Summary
Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (gélatine méthacryloyl à faible viscosité) pour empêcher la sédimentation des cellules encapsulées.
Abstract
Pendant le processus de bioimpression tridimensionnell à base d’extrusion, les bioinks liquides à faible viscosité peuvent protéger les cellules contre les dommages membranaires induits par le stress de cisaillement et améliorer la survie des cellules encapsulées. Toutefois, la sédimentation cellulaire rapide par gravité dans le réservoir pourrait entraîner une distribution inhomogène des cellules dans les structures bioimprimées et donc entraver l’application de bioinks semblables à des liquides. Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie modifiée à plusieurs niveaux pour les bioinks liquides (p. ex., le méthacryloyl gélatineux à faible viscosité) pour prévenir la sédimentation des cellules encapsulées. Plusieurs interfaces liquides ont été manipulées dans le bioink multicouches pour fournir la rétention interfaciale. Par conséquent, l’action de sédimentation cellulaire qui traverse les couches adjacentes du système à plusieurs niveaux a été retardée dans le réservoir de bioink. Il a été constaté que la rétention interfaciale était beaucoup plus élevée que l’attraction sédimentaire des cellules, démontrant un rôle critique de la rétention interfaciale dans la prévention de la sédimentation cellulaire et la promotion d’une dispersion plus homogène des cellules dans le bioink multicouches.
Introduction
La bioimpression tridimensionnelle (3D) a été une méthode prometteuse pour fabriquer des répliques architecturales et fonctionnelles complexes de tissus indigènes en biofabrication et en médecine régénérative1,2,3. Les stratégies communes de bioimpression, y compris l’impression à jet d’encre, extrusion et stéréolithographie, ont des avantages et des inconvénients de différentes perspectives4. Parmi ces techniques, la procédure d’extrusion est le plus couramment utilisée en raison de son rapport coût-efficacité. Bioink joue un rôle clé dans la stabilité du processus de bioimpression de l’extrusion. Le bioink idéal chargé de cellules doit non seulement être biocompatible, mais aussi être adapté aux propriétés mécaniques5. Les bioinks à faible viscosité sont généralement présentés comme un état liquide. Ces bioinks peuvent être facilement et rapidement déposés et éviter les dommages à la membrane cellulaire induits par un stress de cisaillement élevé pendant l’extrusion. Cependant, dans les cas complexes nécessitant des périodes d’impression à long terme, la faible viscosité donne souvent lieu à la sédimentation inévitable des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, qui est habituellement entraîné par la gravité et conduit à une dispersion inhomogène des cellules dans le bioink6,7. Par conséquent, un bioink avec dispersion inhomogeneous de cellules entrave la bioimpression in vitro d’une construction fonctionnelle de tissu.
Plusieurs études récentes portant sur les bioinks ont rapporté la promotion de la dispersion homogène des cellules encapsulées. Un bioink d’alginate modifié basé sur le crosslinking à deux étages a été utilisé pour la bioimpression d’extrusion8. Un polymère d’alginate a été modifié avec des peptides et des protéines dans cette étude. Les cellules ont présenté une distribution plus homogène dans cet alginate modifié que dans l’alginate couramment utilisé en raison des sites d’attachement fournis par les peptides et les protéines. Alternativement, les bioinks mélangés ont été utilisés pour résoudre la sédimentation des cellules dans le bioink. Un bioink mélangé contenant du polyéthylène glycol (PEG) et de la gélatine ou de la gélatine méthacryloyl (GelMA) avec une robustesse mécanique améliorée a été utilisé dans une autre étude9. Les cellules encapsulées ont présenté une distribution homogène principalement parce que la viscosité du bioink mélangé a été améliorée. En général, il existe plusieurs facteurs influençant la dispersion des cellules encapsulées dans le bioink, tels que la viscosité du bioink, la gravité des cellules, la densité des cellules et la durée de la période de travail. Parmi ces facteurs, la gravité des cellules joue un rôle essentiel dans la promotion de la sédimentation. La flottabilité et la friction fournies par le bioink visqueux ont été étudiées comme les principales forces contre la gravité à ce jour10.
Ici, nous avons développé une nouvelle stratégie pour promouvoir la dispersion homogène des cellules encapsulées dans le bioink en manipulant plusieurs interfaces liquides dans le réservoir de bioink. Ces interfaces liquides créées par la modification multicouches du bioink peuvent non seulement fournir une rétention interfaciale, ce qui retarde la sédimentation des cellules, mais aussi maintenir une biocompatibilité appropriée et le comportement rhéologique du bioink. Dans la pratique, nous avons modifié la solution aqueuse GelMA (5%, w/v) avec la fibroine de soie (SF) d’une manière multicouches pour produire longitudinalement quatre interfaces, fournissant des tensions interfaciales dans le bioink mélangé. En conséquence, la charge de gravité sur les cellules a été compensée par la tension interfaciale artificielle, et une dispersion presque homogène des cellules encapsulées dans le bioink a été obtenue en raison de moins de sédimentation à travers les couches adjacentes des cellules. Aucun protocole similaire pour ralentir la sédimentation des cellules encapsulées en manipulant la rétention interfaciale dans les bioinks liquides n’a été rapporté à ce jour. Nous présentons notre protocole ici pour démontrer une nouvelle façon de résoudre la sédimentation cellulaire dans la bioimpression.
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Protocol
1. Préparation de SF-GelMA chargé de cellules
- Stériliser tous les matériaux à l’aide d’unités de filtre à seringues de 0,22 μm. Effectuez toutes les étapes d’une armoire de sécurité biologique.
- Chauffer 1x PBS à 50 °C et dissoudre la gélatine dans le PBS chauffé 1x en remuant. La concentration finale de gélatine dans pbs devrait être de 10% (w/v).
- Ajouter lentement l’anhydride méthacrylique dans la solution gélatine (rapport poids de l’anhydride méthacrylique à la gélatine de 0,6 à 1) en remuant, et mélanger le complexe pendant au moins 1 h (50 °C). Typiquement, préparer 200 mL de 10% solution de gélatine avec 12 g d’anhydride méthacrylique; le volume dépend des besoins de l’étude.
- Transférer la solution mélangée contenant de la gélatine et de l’anhydride méthacrylique dans un tube stérile de 50 ml.
- Centrifuge la solution mixte à 3 500 x g. Il faut habituellement 3-5 min pour obtenir deux couches. Recueillir la couche supérieure (GelMA) et jeter la couche inférieure (anhydride méthacrylique non expurgée).
- Diluer la solution de couche supérieure obtenue à l’étape 1.5 avec deux volumes d’eau déionisée (40−50 °C).
- Dialyze la solution obtenue à l’étape 1.6 avec une membrane de dialyse de coupure de poids moléculaire de 12-14 kDa contre l’eau déionisée pendant 5−7 jours (40−50 °C). Changez l’eau deux fois par jour.
- Recueillir et congeler la solution GelMA à −80 °C pendant la nuit.
- Lyophilisez la solution GelMA pendant 3 à 5 jours dans un séchoir à congélation avec une température fixée à -45 °C et la pression réglée à 0,2 mbar.
- Dissoudre le GelMA lyophilisé (degré de substitution d’environ 75%) dans 1x PBS contenant 10 % de FBS (sérum bovin fœtal, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyéthylpiperazine-N-éthane-sulfonic acid), et photoinitiator (0,5 %, w/v) pour obtenir la préparation de bioink gelma.
REMARQUE : Le degré de substitution de GelMA peut être calculé par un essai de ninhydrine3. - Mélanger la solution GelMA (10%, w/v) avec différents volumes de solution SF initiale (5%, w/v) et différents volumes de 1x PBS pour obtenir des bioinks SF-GelMA avec différentes concentrations de SF. La proportion par 1 mL de la solution GelMA et SF dans les différents bioinks est présentée dans le tableau 1.
REMARQUE : Tous les bioinks doivent contenir une concentration finale de 5 % (w/v) gelma, mais la concentration de SF varie : 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 et 1,5 % (w/v) dans les différents bioinks SF-GelMA. Utilisez SF-M-Layered-GelMA pour termer le bioink GelMA modifié avec SF d’une manière couche par couche. Utilisez SF-X-GelMA pour termer ceux GelMA modifié avec SF d’une manière homogène (par exemple, GelMA avec modification de 1% SF a été appelé SF-1-GelMA). - Soniment tous les bioinks pendant 10-20 min.
- Cultiver des cellules NIH3T3 utilisant le DMEM (le milieu Aigle modifié de Dulbecco) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur (37 °C avec 5 % de CO2). Passer les cellules à un rapport de 1:3 lorsque la densité atteint 80%.
- Centrifugez la suspension des cellules NIH3T3 à 1500 tr/min pendant 5 min. Retirez le supernatant avec aspiration et resuspendez le granulé cellulaire avec une solution de bioink fraîche dans un tube stérile de 15 mL.
REMARQUE : La concentration des cellules encapsulées dans le bioink doit être de 1 x 106 cellules/mL, et la concentration doit être calculée à l’aide d’un cytomètre. - Utilisez 2 mL de différents bioinks SF-GelMA pour suspendre les granulés cellulaires afin d’obtenir divers bioinks chargés de cellules.
2. Chargement, réchauffage et bioimpression de la SF-M-Layered-GelMA
- Chargez 0,4 mL de SF-0.5-GelMA chargé de cellules dans la couche inférieure de la seringue.
REMARQUE : Utilisez une seringue de 2 mL comme réservoir de bioink dans cette étude. Chargez différents bioinks SF-GelMA dans la seringue d’une manière couche par couche. - Placez la seringue dans le bain d’eau glacée (0 °C) pendant 5 min pour que le bioink de la couche inférieure se transforme en gel.
- Chargez 0,4 mL de bioink SF-0.75-GelMA chargé de cellules au-dessus de la couche inférieure.
- Placez la seringue avec les deux couches de bioinks dans un bain d’eau glacée (0 °C) pendant 5 min pour que les deux couches de bioinks se transforment en un état de gel.
- Faites le tour des étapes de chargement et de refroidissement 3 fois de plus avec les 3 autres types de bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) pour obtenir un système de bioink multicouches avec différentes concentrations de SF dans les différentes couches. Le volume utilisé pour le chargement de tous les bioinks doit être de 0,4 mL.
- Réchauffer le bioink multicouches en plaçant la seringue dans un incubateur (37 °C) pendant 30 min avant la bioimpression.
- Utilisez une seringue de 2 mL comme réservoir de bioink avec une buse d’impression de 27 G. Réglez la vitesse d’écoulement à 50 μL/min, la vitesse de déplacement de la buse à 2 mm/s et la hauteur de la buse à 1 mm. Effectuer la procédure de bioimpression à température ambiante (environ 20 °C).
- Imprimez la construction tissulaire d’une manière extrusion à l’aide d’un bioimprimeur sur mesure sous les paramètres adaptés de nos études précédentes11,12.
- Utilisez la lumière ultraviolette (365 nm, 800 mW) pendant 40 s pour relier la construction de tissu bioimprimé.
- Culture de la construction de tissus croisés dans DMEM (le milieu aigle modifié de Dulbecco) contenant 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine dans un incubateur (37 °C avec 5% de CO2). Le milieu a été changé tous les 8 h pendant les 2 premiers jours et tous les 2-3 jours par la suite.
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Representative Results
Un schéma de préparation des bioinks chargés de cellules est illustré à la figure 1. Après la préparation des différents bioinks, le chargement, le réchauffage et la bioimpression ont été effectués (figure 2). Pour évaluer la distribution des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, une procédure de bioimpression a été effectuée à l’aide de trois bioinks différents chargés de cellules dans trois plaques de 96 puits (figure 3A). Deux groupes témoins (gelma vierge et bioinks SF-1-GelMA) et le groupe expérimental (bioink SF-M-Lated-GelMA) ont été utilisés pour étudier la dispersion des cellules encapsulées (figure 3B). Soixante microlitres de bioink chargé de cellules ont été extrudés dans chaque puits des trois plaques de 96 puits. Le volume total des trois types de bioink était de 2 mL, et par conséquent, la période de bioimpression était de plus de 30 min. Avec l’incubation supplémentaire avant l’impression (30 min), la période de travail totale était de plus de 1 h et a été considérée comme une durée de fabrication appropriée pour la bioimpression de grands tissus et organes. Le nombre de cellules dans les puits cibles, étiquetés à la figure 3A, dans les trois plaques a été compté. Le nombre des cellules dans différents puits pourrait refléter la dispersion des cellules encapsulées entre les différents groupes. Les résultats ont montré qu’au fur et à mesure que la procédure de bioimpression progressait, la densité des cellules dans les puits cibles diminuait dans tous les groupes. Dans le groupe SF-0-GelMA, environ 70% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure après la procédure totale. Dans le groupe SF-1-GelMA, environ 40% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure, et environ 5% des cellules ont été déposées dans la couche supérieure. Dans le groupe SF-M-Latches-GelMA, le dépôt de cellules encapsulées était plus homogène que celui des groupes témoins (figure 3C et 3D).
Figure 1 : Schéma de la préparation des bioinks SF-GelMA. Le SF-GelMA a été préparé en mélangeant la fibroine de soie (SF) et le complexe GelMA/photoinitiator (PI) suivi d’un traitement ultrasonique pendant 10-20 min. Ensuite, les cellules cibles du mélange SF-GelMA ont été suspendues pour préparer le bioink SF-GelMA chargé de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Procédure de chargement, de réchauffage et de bioimpression. La cellule chargée SF-GelMA, comme le bioink (aq), a été chargé dans le réservoir de bioink et transformé en l’état de gel de la procédure de refroidissement. La procédure de chargement et de refroidissement a été répétée 5 fois à l’aide des bioinks (aq) avec différentes concentrations de SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 et 1,5%) pour obtenir SF-Multicouchered-GelMA (SF-M-Latches-GelMA). L’état de gel SF-M-Latated-GelMA a été réchauffé en plaçant le bioink dans un incubateur pendant 30 min. Le bioink d’état de gel s’est transformé en état liquide après incubation. Ensuite, le bioink préparé a été utilisé pour l’impression à l’aide d’une seringue de 2 mL comme réservoir de bioink avec une buse d’impression de 27 G. La construction de tissu imprimé a été croisée en utilisant la lumière UV. Aq signifie solution aqueuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La procédure de bioimpression a utilisé trois bioinks différents chargés de cellules. (A), Soixante microlitres de bioink ont été extrudés dans la plaque correspondante de 96 puits par minute, et il a fallu plus de 30 minutes pour réaliser la procédure de bioimpression dans la plaque de 96 puits. (B), Trois types différents de bioinks ont été utilisés pour étudier la dispersion des cellules encapsulées dans la procédure de bioimpression : deux groupes témoins (gelma vierge et bioinks SF-1-GelMA) et le groupe d’expérimentation (bioink SF-M-Latches-GelMA). (C-D), Les densités cellulaires des puits no 1, 5, 10, 15, 20, 25 et 30 dans les trois plaques ont été détectées avec coloration, montrant la distribution des cellules encapsulées dans les trois bioinks, et le dépôt des cellules encapsulées dans le groupe SF-M-Lated-GelMA était plus homogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Bioinks | Matériaux (ml) | ||
| GelMA | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tableau 1 : Préparation des bioinks SF-GelMA
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Discussion
La stabilité du système multicouches est un point clé pour effectuer ce protocole avec succès. Nous avons théoriquement calculé la diffusion des molécules SF dans la solution GelMA sur la base de l’étude de Nauman13. Il a été constaté que la diffusion des protéines dans la solution était liée à leur poids moléculaire. Le poids moléculaire moyen (MW) de l’albumine de sérum bovin (BSA) est de 66,5 kDa, et son coefficient de diffusion est de 64-72 μm2/s. Le MW moyen de fibrinogène est de 339,7 kDa, et son coefficient de diffusion est de 23-34 μm2/s. Le MW moyen de molécules SF dans notre étude est d’environ 100 kDa. D’après les résultats de l’étude de Nauman, le coefficient de diffusion d’une seule molécule de SF se situe entre 23 et 72 μm2/sdans l’eau à 25 °C. Selon l’équation de Stokes-Einstein, le coefficient de diffusion est défini comme suit :
où D est le coefficient de diffusion, K est la consistance, T est la température absolue, η est la viscosité de la solution, et d est le diamètre. On peut conclure que la différence dans le coefficient de diffusion des molécules sf dans l’eau et dans la solution GelMA est déterminée par la différence de viscosité de ces deux solutions environnantes. En outre, le rayon de diffusion peut être calculé comme suit:
où R est le rayon de diffusion, D est le coefficient de diffusion, et T est le temps de diffusion. L’eau pure présente une viscosité à 8,9 x 10-4 Pa·s, et la viscosité de GelMA à taux de cisaillement zéro dans notre étude était supérieure à 1000 Pa·s. Par conséquent, le rayon de diffusion d’une seule molécule de SF à 25 °C est inférieur à 0,66-1,18 μm/heure dans la solution GelMA. Cela indique que SF peut difficilement diffuser à travers les couches adjacentes dans le système SF-M-Latches-GelMA, ce qui démontre la stabilité du système multicouche.
La sédimentation par gravité des cellules encapsulées est inévitable lors de la bioimpression avec des bioinks liquides. Dans notre étude, nous avons développé une nouvelle modification de la faible viscosité GelMA bioink avec le chargement cyclique-refroidissement pour retarder la sédimentation des cellules en créant la rétention interfaciale. La rétention interfaciale multicouches est censée compenser l’action de gravité des cellules encapsulées et, par conséquent, empêcher la sédimentation des cellules encapsulées à travers les couches adjacentes dans le réservoir de bioink. La rétention interfaciale a été présentée longitudinalement dans le réservoir de bioink entre chaque couche adjacente en raison de la différence entre le comportement rhéologique de différents bioinks chargés dans différentes couches. Ces tensions interfaciales ont commencé à fonctionner dès que les cellules encapsulées se sont sédimentées à l’interface. En conséquence, la traction de gravité a été décalée, et la sédimentation a été arrêtée. Bien que ce protocole soit nouveau, plus d’applications utilisant ce protocole dans d’autres systèmes de bioink liquides devraient être étudiées pour la promotion et l’optimisation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent les subventions de la National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 et 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC10050002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01), et Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
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