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Bioengineering

在三维生物打印中使用多层水凝胶生物油墨,实现均匀细胞分布

doi: 10.3791/60920 Published: May 2, 2020

Summary

在这里,我们开发了一种新的多层改性策略,用于液体样生物油墨(低粘度的明胶甲酰胺),以防止封装细胞的沉淀。

Abstract

在基于挤出的三维生物打印过程中,粘度低的液体样生物油墨可以保护细胞免受剪切应力引起的膜损伤,提高封装细胞的存活率。然而,储层中快速重力驱动的细胞沉降可能导致生物印刷结构中不均匀的细胞分布,从而阻碍液体样生物油墨的应用。在这里,我们开发了一种新的多层改性策略,用于液体样生物油墨(例如,低粘度的明胶甲酰胺醇),以防止封装细胞的沉淀。多层生物油墨中操纵了多个液体界面,以提供界面间保留。因此,在生物油墨储层中,跨多层系统中相邻层的细胞沉降作用被阻滞。结果发现,界面保留率远远高于细胞的沉积拉力,表明界面保留在防止细胞沉淀和促进细胞在多层生物油墨中更均匀地分散的作用。

Introduction

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三维(3D)生物印刷是生物制造和再生医学11、2、32,3中原生组织复杂建筑和功能复制品的一种有前途的方法。生物印刷的常见策略,包括喷墨、挤出和立体光刻印刷,从不同角度有优缺点在这些技术中,挤出过程因其成本效益而最为常见。生物油墨在挤出生物印刷的工艺稳定性中起着关键作用。理想的细胞载生物油墨不仅应具有生物相容性,而且应适用于机械特性5。粘度低的生物油墨通常呈现为液体状状态。这些生物油墨易于快速沉积,避免在挤出过程中因高剪切应力引起的细胞膜损伤。然而,在需要长期印刷期的复杂情况下,低粘度往往导致生物油墨储液罐中封装细胞不可避免的沉淀,通常由重力驱动,导致生物油墨66、77中的不均匀细胞分散。因此,具有不均匀细胞分散的生物油墨阻碍了功能组织结构的体外生物打印。

最近几项以生物油墨为重点的研究都报道了封装细胞的同质分散性。一种基于双级交联的改性藻酸盐生物油墨用于挤出生物印刷8。在这项研究中,一种藻酸盐聚合物被用肽和蛋白质进行了改性。由于肽和蛋白质提供的附着位点,细胞在这种改良的藻酸盐中呈现比常用的藻酸盐更均匀分布。另外,混合生物油墨也被用来解决生物油墨中细胞的沉淀问题。另一项研究9中使用了含有聚乙烯乙二醇(PEG)和明胶或明胶二甲酰胺醇(GelMA)的混合生物油墨,具有更好的机械鲁棒性。封装的细胞呈现均匀分布,主要是因为混合生物油墨的粘度得到了提高。一般来说,影响生物油墨中封装细胞分散性的因素有若干,如生物油墨的粘度、细胞的重力、细胞的密度和工作周期。在这些因素中,细胞的引力在促进沉积中起着至关重要的作用。粘稠生物油墨提供的浮力和摩擦力已作为对抗重力的主要力量,迄今已于10日调查。

在这里,我们开发了一种新的策略,通过操纵生物油墨储液罐中的多个液体接口,促进生物油墨中封装细胞的均匀分散。生物油墨的多层修饰产生的这些液体界面不仅可以提供界面保留,延缓细胞的沉淀,还能保持生物油墨适宜的生物相容性和流变行为。在实践中,我们用多层方式修改了与丝纤维素(SF)的水性GelMA溶液(5%,w/v),纵向产生四个界面,在混合生物油墨中提供界面张力。因此,由于相邻细胞层的沉淀较少,细胞上的重力负荷被人为的界面张力所抵消,生物油墨中封装的细胞几乎均匀地分散。迄今为止,还没有类似的协议通过操纵液体生物油墨中的界面保留来减缓封装细胞的沉淀。我们在这里介绍我们的协议,以演示一种解决生物印刷中细胞沉淀的新方法。

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Protocol

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1. 制备装有细胞的SF-GelMA

  1. 使用 0.22 μm 注射器过滤器单元对所有材料进行消毒。在生物安全柜中执行所有步骤。
  2. 将 1x PBS 加热到 50°C,并在加热的 1x PBS 中搅拌溶解明胶。PBS 中明胶的最终浓度应为 10%(v/ v)。
  3. 在明胶溶液中加入甲基苯丙胺(甲基苯丙胺氢化物的重量比为0.6比1)缓慢搅拌,并将复合体混合至少1小时(50°C)。通常,用12克的甲基苯丙胺丙胺制备200 mL的10%明胶溶液;音量取决于研究的需要。
  4. 将含有明胶和甲基丙烯酸酯的混合溶液转移到50 mL无菌管中。
  5. 以 3,500 x g的离心式混合溶液。通常需要 3-5 分钟才能获得两层。收集上层 (GelMA) 并丢弃底层(未反应的甲基苯丙胺。
  6. 用两卷去离子水(40~50°C)稀释步骤 1.5 中获得的上层溶液。
  7. 在步骤 1.6 中获得的解决方案与 12-14 kDa 分子量切断透析膜,对去离子水进行 5⁄7 天(40~50 °C)的透析膜。每天换两次水。
  8. 在 +80°C 下收集和冷冻 GelMA 溶液过夜。
  9. 在冷冻干燥器中,将 GelMA 溶液 ly菲化 3-5 天,温度设置为 -45 °C,压力设置为 0.2 mbar。
  10. 溶解冻干凝胶(替代程度约75%)在含有10%FBS(胎儿牛血清,v/v)的1x PBS中,25 mM HEPES(N-2-羟基苯丙胺-N-乙烷-硫化酸),和光子炎剂(0.5%,w/v)获得GelMA生物油墨制备。
    注:GelMA的替代程度可以通过宁二德林测定3计算。
  11. 将 GelMA 溶液(10%,v)与不同数量的初始 SF 溶液(5%,v)和不同体积的 1x PBS 混合,以获得不同浓度的 SF 的 SF-GelMA 生物油墨。表1中介绍了不同生物油墨中每1 mL的GelMA和SF溶液的比例。
    注:所有生物油墨必须包含 5% (w/v) 凝胶MA的最终浓度,但 SF 的浓度因色变化:不同 SF-GelMA 生物油墨中的 0.5、0.75、1.0、1.25 和 1.5%(v)。使用 SF-M 层-凝胶MA 以逐层方式使用 SF 修改的 GelMA 生物油墨。使用 SF-X-GelMA 以同质方式用 SF 对凝胶MA 进行术语(例如,修改为 1% SF 的 GelMA 称为 SF-1-GelMA)。
  12. 将所有生物墨水声波10-20分钟。
  13. 使用含有10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM(Dulbecco的改良鹰中)在培养箱中生长NIH3T3细胞(37°C,含5%CO2)。当密度达到80%时,以1:3的比例通过细胞。
  14. 将NIH3T3细胞悬浮液在1500 rpm下离心5分钟。用吸力去除上清液,并在15 mL无菌管中用新鲜的生物墨水溶液重新悬浮细胞颗粒。
    注:生物油墨中封装的细胞浓度应为1 x 106细胞/mL,浓度需要用细胞计计算。
  15. 使用 2 mL 的不同 SF-GelMA 生物墨水来悬浮细胞颗粒,以获得各种充满细胞的生物墨水。

2. SF-M-层-凝胶层的装载、再加热和生物印刷

  1. 将0.4 mL的细胞载重SF-0.5-GelMA加载到注射器的底层。
    注:在本研究中,使用 2 mL 注射器作为生物墨水储液罐。以分层方式将不同的 SF-GelMA 生物墨水加载到注射器中。
  2. 将注射器放入冰水浴 (0°C) 5 分钟,使底层生物墨水转化为凝胶状态。
  3. 在底层上方装载0.4 mL的细胞载重SF-0.75-GelMA生物油墨。
  4. 将装有两层生物墨水的注射器放入冰水浴 (0 °C) 中 5 分钟,使两层生物墨水转化为凝胶状态。
  5. 使用剩余的 3 种生物油墨(SF-1-GelMA、SF-1.25-GelMA、SF-1.5-GelMA)将装载和冷却步骤再循环 3 次,以获得不同层中不同浓度的 SF 的多层生物油墨系统。用于装载所有生物油墨的体积应为 0.4 mL。
  6. 在生物打印之前,将注射器放入培养箱(37°C)30分钟,重新加热多层生物墨水。
  7. 使用 2 mL 注射器作为带有 27 G 打印喷嘴的生物墨水储液罐。将流量设定为 50 μL/min,将喷嘴的移动速度设置为 2 mm/s,将喷嘴的高度设置为 1 mm。在室温(约 20 °C)下执行生物打印程序。
    1. 使用定制的生物打印机,根据我们先前研究11、12,12的参数,以挤出方式打印组织结构。
  8. 使用紫外线(365 nm,800 mW)40 s 交叉链接生物打印组织结构。
  9. 培养DMEM(Dulbecco的改良鹰介质)中的交联组织结构,在培养箱中含有10%的FBS和1%青霉素链霉素(37°C,含5%CO2)。在前2天和之后每2-3天每8小时更换一次介质。

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Representative Results

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图1显示了细胞载生物墨水制备的原理图。制备不同的生物油墨后,进行了装载、再加热和生物打印(图2)。为了评估生物墨水储层中封装细胞的分布,使用三个不同的载细胞生物油墨在三个96孔板中进行了生物打印过程(图3A)。两个对照组(原始凝胶和SF-1-GelMA生物油墨)和实验组(SF-M-层-凝胶瘤生物油墨)用于研究封装细胞的分散性(图3B)。在三个96孔板的每个孔中挤出了60微升的含细胞生物墨水。三种生物油墨的总体积为2mL,因此生物印刷周期超过30分钟。在印刷前的额外孵化(30分钟),总工作周期超过1小时,被认为是生物印刷大组织和器官的合适制造工期。计算了三个板块中的目标孔中的细胞数,如图3A所示。不同井中的细胞计数可以反映封装细胞在不同组之间的分散性。结果表明,随着生物印刷过程的进行,目标井中细胞的密度在所有组中均有所下降。在SF-0-GelMA组中,大约70%的细胞在总手术后沉积在底层。在SF-1-GelMA组中,大约40%的细胞沉积在底层,大约5%的细胞沉积在顶层。在SF-M-分层-GelMA组中,封装细胞的沉积比对照组(图3C和3D)的沉积更均匀。

Figure 1
图1:SF-GelMA生物油墨制备的原理图。SF-GelMA 通过混合丝纤维(SF) 和 GelMA/光子炎(PI)复合物,然后进行超声波处理 10-20 分钟。然后,SF-GelMA混合物中的目标细胞被悬浮,以制备细胞载载的SF-GelMA生物油墨。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图 2:装载、再加热和生物打印过程。细胞载入SF-GelMA,作为生物油墨(aq),被加载到生物墨水储液罐中,并从冷却过程中转化为凝胶状态。使用不同浓度的SF(0.5、0.75、1.0、1.25和1.5%)的生物油墨(aq)重复5次装载和冷却程序获取 SF-多层-凝胶MA(SF-M-分层-凝胶MA)。将生物油墨放入培养箱30分钟,使凝胶状态SF-M-分层-凝胶MA重新加热。凝胶状态生物油墨在孵育后变成液体状态。然后,制备的生物墨水用于使用2 mL注射器作为带 27 G 打印喷嘴的生物墨水储液罐进行打印。使用紫外光,印刷的组织结构是交叉链接的。Aq 表示水溶液。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3:生物印刷程序使用了三种不同的细胞载生物油墨。(A),每分钟将60微升生物油墨挤出相应的96孔板,在96孔板中完成生物印刷程序需要30多分钟。(B),使用三种不同类型的生物油墨来研究生物印刷过程中封装细胞的分散性:两个对照组(原始凝胶和SF-1-GelMA生物油墨)和实验组(SF-M-层-凝胶瘤生物油墨)。(C-D),在三个板块中检测到1号、5号、10号、15号、20号、25号井和30口的细胞密度有染色,显示三种生物油墨中封装细胞的分布,SF-M-分层-GelMA组中封装细胞的沉积更加均匀。请点击此处查看此图形的较大版本。

生物墨水 材料(毫升)
格尔玛 S f Pbs
SF-0.5-GelMA 0.5 0.1 0.4
SF-0.75-GelMA 0.5 0.15 0.35
SF-1.0-GelMA 0.5 0.2 0.3
SF-1.25-GelMA 0.5 0.25 0.25
SF-1.5-GelMA 0.5 0.3 0.2

表1:SF-GelMA生物油墨的制备

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Discussion

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多层系统的稳定性是成功执行此协议的关键点。我们根据瑙曼的研究13,从理论上计算出了凝胶MA溶液中SF分子的扩散。研究发现,溶液中蛋白质的扩散与其分子量有关。牛血清白蛋白(BSA)的平均分子量(MW)为66.5千达,其扩散系数为64-72μm2/s。2纤维蛋白原平均MW为339.7千达,其扩散系数为23-34μm2 /s。2在我们的研究中,SF分子的平均MW约为100 kDa。根据Nauman的研究结果,在25°C下,单个SF分子的扩散系数在23-72μm2/s之间。根据斯托克斯-爱因斯坦方程,扩散系数的定义如下:

Equation 1

其中D为扩散系数,K为稠度,T为绝对温度,α为溶液的粘度,d为直径。可以得出结论,水中SF分子在凝胶中扩散系数的差异是由这两种周围溶液的粘度差异决定的。此外,扩散半径的计算方式如下:

Equation 2

其中R为扩散半径,D为扩散系数,T为扩散时间。纯水在8.9 x10-4 Pa_s处呈粘度,在零剪切速率下GelMA的粘度高于1000帕。因此,在GelMA溶液中,单个SF分子在25°C处的扩散半径小于0.66-1.18μm/小时。这表明SF很难在SF-M层-GelMA系统中的相邻层扩散,这证明了多层系统的稳定性。

当用液体状生物油墨进行生物印刷时,封装细胞的重力驱动沉降是不可避免的。在我们的研究中,我们开发了一种新型的低粘度凝胶瘤生物油墨与循环加载冷却,通过创造界面保留来减缓细胞的沉淀。多层界面保留应能抵消封装细胞的重力作用,从而防止封装的细胞沉积在生物油墨储液罐中的相邻层上。由于不同层中不同生物油墨的换行性能不同,各相邻层之间的生物油墨储液罐中纵向呈现界面保留。这些界面张力开始发挥作用,一旦封装的细胞沉积到界面。结果,重力拉力被偏移,沉降停止。虽然该协议是新颖的,但应研究更多应用,在其它液体样生物油墨系统中应用该协议,以促进和优化。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者承认中国国家自然科学基金(81771971、81970442、81703470和81570422)、中国国家重点研发项目(2018YFC1005002)、上海市科委(17JC1400200)、上海市科技重大项目(授予号) 2017SHZDZX01),上海市教委(创新计划2017-01-07-00-07-E00027)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) TCI M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Gibco 15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 10569044
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10091
Gelatin Sigma-Aldrich V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics Gibco 15140163
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010049
Silk fibroin Advanced BioMatrix 5154

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References

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Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).More

Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).

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