Summary
Her udviklede vi en ny flerlaget modificeret strategi for væskelignende bioinks (gelatin methacryloyl med lav viskositet) for at forhindre sedimentering af indkapslede celler.
Abstract
Under ekstrudering-baserede tre-dimensionelle bioprint proces, væske-lignende bioinks med lav viskositet kan beskytte celler mod membran skader induceret af forskydning stress og forbedre overlevelsen af indkapslede celler. Hurtig tyngdekraftsdrevet cellesedimentering i reservoiret kan imidlertid føre til en inhomogen cellefordeling i biotrykte strukturer og dermed hindre anvendelsen af væskelignende bioinks. Her udviklede vi en ny flerlaget modificeret strategi for væskelignende bioinks (f.eks. gelatine methacryloyl med lav viskositet) for at forhindre sedimentering af indkapslede celler. Flere flydende grænseflader blev manipuleret i den flerlagede bioink for at give interfacial retention. Derfor blev cellesedimenteringsaktionen på tværs af tilstødende lag i flerlaget systemet forsinket i bioinkbeholderen. Det blev konstateret, at den interfaciale retention var meget højere end sedimental træk af celler, hvilket viser en kritisk rolle af den interfaciale fastholdelse i forebyggelsen af celle sedimentering og fremme en mere homogen spredning af celler i flerlaget bioink.
Introduction
Tredimensional (3D) biotryk har været en lovende metode til fremstilling af komplekse arkitektoniske og funktionelle replikaer af indfødte væv i biofabrikation og regenerativ medicin1,2,3. De fælles strategier for bioprint, herunder inkjet, ekstrudering, og stereolitografi udskrivning, har fordele og ulemper fra forskellige perspektiver4. Blandt disse teknikker, ekstrudering procedure er mest almindeligt anvendt på grund af dens omkostningseffektivitet. Bioink spiller en central rolle i processen stabilitet ekstrudering bioprinting. Den ideelle cellefyldte bioink bør ikke kun være biokompatibel, men også være egnet til mekaniske egenskaber5. Bioinks med lav viskositet præsenteres typisk som en væskelignende tilstand. Disse bioinks kan nemt og hurtigt deponeres og undgå cellemembranskader forårsaget af høj forskydningsstress under ekstrudering. I komplekse tilfælde, der kræver længere tids trykningsperioder, giver lav viskositet imidlertid ofte anledning til den uundgåelige sedimentering af de indkapslede celler i bioinkbeholderen, som normalt er drevet af tyngdekraften og fører til en uhomogen cellespredning i bioink6,7. Derfor hæmmer en bioink med inhomogen cellespredning in vitro bioprinting af en funktionel vævskonstruktion.
Flere nylige undersøgelser med fokus på bioinks har rapporteret fremme af homogen spredning af indkapslede celler. En modificeret alginat bioink baseret på dual-stage crosslinking blev brugt til ekstrudering bioprint8. En alginat polymer blev modificeret med peptider og proteiner i denne undersøgelse. Cellerne præsenterede en mere homogen fordeling i denne modificerede alginat end i det almindeligt anvendte alginat på grund af de fastgørelsessteder, som peptiderne og proteinerne giver. Alternativt er blandede bioinks blevet udnyttet til at løse sedimentering af celler i bioink. I en anden undersøgelse9blev der anvendt en blandet bioink indeholdende polyethylenglycol (PEG) og gelatine eller gelatine methacryloyl (GelMA) med forbedret mekanisk robusthed. De indkapslede celler præsenterede en homogen fordeling, hovedsagelig fordi viskositeten af den blandede bioink blev forbedret. Generelt er der flere faktorer, der påvirker spredningen af de indkapslede celler i bioink, såsom bioinks viskositet, cellernes tyngdekraft, cellernes tæthed og arbejdsperiodens varighed. Blandt disse faktorer spiller cellernes tyngdekraft en afgørende rolle i at fremme sedimentering. Opdrift og friktion fra den viskose bioink er blevet undersøgt som de vigtigste kræfter mod tyngdekraften til dato10.
Heri udviklede vi en ny strategi for at fremme homogen spredning af de indkapslede celler i bioink ved at manipulere flere flydende grænseflader i bioinkreservoiret. Disse flydende grænseflader skabt af den flerlagede ændring af bioink kan ikke kun give interfacial fastholdelse, som forsinker sedimentering af celler, men også opretholde en passende biokompatibilitet og reologisk adfærd bioink. I praksis ændrede vi den vandige GelMA-opløsning (5%, w/v) med silkefibrosin (SF) på en flerlaget måde til langsgående at producere fire grænseflader, hvilket giver interfacial spændinger i den blandede bioink. Som følge heraf blev tyngdekraftbelastningen på cellerne opvejet af den menneskeskabte interfacial spænding, og en næsten homogen spredning af de indkapslede celler i bioink blev opnået på grund af mindre sedimentering på tværs af de tilstødende lag af celler. Der er til dato ikke rapporteret nogen lignende protokol til at bremse sedimentering af indkapslede celler ved at manipulere interfacial retention i flydende bioinks er blevet rapporteret til dato. Vi præsenterer vores protokol her for at demonstrere en ny måde at løse celle sedimentering i bioprint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af cellebelæssede SF-GelMA
- Sterilisere alle materialer ved hjælp af 0,22 μm sprøjte filter enheder. Udfør alle trinene i et biologisk sikkerhedsskab.
- Varm 1x PBS til 50 °C, og opløse gelatine i den opvarmede 1x PBS under omrøring. Den endelige koncentration af gelatine i PBS skal være 10% (w/v).
- Methakrylanhydrid tilsættes i gelatineopløsningen (vægtforholdet mellem methakrylanhydrid og gelatine på 0,6 til 1) langsomt under omrøring og komplekset blandes i mindst 1 time (50 °C). Der fremstilles typisk 200 ml 10% gelatineopløsning med 12 g methakrylanhydrid; omfanget afhænger af undersøgelsens behov.
- Den blandede opløsning, der indeholder gelatine og methakrylanhydrid, overføres til et 50 ml sterilt rør.
- Centrifuge den blandede opløsning ved 3.500 x g. Det tager normalt 3-5 min at opnå to lag. Opsaml det øverste lag (GelMA) og kassér det nederste lag (ureageret methacryrylekylanhydrid).
- Den øverste lagopløsning fortyndes i trin 1.5 med to volumener deioniseret vand (40−50 °C).
- Dialyser opløsningen opnået i trin 1.6 med en 12-14 kDa molekylvægt afskæringsdialysemembran mod deioniseret vand i 5−7 dage (40−50 °C). Skift vand to gange om dagen.
- GelMA-opløsningen opsamles og fryses ved −80 °C natten over.
- Lyophilize GelMA opløsningen i 3−5 dage i en frysetørrer med temperaturen indstillet til -45 °C og trykket indstillet til 0,2 mbar.
- Den frysetørrede GelMA (substitutionsgrad på ca. 75%) i 1x PBS indeholdende 10% FBS (føtal kvægserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-ethan-sulfonsyre) og fotoinitiator (0,5%, w/v) for at opnå GelMA bioinkpræparatet.
BEMÆRK: Graden af substitution af GelMA kan beregnes ved hjælp af en ninhydrinanalyse3. - GelMA-opløsningen (10%, w/v) blandes med forskellige mængder af den oprindelige SF-opløsning (5%, w/v) og forskellige mængder 1x PBS for at opnå SF-GelMA bioinks med forskellige koncentrationer af SF. Andelen pr. 1 ml GelMA- og SF-opløsning i de forskellige biokre er angivet i tabel 1.
BEMÆRK: Alle bioinks skal indeholde en endelig koncentration på 5% (w/v) GelMA, men koncentrationen af SF varierer: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 og 1,5% (w/v) i de forskellige SF-GelMA bioinks. Brug SF-M-Layered-GelMA til at betegne GelMA bioink modificeret med SF i en lag-for-lag måde. Brug SF-X-GelMA til at betegne dem, gelma modificeret med SF på en homogen måde (f.eks GelMA med ændring af 1% SF blev kaldt SF-1-GelMA). - Sonicate alle bioinks i 10-20 min.
- NiH3T3-celler dyrkes ved hjælp af DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium), der indeholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Passage cellerne i et forhold på 1:3, når tætheden når 80%.
- Centrifuges suspensionen af NIH3T3-celler ved 1500 omdrejninger i minuttet i 5 min. Fjern supernatanten med suge, og opsug cellepillen med frisk bioinkopløsning i et 15 ml sterilt rør.
BEMÆRK: Koncentrationen af de indkapslede celler i bioink skal være 1 x 106 celler/ml, og koncentrationen skal beregnes med et cytometer. - Brug 2 ml forskellige SF-GelMA bioinks til at suspendere cellepillerne for at opnå forskellige cellefyldte bioinks.
2. Lastning, genopvarmning og biotryk af SF-M-Layered-GelMA
- Læg 0,4 ml cellebelæssede SF-0,5-GelMA i sprøjtens bundlag.
BEMÆRK: Brug en 2 ml sprøjte som bioinkbeholder i denne undersøgelse. Læg forskellige SF-GelMA bioinks ind i sprøjten på en lag-for-lag måde. - Sprøjten anbringes i isvandbad (0 °C) i 5 minutter for at få det bundlagske biobrændstof til at omdanne sig til geltilstand.
- 0,4 ml cellebelæsset SF-0,75-GelMA bioink lægges over bundlaget.
- Sprøjten anbringes med de to lag bioinks i et isvandbad (0 °C) i 5 minutter for at få de to lag bioinks til at omdannes til en geltilstand.
- Cyklus lastning og køling trin en anden 3 gange med de resterende 3 slags bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) for at opnå en flerlaget bioink system med forskellige koncentrationer af SF i de forskellige lag. Det volumen, der anvendes til lastning af alle bioinks, skal være 0,4 ml.
- Opvarm den flerlagede bioink ved at anbringe sprøjten i en inkubator (37 °C) i 30 minutter før biotrykning.
- Brug en 2 ml sprøjte som bioinkbeholder med en 27 G-printdyse. Indstil strømningshastigheden til 50 μL/min., dysens bevægelseshastighed ved 2 mm/s og dysens højde ved 1 mm. Biotrykningsproceduren udføres ved stuetemperatur (ca. 20 °C).
- Tryk vævskonstruktionen på en ekstruderingsmåde ved hjælp af en specialfremstillet bioprinter under de parametre , der er tilpasset fra vores tidligere undersøgelser11,12.
- Brug ultraviolet lys (365 nm, 800 mW) i 40 s for at krydse den bioprintede vævskonstruktion.
- Kultur krydslinket væv konstruktion i DMEM (Dulbecco modificerede Eagle medium) indeholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin i en inkubator (37 °C med 5% CO2). Mediet blev skiftet hver 8 h i løbet af de første 2 dage og hver 2-3 dage derefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1er vist en skematisk fremstilling af cellefyldte bioinks . Efter fremstilling af de forskellige bioinks blev der udført lastning, genopvarmning og biotrykning (figur 2). For at vurdere fordelingen af de indkapslede celler i bioinkbeholderen blev der udført en biotrykningsprocedure ved hjælp af tre forskellige cellefyldte bioinks i tre 96-brøndplader (Figur 3A). Der blev anvendt to kontrolgrupper (uberørt GelMA- og SF-1-GelMA-bioink) og forsøgsgruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink) til at undersøge spredningen af de indkapslede celler (Figur 3B). Tres mikroliter af celle-laden bioink blev ekstruderet i hver brønd af de tre 96-brønd plader. Den samlede mængde af de tre typer bioink var 2 ml, og som følge heraf var perioden med bioprint mere end 30 min. Med den ekstra inkubation før trykning (30 min) var den samlede arbejdsperiode på over 1 time og blev anset for at være en passende fremstillingsvarighed for biotryk af store væv og organer. Antallet af celler i mål wells, mærket i figur 3A, i de tre plader blev talt. Antallet af celler i forskellige brønde kunne afspejle spredningen af de indkapslede celler blandt de forskellige grupper. Resultaterne viste, at efterhånden som biotrykproceduren skred frem, faldt tætheden af celler i mål wells i alle grupper. I SF-0-GelMA-gruppen blev ca. 70% af cellerne deponeret i det nederste lag efter den samlede procedure. I SF-1-GelMA-gruppen blev ca. 40% af cellerne deponeret i det nederste lag, og ca. 5% af cellerne blev deponeret i det øverste lag. I SF-M-Layered-GelMA-gruppen var aflejringen af indkapslede celler mere homogen end kontrolgruppernes (Figur 3C og 3D).
Figur 1: Skematisk for SF-GelMA bioinkpræparatet. SF-GelMA blev udarbejdet ved at blande silkefibrosin (SF) og GelMA/photoinitiator (PI) kompleks efterfulgt af ultralydsbehandling i 10-20 min. Derefter blev målcellerne i SF-GelMA-blandingen suspenderet for at forberede cellen lastet SF-GelMA bioink. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Lastning, genopvarmning og biotrykning. Cellen lastet SF-GelMA, som bioink (aq), blev indlæst i bioink reservoir og omdannet til gel tilstand fra køleprocedure. Laste- og køleproceduren blev gentaget 5 gange ved hjælp af bioinks (aq) med forskellige koncentrationer af SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 og 1,5%) for at opnå SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA). Geltilstanden SF-M-Layered-GelMA blev genopvarmet ved at placere bioink i en inkubator i 30 min. Gelen tilstand bioink forvandlet til en flydende tilstand efter inkubation. Derefter blev den forberedte bioink brugt til udskrivning ved hjælp af en 2 ml sprøjte som bioinkbeholder med en 27 G printdyse. Den trykte vævskonstruktion blev krydslinket ved hjælp af UV-lys. Aq betyder vandig opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Biotrykproceduren anvendte tre forskellige cellefyldte bioinks. (A), 60 mikroliter bioink blev ekstruderet i den tilsvarende 96-brønd plade per minut, og det tog mere end 30 min at opnå bioprint procedure i 96-brøndpladen. (B), Tre forskellige typer bioinks blev brugt til at undersøge spredningen af indkapslede celler i bioprinting procedure: to kontrolgrupper (uberørt GelMA og SF-1-GelMA bioinks) og forsøgsgruppen (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), celletætheder i nr. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Bioinks | Materialer (ml) | ||
| GelMA (GelMA) | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabel 1: Forberedelse af SF-GelMA bioinks
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabiliteten af det flerlagede system er et centralt punkt for at udføre denne protokol med succes. Vi beregnede teoretisk diffusionen af SF-molekyler i GelMA-opløsningen baseret på Naumans studie13. Det blev konstateret, at udbredelsen af proteiner i opløsning var relateret til deres molekylvægt. Den gennemsnitlige molekylvægt (MW) for bovin serumalbumin (BSA) er 66,5 kDa, og dens diffusionskoefficient er 64-72 μm2/s. Den gennemsnitlige MW fibrinogen er 339,7 kDa, og dens diffusionskoefficient er 23-34 μm2/s. Den gennemsnitlige MW af SF molekyler i vores undersøgelse er ca. 100 kDa. På grundlag af resultaterne af Naumans undersøgelse er diffusionskoefficienten for et enkelt SF-molekyle mellem 23-72μm 2/s i vand ved 25 °C. Ifølge Stokes-Einstein ligning, diffusion koefficient er defineret som følger:
hvor D er diffusionskoefficienten, er K konsistensen, T er den absolutte temperatur, η er opløsningens viskositet, og d er diameteren. Det kan konkluderes, at forskellen i diffusionskoefficienten for SF-molekyler i vand og i GelMA-opløsning bestemmes af forskellen i viskositeten af disse to omgivende opløsninger. Desuden kan diffusionsradiussen beregnes på følgende måde:
hvor R er diffusionsradius, er D diffusionskoefficienten, og T er diffusionstiden. Rent vand giver en viskositet på 8,9 x 10-4 Pa·s, og viskositeten af GelMA ved nul forskydningshastighed i vores undersøgelse var højere end 1000 Pa·s. Derfor er diffusionsradius for et enkelt SF-molekyle ved 25 °C mindre end 0,66-1,18 μm/time i GelMA-opløsningen. Dette indikerer, at SF næppe kan sprede sig over de tilstødende lag i SF-M-Layered-GelMA-systemet, hvilket viser stabiliteten af det flerlagede system.
Tyngdekraftsdrevet sedimentering af de indkapslede celler er uundgåelig, når bioprint med væskelignende bioinks. I vores undersøgelse udviklede vi en ny ændring af gelma bioink med lav viskositet med cyklisk belastningskøling for at forsinke sedimentering af celler ved at skabe interfacial retention. Den flerlagede interfacial fastholdelse formodes at opveje virkningen af tyngdekraften af indkapslede celler og dermed forhindre sedimentering af indkapslede celler på tværs af de tilstødende lag i bioink reservoir. Den interfaciale fastholdelse blev præsenteret i længderetningen i bioink reservoir mellem hvert tilstødende lag på grund af forskellen mellem den reologiske adfærd af forskellige bioinks indlæst i forskellige lag. Disse interfacial spændinger begyndte at arbejde, så snart indkapslet celler sedimenteret til grænsefladen. Som følge heraf blev tyngdekraften træk opvejet, og sedimentering blev stoppet. Selv om denne protokol er ny, flere applikationer udnytter denne protokol i andre flydende-lignende bioink systemer bør undersøges for forfremmelse og optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 og 81570422), Kinas nationale nøgleprogram (2018YFC1005002), Shanghai Kommunes videnskabs- og teknologikommission (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) og Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-0 7-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
