Summary
Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.
Abstract
Durante o processo de bioimpressão tridimensional baseado em extrusão, bioinks semelhantes a líquidos com baixa viscosidade podem proteger as células contra danos na membrana induzidos pelo estresse da tesoura e melhorar a sobrevivência das células encapsuladas. No entanto, a rápida sedimentação celular movida pela gravidade no reservatório poderia levar a uma distribuição celular inhomogênea em estruturas bioimpressoras e, portanto, dificultar a aplicação de bioinks semelhantes a líquidos. Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (por exemplo, methacryloyl de gelatina com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas. Várias interfaces líquidas foram manipuladas no bioink multicamadas para fornecer retenção interfacial. Consequentemente, a ação de sedimentação celular que atravessa camadas adjacentes no sistema multicamadas foi retardada no reservatório de bioink. Verificou-se que a retenção interfacial era muito maior do que a atração sedimental das células, demonstrando um papel crítico da retenção interfacial na prevenção da sedimentação celular e promovendo uma dispersão mais homogênea das células no bioink multicamadas.
Introduction
A bioimpressão tridimensional (3D) tem sido um método promissor para a fabricação de réplicas arquitetônicas e funcionais complexas de tecidos nativos em biofabbricação e medicina regenerativa1,,2,3. As estratégias comuns de bioimpressão, incluindo jato de tinta, extrusão e impressão estereotipada, têm prós e contras de diferentes perspectivas4. Entre essas técnicas, o procedimento de extrusão é mais comumente utilizado devido ao seu custo-efetividade. A Bioink desempenha um papel fundamental na estabilidade do processo da bioimpressão de extrusão. O bioink ideal carregado de células não deve ser apenas biocompatível, mas também ser adequado para propriedades mecânicas5. Bioinks com baixa viscosidade são tipicamente apresentados como um estado líquido. Essas bioinks podem ser facilmente e rapidamente depositadas e evitar danos na membrana celular induzidos pelo alto estresse da tesoura durante a extrusão. No entanto, em casos complexos que requerem períodos de impressão de longo prazo, a baixa viscosidade muitas vezes dá origem à inevitável sedimentação das células encapsuladas no reservatório bioink, que geralmente é impulsionado pela gravidade e leva a uma dispersão celular inhomogênea no bioink6,7. Consequentemente, um bioink com dispersão celular inhomogênea dificulta a bioimpressão in vitro de uma construção de tecido funcional.
Vários estudos recentes com foco em bioinks relataram a promoção da dispersão homogênea das células encapsuladas. Um bioink alginato modificado baseado em crosslinking de dois estágios foi usado para a bioimpressão de extrusão8. Um polímero alginato foi modificado com peptídeos e proteínas neste estudo. As células apresentaram uma distribuição mais homogênea neste alginato modificado do que no alginato comumente utilizado devido aos locais de fixação fornecidos pelos peptídeos e proteínas. Alternativamente, bioinks misturados têm sido utilizados para resolver a sedimentação de células em bioink. Um bioink misturado contendo polietileno glicol (PEG) e gelatina ou gelatina methacryloyl (GelMA) com robustez mecânica melhorada foi utilizado em outro estudo9. As células encapsuladas apresentaram uma distribuição homogênea principalmente porque a viscosidade do bioink misturado foi melhorada. Em geral, há vários fatores que influenciam a dispersão das células encapsuladas no bioink, como a viscosidade do bioink, a gravidade das células, a densidade das células e a duração do período de trabalho. Entre esses fatores, a gravidade das células desempenha um papel fundamental na promoção da sedimentação. A flutuação e o atrito fornecidos pelo bioink viscoso foram investigados como as principais forças contra a gravidade até o momento10.
Nesse meio tempo, desenvolvemos uma nova estratégia para promover a dispersão homogênea das células encapsuladas em bioink manipulando múltiplas interfaces líquidas no reservatório de bioink. Essas interfaces líquidas criadas pela modificação multicamadas do bioink podem não apenas fornecer retenção interfacial, que retarda a sedimentação das células, mas também manter uma biocompatibilidade adequada e comportamento reológico do bioink. Na prática, modificamos a solução aquosa gelma (5%, w/v) com fibroine de seda (SF) de forma multicamadas para produzir longitudinalmente quatro interfaces, proporcionando tensões interfaciais no bioink misturado. Como resultado, o carregamento de gravidade nas células foi compensado pela tensão interfacial feita pelo homem, e uma dispersão quase homogênea das células encapsuladas no bioink foi obtida devido à menor sedimentação através das camadas adjacentes das células. Nenhum protocolo semelhante para retardar a sedimentação de células encapsuladas manipulando a retenção interfacial em bioinks líquidos foi relatado até o momento. Apresentamos nosso protocolo aqui para demonstrar uma nova maneira de resolver a sedimentação celular na bioimpressão.
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Protocol
1. Preparação do SF-GelMA carregado de células
- Esterilize todos os materiais utilizando unidades de filtro de seringa de 0,22 μm. Realize todas as etapas em um armário de segurança biológica.
- Aqueça 1x PBS a 50 °C, e dissolva a gelatina no 1x PBS aquecido com agitação. A concentração final de gelatina na PBS deve ser de 10% (w/v).
- Adicione o anidrido de metáclico na solução de gelatina (razão de peso do anidrido de acrílico à gelatina de 0,6 a 1) lentamente com agitação, e misture o complexo por pelo menos 1 h (50 °C). Normalmente, prepare 200 mL de solução de gelatina de 10% com 12 g de anidrido metacrílico; o volume depende das necessidades do estudo.
- Transfira a solução mista contendo gelatina e anidrido de metacrílico para um tubo estéril de 50 mL.
- Centrifugar a solução mista a 3.500 x g. Geralmente leva de 3 a 5 minutos para obter duas camadas. Colete a camada superior (GelMA) e descarte a camada inferior (anidrido de metacrílico não redigido).
- Diluir a solução de camada superior obtida na etapa 1.5 com dois volumes de água deionizada (40-50 °C).
- Dialise a solução obtida na etapa 1.6 com uma membrana de diálise de corte de peso molecular de 12-14 kDa contra água desionizada por 5-7 dias (40-50 °C). Troque a água duas vezes por dia.
- Colete e congele a solução GelMA a −80 °C durante a noite.
- Lyophilize a solução GelMA por 3-5 dias em um secador congelado com a temperatura definida para -45 °C e a pressão definida para 0,2 mbar.
- Dissolver o GelMA liofilizado (grau de substituição de aproximadamente 75%) em 1x PBS contendo 10% FBS (soro bovino fetal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N-etano-ácido sulfônico) e fotoinitiador (0,5%, w/v) para obter a preparação do bioink GelMA.
NOTA: O grau de substituição do GelMA pode ser calculado por um ensaio de ninidrina3. - Misture a solução GelMA (10%, w/v) com diferentes volumes de solução SF inicial (5%, w/v) e diferentes volumes de 1x PBS para obter bioinks SF-GelMA com diferentes concentrações de SF. A proporção por 1 mL de solução de GelMA e SF nos diferentes bioinks é apresentada na Tabela 1.
NOTA: Todos os bioinks devem conter uma concentração final de 5% (p/v) GelMA, mas a concentração de SF varia: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5% (w/v) nos diferentes bioinks SF-GelMA. Use SF-M-Layered-GelMA para denominar o bioink GelMA modificado com SF de forma camada por camada. Use SF-X-GelMA para denominar aqueles GelMA modificados com SF de forma homogênea (por exemplo, GelMA com modificação de 1% de SF foi denominado SF-1-GelMA). - Sonicate todas as bioinks por 10-20 min.
- Cultivar células NIH3T3 utilizando DMEM (meio Águia modificada de Dulbecco) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora (37 °C com 5% de CO2). Passagem das células a uma razão de 1:3 quando a densidade atinge 80%.
- Centrifugar a suspensão das células NIH3T3 a 1500 rpm por 5 min. Remova o supernasal com sucção e resuspenque a pelota celular com solução de bioink fresco em um tubo estéril de 15 mL.
NOTA: A concentração das células encapsuladas no bioink deve ser de 1 x 106 células/mL, e a concentração precisa ser calculada com um citômetro. - Use 2 mL de diferentes bioinks SF-GelMA para suspender as pelotas celulares para obter várias bioinks carregadas de células.
2. Carregamento, reaquecimento e bioimpressão do SF-M-Layered-GelMA
- Carregue 0,4 mL de SF-0,5-GelMA carregado de células na camada inferior da seringa.
NOTA: Utilize uma seringa de 2 mL como reservatório de bioink neste estudo. Carregue diferentes bioinks SF-GelMA na seringa de forma camada por camada. - Coloque a seringa no banho de água gelada (0 °C) por 5 minutos para fazer com que o bioink de camada inferior se transforme em um estado de gel.
- Carregar 0,4 mL de bioink SF-0,75-GelMA carregado de células acima da camada inferior.
- Coloque a seringa com as duas camadas de bioinks em um banho de água gelada (0 °C) por 5 minutos para fazer com que as duas camadas de bioinks se transformem em um estado de gel.
- Pedale as etapas de carga e resfriamento mais 3 vezes com os 3 tipos restantes de bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) para obter um sistema de bioink multicamadas com diferentes concentrações de SF nas diferentes camadas. O volume utilizado para o carregamento de todas as bioinks deve ser de 0,4 mL.
- Reaqueça o bioink multicamadas colocando a seringa em uma incubadora (37 °C) por 30 minutos antes da bioimpressão.
- Use uma seringa de 2 mL como reservatório de bioink com um bocal de impressão de 27 G. Ajuste a velocidade de fluxo em 50 μL/min, a velocidade de movimento do bocal a 2 mm/s e a altura do bocal a 1 mm. Realize o procedimento de bioimpressão à temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C).
- Imprima a construção do tecido de forma extrusiva usando uma bioimpressora personalizada sob os parâmetros adaptados de nossos estudos anteriores11,12.
- Use luz ultravioleta (365 nm, 800 mW) para 40 s para cruzar a construção de tecido bioimpresso.
- Cultura o tecido cruzado construído em DMEM (meio Águia modificada de Dulbecco) contendo 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora (37 °C com 5% de CO2). O meio foi trocado a cada 8h durante os primeiros 2 dias e a cada 2-3 dias depois.
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Representative Results
Um esquema da preparação de bioinks carregados de células é mostrado na Figura 1. Após a preparação dos diferentes bioinks, foram realizados carregamentos, reaquecimentos e bioimpressões(Figura 2). Para avaliar a distribuição das células encapsuladas no reservatório bioink, foi realizado um procedimento de bioimpressão utilizando três bioinks carregados de células diferentes em três placas de 96 poços(Figura 3A). Dois grupos de controle (bioinks GelMA e SF-1-GelMA) e o grupo experimental (bioink SF-M-Layered-GelMA) foram usados para investigar a dispersão das células encapsuladas(Figura 3B). Sessenta microliters de bioink carregado de células foram extrudados em cada poço das três placas de 96 poços. O volume total dos três tipos de bioink foi de 2 mL e, como resultado, o período de bioimpressão foi superior a 30 min. Com a incubação adicional antes da impressão (30 min), o período total de trabalho foi superior a 1 h e foi considerado uma duração de fabricação adequada para bioimpressão de tecidos e órgãos grandes. O número de células nos poços alvo, rotulados na Figura 3A,nas três placas foi contado. A contagem das células em diferentes poços poderia refletir a dispersão das células encapsuladas entre os diferentes grupos. Os resultados mostraram que, à medida que o procedimento de bioimpressão progredia, a densidade de células nos poços alvos diminuiu em todos os grupos. No grupo SF-0-GelMA, aproximadamente 70% das células foram depositadas na camada inferior após o procedimento total. No grupo SF-1-GelMA, aproximadamente 40% das células foram depositadas na camada inferior, e aproximadamente 5% das células foram depositadas na camada superior. No grupo SF-M-Camada-GelMA, a deposição de células encapsuladas foi mais homogênea do que a dos grupos de controle(Figura 3C e 3D).
Figura 1: Esquema da preparação de bioink SF-GelMA. O SF-GelMA foi preparado misturando o complexo de fibroinse de seda (SF) e GelMA/fotoinitiador (PI), seguido de tratamento ultrassônico por 10-20 min. Em seguida, as células-alvo na mistura SF-GelMA foram suspensas para preparar o bioink SF-GelMA carregado de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O procedimento de carga, reaquecimento e bioimpressão. A célula carregada SF-GelMA, como o bioink (aq), foi carregada no reservatório de bioink e transformada no estado gel a partir do procedimento de resfriamento. O procedimento de carregamento e resfriamento foi repetido 5 vezes utilizando os bioinks (aq) com diferentes concentrações de SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5%) para obter SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA). O estado gel SF-M-Layered-GelMA foi reaquecido colocando o bioink em uma incubadora por 30 minutos. O bioink do estado gel se transformou em um estado líquido após a incubação. Em seguida, o bioink preparado foi usado para impressão usando uma seringa de 2 mL como reservatório de bioink com um bocal de impressão de 27 G. A construção do tecido impresso foi interligada usando luz UV. Aq significa solução aquosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O procedimento de bioimpressão utilizou três bioinks carregados de células diferentes. (A), Sessenta microliters de bioink foram extrudados na placa correspondente de 96 poços por minuto, e levou mais de 30 minutos para alcançar o procedimento de bioimpressão na placa de 96 poços. (B) Três tipos diferentes de bioinks foram usados para investigar a dispersão das células encapsuladas no procedimento de bioimpressão: dois grupos de controle (bioinks GelMA e SF-1-GelMA) e o grupo de experimentos (bioink SF-M-Layered-GelMA). (C-D), Densidades celulares dos nº1, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 poços nas três placas foram detectadas com coloração, mostrando a distribuição de células encapsuladas nos três bioinks, e a deposição das células encapsuladas no grupo SF-M-Camada-GelMA foi mais homogênea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Bioinks | Materiais (ml) | ||
| GelMA | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0,75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabela 1: Preparação de bioinks SF-GelMA
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Discussion
A estabilidade do sistema multicamadas é um ponto-chave para executar este protocolo com sucesso. Teoricamente calculamos a difusão de moléculas de SF na solução GelMA baseada no estudo de Nauman13. Verificou-se que a difusão de proteínas em solução estava relacionada ao seu peso molecular. O peso molecular médio (MW) da albumina de soro bovino (BSA) é de 66,5 kDa, e seu coeficiente de difusão é de 64-72 μm2/s. O MW médio de fibrinogênio é de 339,7 kDa, e seu coeficiente de difusão é de 23-34 μm2/s. A média de MW de moléculas de SF em nosso estudo é de aproximadamente 100 kDa. Com base nos resultados do estudo de Nauman, o coeficiente de difusão de uma única molécula de SF está entre 23-72 μm2/s em água a 25 °C. De acordo com a equação de Stokes-Einstein, o coeficiente de difusão é definido da seguinte forma:
onde D é o coeficiente de difusão, K é a consistência, T é a temperatura absoluta, ele é a viscosidade da solução, e d é o diâmetro. Pode-se concluir que a diferença no coeficiente de difusão das moléculas de SF na água e na solução DeMa é determinada pela diferença na viscosidade dessas duas soluções circundantes. Além disso, o raio de difusão pode ser calculado da seguinte forma:
onde R é o raio de difusão, D é o coeficiente de difusão, e T é o tempo de difusão. A água pura apresenta uma viscosidade em 8,9 x 10-4 Pa·s, e a viscosidade de GelMA a taxa zero de corte em nosso estudo foi superior a 1000 Pa·s. Portanto, o raio de difusão de uma única molécula de SF a 25 °C é inferior a 0,66-1,18 μm/hora na solução gelma. Isso indica que o SF dificilmente pode difundir através das camadas adjacentes no sistema SF-M-Layered-GelMA, o que demonstra a estabilidade do sistema multicamadas.
A sedimentação movida pela gravidade das células encapsuladas é inevitável quando a bioimpressão com bioinks semelhantes a líquidos. Em nosso estudo, desenvolvemos uma nova modificação do bioink GelMA de baixa viscosidade com resfriamento cíclico de carregamento para retardar a sedimentação das células, criando retenção interfacial. A retenção interfacial multicamadas deve compensar a ação da gravidade das células encapsuladas e, consequentemente, impedir a sedimentação das células encapsuladas através das camadas adjacentes no reservatório de bioink. A retenção interfacial foi apresentada longitudinalmente no reservatório de bioink entre cada camada adjacente devido à diferença entre o comportamento reológico de diferentes bioinks carregados em diferentes camadas. Essas tensões interfaciais começaram a funcionar assim que as células encapsuladas foram sedimentadas à interface. Como resultado, a tração gravitacional foi compensada, e a sedimentação foi interrompida. Embora este protocolo seja novo, mais aplicações utilizando esse protocolo em outros sistemas de bioink semelhantes a líquidos devem ser estudadas para promoção e otimização.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem bolsas da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81771971, 81970442, 81703470 e 81570422), Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1005002), Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (17JC1400200), Projeto Principal de Ciência e Tecnologia Municipal de Xangai (Grant No. 2017SHZDZX01) e Comissão Municipal de Educação de Xangai (Programa de Inovação 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
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