々の研究におけるSF分子の平均MWは約100kDaである。Naumanの研究結果に基づいて、単一のSF分子の拡散係数は25°Cの水中で23-72 μm2/sの間にある。ストークス-アインシュタイン方程式によると、拡散係数は次のように定義されます。
ここで、Dは拡散係数、Kは一貫性、Tは絶対温度、ηは溶液の粘度、dは直径です。水中およびGelMA溶液中のSF分子の拡散係数の差は、これら2つの周囲溶液の粘度差によって決定されると結論することができる。また、拡散半径は次のように計算できます。
ここで、Rは拡散半径、Dは拡散係数、Tは拡散時間です。純水は8.9 x 10-4 Pa·sで粘度を示し、我々の研究ではゼロ剪断速度でのGelMAの粘度は1000 Pa·sより高かった。これは、SF-M層-GelMAシステムの隣接する層にSFがほとんど拡散できないことを示しており、これは多層システムの安定性を示す。
液体のようなバイオインクでバイオプリンティングを行う場合、カプセル化された細胞の重力駆動堆積は避けられません。我々の研究では、界面保持を生み出すことによって細胞の沈沈を遅らせる環状ローディング冷却を用いた低粘度GelMAバイオインの新しい改変を開発した。多層界面保持は、カプセル化された細胞の重力の作用を相殺し、その結果、バイオインク貯留層の隣接する層にわたってカプセル化された細胞の沈沈を防ぐことになっている。界面保持は、異なる層にロードされた異なるバイオインクのレオロジー挙動の違いのために、各隣接する層間のバイオインク貯留層に縦方向に提示された。これらの界面緊張は、カプセル化された細胞が界面に沈降するとすぐに機能し始めた。その結果、重力プルがオフセットされ、沈積が停止した。このプロトコルは新しいものですが、他の液体のようなバイオインクシステムでこのプロトコルを利用するより多くのアプリケーションを、プロモーションと最適化のために検討する必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、中国国立自然科学財団(81771971、81970442、81703470、81570422)、中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1005002)、上海市科学技術委員会(17JC140020)、および主要技術プロジェクト(17JC140020)からの助成金を認めている。 2017SHZDZX01)、上海市教育委員会(イノベーションプログラム2017-01-07-00-07-E00027)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
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