Summary
Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation von verkapselten Zellen zu verhindern.
Abstract
Während des extrusionsbasierten dreidimensionalen Bioprinting-Prozesses können flüssigkeitsähnliche Bioinken mit geringer Viskosität Zellen vor Membranschäden schützen, die durch Scherspannung verursacht werden, und das Überleben der verkapselten Zellen verbessern. Eine schnelle gravitationsgetriebene Zellsedimentation im Reservoir könnte jedoch zu einer inhomogenen Zellverteilung in biobedruckten Strukturen führen und somit die Anwendung flüssigkeitsähnlicher Bioinks behindern. Hier haben wir eine neuartige mehrschichtige modifizierte Strategie für flüssigkeitsähnliche Bioinken (z.B. Gelatinemethacryloyl mit niedriger Viskosität) entwickelt, um die Sedimentation verkapselter Zellen zu verhindern. Mehrere flüssigkeitsnahe Schnittstellen wurden im vielschichtigen Bioink manipuliert, um die Grenzflächenretention zu gewährleisten. Folglich wurde die Zellsedimentationswirkung, die sich über benachbarte Schichten im mehrschichtigen System erstreckte, im Bioinkreservoir verzögert. Es wurde festgestellt, dass die Grenzflächenretention viel höher war als die Sedimentzugvon Zellen, was eine entscheidende Rolle der Grenzflächenretention bei der Verhinderung von Zellsedimentation und der Förderung einer homogeneren Dispersion von Zellen im vielschichtigen Bioink zeigt.
Introduction
Der dreidimensionale (3D) Bioprinting war eine vielversprechende Methode zur Herstellung komplexer architektonischer und funktioneller Nachbildungen von nativen Geweben in der Biofabrikation und regenerativen Medizin1,2,3. Die gängigen Strategien des Bioprintings, einschließlich Inkjet-, Extrusions- und Stereolithographiedruck, haben Vor- und Nachteile aus verschiedenen Perspektiven4. Unter diesen Techniken wird das Extrusionsverfahren aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit am häufigsten verwendet. Bioink spielt eine Schlüsselrolle bei der Prozessstabilität des Extrusionsbioprintings. Der ideale zellbeladene Bioink sollte nicht nur biokompatibel, sondern auch für mechanischeEigenschaften5 geeignet sein. Bioinks mit niedriger Viskosität werden in der Regel als flüssigkeitsähnlicher Zustand dargestellt. Diese Bioinks können einfach und schnell abgelagert werden und zellmembranbedingte Schäden vermeiden, die durch hohe Scherspannung während der Extrusion verursacht werden. In komplexen Fällen, die langfristige Druckzeiten erfordern, führt jedoch eine niedrige Viskosität häufig zur unvermeidlichen Sedimentation der verkapselten Zellen im Bioinkreservoir, die in der Regel durch die Schwerkraft angetrieben wird und zu einer inhomogenen Zelldispersion im Bioinkführt 6,7. Folglich behindert ein Bioink mit inhomogener Zelldispergität den In-vitro-Bioprinting eines funktionellen Gewebekonstrukts.
Mehrere neuere Studien, die sich auf Bioinks konzentrieren, haben die Förderung der homogenen Dispergität von verkapselten Zellen berichtet. Für den Extrusionsbioprinting8wurde ein modifizierter Alginatbioink auf Basis einer zweistufigen Vernetzung verwendet. Ein Alginatpolymer wurde in dieser Studie mit Peptiden und Proteinen modifiziert. Zellen zeigten eine homogenere Verteilung in diesem modifizierten Alginat als in dem häufig verwendeten Alginat aufgrund der Anbaustellen, die von den Peptiden und den Proteinen bereitgestellt werden. Alternativ wurden gemischte Bioinks verwendet, um die Sedimentation von Zellen in Bioink zu lösen. In einer weiteren Studie wurde ein gemischter Bioink mit Polyethylenglykol (PEG) und Gelatine- oder Gelatinemethacryloyl (GelMA) mit verbesserter mechanischer Robustheit verwendet9. Die gekapselten Zellen zeigten eine homogene Verteilung vor allem, weil die Viskosität des gemischten Bioinks verbessert wurde. Im Allgemeinen gibt es mehrere Faktoren, die die Dispergität der verkapselten Zellen im Bioink beeinflussen, wie die Viskosität des Bioinks, die Schwerkraft der Zellen, die Dichte der Zellen und die Dauer der Arbeitszeit. Unter diesen Faktoren spielt die Schwerkraft von Zellen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Sedimentation. Der Auftrieb und die Reibung, die der zähflüssige Bioink bietet, wurden bisher als Hauptkräfte gegen die Schwerkraft untersucht10.
Hierbei haben wir eine neuartige Strategie entwickelt, um die homogene Dispergität der verkapselten Zellen in Bioink zu fördern, indem wir mehrere flüssige Schnittstellen im Bioink-Reservoir manipulieren. Diese flüssigen Schnittstellen, die durch die vielschichtige Modifikation des Bioinks entstehen, können nicht nur grenzflächenretentionsfähig sein, was die Sedimentation von Zellen verzögert, sondern auch eine geeignete Biokompatibilität und rheologisches Verhalten des Bioinks aufrechterhalten. In der Praxis haben wir die wässrige GelMA-Lösung (5%, w/v) mit Seidenfibroin (SF) in vielschichtiger Weise modifiziert, um längs vier Schnittstellen zu erzeugen, die Grenzflächenspannungen im gemischten Bioink erzeugen. Dadurch wurde die Schwerkraftbelastung der Zellen durch die vom Menschen hergestellte Grenzflächenspannung kompensiert, und eine nahezu homogene Dispersion der verkapselten Zellen im Bioink wurde durch weniger Sedimentation über die angrenzenden Zellschichten hinweg erzielt. Bisher wurde kein ähnliches Protokoll zur Verlangsamung der Sedimentation von verkapselten Zellen durch Manipulation der Grenzflächenretention in flüssigen Bioinks berichtet. Wir stellen hier unser Protokoll vor, um eine neue Möglichkeit zur Lösung der Zellsedimentation im Bioprinting aufzuzeigen.
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Protocol
1. Vorbereitung von zellbeladenem SF-GelMA
- Sterilisieren Sie alle Materialien mit 0,22 m Spritzenfiltereinheiten. Führen Sie alle Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank aus.
- 1x PBS auf 50 °C erwärmen und Gelatine in der erhitzten 1x PBS unter Rühren auflösen. Die Endkonzentration von Gelatine in PBS sollte 10% (w/v) betragen.
- Methacrylanhydrid unter Rühren langsam in die Gelatinelösung (Gewichtsverhältnis von Methacrylanhydrid zu Gelatine von 0,6 bis 1) geben und den Komplex mindestens 1 h (50 °C) mischen. In der Regel bereiten Sie 200 ml 10% Gelatinelösung mit 12 g Methacrylanhydrid; das Volumen hängt von den Bedürfnissen der Studie ab.
- Die gemischte Lösung mit Gelatine und Methacrylanhydrid in ein 50 ml steriles Rohr geben.
- Zentrifugieren Sie die Mischlösung bei 3.500 x g. Es dauert in der Regel 3-5 min, um zwei Schichten zu erhalten. Sammeln Sie die obere Schicht (GelMA) und entsorgen Sie die untere Schicht (unreagiertemethacrylanhydrid).
- Verdünnen Sie die in Schritt 1.5 erhaltene Lösung der oberen Schicht mit zwei Volumen entionisiertem Wasser (40 bis 50 °C).
- Dialyse die in Schritt 1.6 erhaltene Lösung mit einer 12-14 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran gegen entionisiertes Wasser für 5 bis 7 Tage (40 bis 50 °C). Wechseln Sie das Wasser zweimal täglich.
- Sammeln und einfrieren Sie die GelMA-Lösung bei 80 °C über Nacht.
- Lyophilisieren Sie die GelMA-Lösung für 3 bis 5 Tage in einem Gefriertrockner mit einer Temperatur von -45 °C und einem Druck von 0,2 mbar.
- Lösen Sie das lyophilisierte GelMA (Substitutionsgrad von ca. 75%) in 1x PBS mit 10% FBS (fetales Rinderserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-Ethan-Sulfonsäure) und Photoinitiator (0,5%, w/v), um das GelMA-Bioinkpräparat zu erhalten.
HINWEIS: Der Grad der Substitution von GelMA kann durch einen Ninhydrin-Assay3berechnet werden. - Mischen Sie die GelMA-Lösung (10%, w/v) mit unterschiedlichen Volumina der anfänglichen SF-Lösung (5%, w/v) und verschiedenen Volumina von 1x PBS, um SF-GelMA-Bioinks mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen zu erhalten. Der Anteil pro 1 ml GelMA- und SF-Lösung in den verschiedenen Bioinks ist in Tabelle 1dargestellt.
HINWEIS: Alle Biotinten müssen eine Endkonzentration von 5% (w/v) GelMA enthalten, aber die Konzentration von SF variiert: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 und 1,5% (w/v) in den verschiedenen SF-GelMA-Biotinten. Verwenden Sie SF-M-Layered-GelMA, um den mit SF modifizierten GelMA-Bioink Schicht für Schicht zu bezeichnen. Verwenden Sie SF-X-GelMA, um die mit SF modifizierten GelMA homogen zu bezeichnen (z. B. wurde GelMA mit Modifikation von 1% SF als SF-1-GelMA bezeichnet). - Beschallen Sie alle Bioinks für 10-20 min.
- Wachsen Sie NIH3T3-Zellen mit DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%CO2). Durchfahrt der Zellen im Verhältnis 1:3, wenn die Dichte 80% erreicht.
- Zentrifugieren Sie die Suspension von NIH3T3-Zellen bei 1500 U/min für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit Absaugung und setzen Sie das Zellpellet mit frischer Bioinklösung in einem 15 ml sterilen Rohr wieder auf.
HINWEIS: Die Konzentration der gekapselten Zellen im Bioink sollte 1 x 106 Zellen/ml betragen, und die Konzentration muss mit einem Zytometer berechnet werden. - Verwenden Sie 2 ml verschiedene SF-GelMA Bioinks, um die Zellpellets aufzuhängen, um verschiedene zellbeladene Bioinks zu erhalten.
2. Laden, Aufheizen und Bioprinting des SF-M-Layered-GelMA
- 0,4 ml zellbeladenes SF-0.5-GelMA in die untere Schicht der Spritze geben.
HINWEIS: Verwenden Sie in dieser Studie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir. Legen Sie verschiedene SF-GelMA-Bioinks Schicht für Schicht in die Spritze. - Legen Sie die Spritze in ein Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, damit sich der Bioink der Bodenschicht in einen Gelzustand verwandelt.
- 0,4 ml zellbeladenen SF-0.75-GelMA-Bioinks über die untere Schicht laden.
- Legen Sie die Spritze mit den beiden Schichten Von Bioinks in einem Eiswasserbad (0 °C) für 5 min, um die beiden Schichten von Bioinks in einen Gelzustand zu verwandeln.
- Fahren Sie die Lade- und Kühlschritte noch 3 Mal mit den restlichen 3 Arten von Biotinten (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) um ein mehrschichtiges Bioinksystem mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen in den verschiedenen Schichten zu erhalten. Das Volumen, das für die Beladung aller Bioinks verwendet wird, sollte 0,4 ml betragen.
- Erhitzen Sie den mehrschichtigen Bioink, indem Sie die Spritze 30 min vor dem Bioprinting in einen Inkubator (37 °C) geben.
- Verwenden Sie eine 2 ml Spritze als Bioinkreservoir mit einer 27 G Druckdüse. Stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 50 l/min, die Bewegungsgeschwindigkeit der Düse auf 2 mm/s und die Düsenhöhe auf 1 mm. Führen Sie den Bioprinting-Vorgang bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) durch.
- Drucken Sie das Gewebekonstrukt extrusionsfrei mit einem maßgeschneiderten Bioprinter unter den Parametern, die aus unseren früheren Studien11,12angepasst wurden.
- Verwenden Sie ultraviolettes Licht (365 nm, 800 mW) für 40 s, um das biogedruckte Gewebekonstrukt zu vernetzen.
- Kultur das vernetzte Gewebekonstrukt in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium), das 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator enthält (37 °C mit 5%CO2). Das Medium wurde in den ersten 2 Tagen alle 8 stunden und danach alle 2-3 Tage gewechselt.
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Representative Results
Ein Schema der Herstellung von zellbeladenen Bioinks ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Vorbereitung der verschiedenen Bioinks wurden Beladung, Aufwärmen und Bioprinting durchgeführt (Abbildung 2). Um die Verteilung der gekapselten Zellen im Bioinkreservoir zu bewerten, wurde ein Bioprinting-Verfahren mit drei verschiedenen zellbeladenen Bioinks in drei 96-Well-Platten durchgeführt (Abbildung 3A). Zwei Kontrollgruppen (Pristine GelMA und SF-1-GelMA Bioinks) und die Versuchsgruppe (SF-M-Layered-GelMA bioink) wurden verwendet, um die Dispergität der gekapselten Zellen zu untersuchen (Abbildung 3B). Sechzig Mikroliter zellbeladener Bioink wurden in jedem Brunnen der drei 96-Well-Platten extrudiert. Das Gesamtvolumen der drei Arten von Bioink betrug 2 ml, und als Ergebnis betrug die Periode des Bioprintings mehr als 30 min. Mit der zusätzlichen Inkubation vor dem Druck (30 min) betrug die Gesamtarbeitszeit mehr als 1 h und wurde als geeignete Herstellungsdauer für den Bioprinting großer Gewebe und Organe angesehen. Die Anzahl der Zellen in den Zielbrunnen, die in Abbildung 3Abeschriftet sind, wurde in den drei Platten gezählt. Die Anzahl der Zellen in verschiedenen Brunnen könnte die Dispergität der gekapselten Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen widerspiegeln. Die Ergebnisse zeigten, dass im Verlauf des Bioprinting-Verfahrens die Dichte der Zellen in den Zielbrunnen in allen Gruppen abnahm. In der SF-0-GelMA-Gruppe wurden nach dem gesamten Eingriff etwa 70% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert. In der SF-1-GelMA-Gruppe wurden etwa 40% der Zellen in der unteren Schicht abgelagert, und etwa 5% der Zellen wurden in der oberen Schicht abgelagert. In der SF-M-Layered-GelMA-Gruppe war die Ablagerung von gekapselten Zellen homogener als die der Kontrollgruppen(Abbildung 3C und 3D).
Abbildung 1: Schemader der SF-GelMA Bioinkpräparation. Das SF-GelMA wurde durch Mischen des Seidenfibroins (SF) und des GelMA/Photoinitiators (PI) komplex, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung für 10-20 min, hergestellt. Anschließend wurden die Zielzellen in der SF-GelMA-Mischung suspendiert, um den zellbeladenen SF-GelMA-Bioink vorzubereiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das Lade-, Aufheizen und Bioprinting-Verfahren. Das zellbeladene SF-GelMA als Bioink (aq) wurde in das Bioinkreservoir geladen und aus dem Kühlverfahren in den Gelzustand umgewandelt. Das Be- und Abkühlverfahren wurde 5 Mal mit den Bioinks (aq) mit unterschiedlichen SF-Konzentrationen (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 und 1,5 %) wiederholt. SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA) zu erhalten. Der Gelzustand SF-M-Layered-GelMA wurde durch 30 min in einem Inkubator aufgewärmt. Der Gelzustand Bioink verwandelte sich in einen flüssigen Zustand nach der Inkubation. Anschließend wurde die vorbereitete Bioink zum Drucken mit einer 2 ml Spritze als Bioinkbehälter mit 27 G Druckdüse verwendet. Das gedruckte Gewebekonstrukt wurde mit UV-Licht vernetzt. Aq bedeutet wässrige Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Das Bioprinting-Verfahren verwendete drei verschiedene zellbeladene Bioinks. (A) 60 Mikroliter Bioink wurden pro Minute in die entsprechende 96-Well-Platte extrudiert, und es dauerte mehr als 30 Min. bis das Bioprinting-Verfahren in der 96-Well-Platte dauerte. (B) Drei verschiedene Arten von Bioinks wurden verwendet, um die Dispergität der gekapselten Zellen im Bioprinting-Verfahren zu untersuchen: zwei Kontrollgruppen (pristine GelMA und SF-1-GelMA bioinks) und die Experimentiergruppe (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), Zelldichten der Brunnen Nr. 1, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 in den drei Platten wurden mit Färbung nachgewiesen, was die Verteilung der verkapselten Zellen in den drei Bioinks zeigt, und die Ablagerung der verkapselten Zellen in der SF-M-Layered-GelMA-Gruppe war homogener. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bioinks | Materialien (ml) | ||
| GelMA | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabelle 1: Herstellung von SF-GelMA Bioinks
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Discussion
Die Stabilität des mehrschichtigen Systems ist ein wichtiger Punkt, um dieses Protokoll erfolgreich auszuführen. Theoretisch berechneten wir die Diffusion von SF-Molekülen in der GelMA-Lösung auf Basis von Naumans Studie13. Es wurde festgestellt, dass die Diffusion von Proteinen in Lösung mit ihrem Molekulargewicht zusammenhängt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (MW) des Rinderserumalbumins (BSA) beträgt 66,5 kDa und sein Diffusionskoeffizient liegt bei 64-72 m2/s. Der durchschnittliche MW Fibrinogen beträgt 339,7 kDa, und sein Diffusionskoeffizient beträgt 23-34 m2/s. Die durchschnittliche MW von SF-Molekülen in unserer Studie beträgt etwa 100 kDa. Basierend auf den Ergebnissen der Nauman-Studie liegt der Diffusionskoeffizient eines einzelnen SF-Moleküls zwischen 23-72 m2/sin Wasser bei 25 °C. Gemäß der Stokes-Einstein-Gleichung wird der Diffusionskoeffizient wie folgt definiert:
wobei D der Diffusionskoeffizient ist, K die Konsistenz, T die absolute Temperatur, b die Viskosität der Lösung und d der Durchmesser. Daraus kann geschlossen werden, dass der Unterschied im Diffusionskoeffizienten von SF-Molekülen in Wasser und in GelMA-Lösung durch den Viskositätsunterschied dieser beiden umgebenden Lösungen bestimmt wird. Darüber hinaus kann der Diffusionsradius wie folgt berechnet werden:
wobei R der Diffusionsradius, D der Diffusionskoeffizient und T die Diffusionszeit ist. Reines Wasser weist eine Viskosität bei 8,9 x 10-4 Paes auf, und die Viskosität von GelMA bei null Scherrate lag in unserer Studie über 1000 Pa's. Daher liegt der Diffusionsradius eines einzelnen SF-Moleküls bei 25 °C in der GelMA-Lösung unter 0,66-1,18 m/Stunde. Dies deutet darauf hin, dass SF im SF-M-Layered-GelMA-System kaum über die angrenzenden Schichten diffundieren kann, was die Stabilität des mehrschichtigen Systems demonstriert.
Die schwerkraftgetriebene Sedimentation der verkapselten Zellen ist beim Biosprint mit flüssigkeitsähnlichen Bioinks unvermeidlich. In unserer Studie haben wir eine neuartige Modifikation von GelMA-Bioink mit niedriger Viskosität mit zyklischer Beladungentwickelt entwickelt, um die Sedimentation von Zellen durch die Bildung einer Grenzflächenretention zu verzögern. Die mehrschichtige Grenzflächenretention soll die Wirkung der Schwerkraft der verkapselten Zellen ausgleichen und damit die Sedimentation der verkapselten Zellen über die angrenzenden Schichten im Bioinkreservoir verhindern. Die Grenzflächenretention wurde längs im Bioinkreservoir zwischen jeder angrenzenden Schicht dargestellt, da das rheologische Verhalten verschiedener Inze in verschiedenen Schichten belastet war. Diese Grenzflächenspannungen begannen zu funktionieren, sobald sich die verkapselten Zellen an die Schnittstelle sedimentierten. In der Folge wurde der Gravitationszug versetzt und die Sedimentation gestoppt. Obwohl dieses Protokoll neu ist, sollten mehr Anwendungen, die dieses Protokoll in anderen flüssigkeitsähnlichen Bioinksystemen verwenden, für die Förderung und Optimierung untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 und 81570422), National Key F&E-Programm chinas (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) und Shanghai Municipal Education Commission (Innovationsprogramm 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
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