Summary
Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om de sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen.
Abstract
Tijdens het op extrusie gebaseerde driedimensionale bioprintingproces kunnen vloeibare bioinks met een lage viscositeit cellen beschermen tegen membraanschade veroorzaakt door schuifstress en de overleving van de ingekapselde cellen verbeteren. Snelle celsedmentatie op basis van zwaartekracht in het reservoir kan echter leiden tot een inhomogene celverdeling in bioprintstructuren en dus de toepassing van vloeibare bioinks belemmeren. Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (bijvoorbeeld gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen. Meerdere vloeibare interfaces werden gemanipuleerd in de meerlaagse bioink om interfaciale retentie te bieden. Bijgevolg werd de celsedmentatieactie die over aangrenzende lagen in het meerlaagse systeem ging, vertraagd in het bioinkreservoir. Er werd vastgesteld dat de interfaciale retentie veel hoger was dan de sedimentale aantrekkingskracht van cellen, wat een cruciale rol aantoont van de interfaciale retentie bij het voorkomen van celsedimentatie en het bevorderen van een meer homogene dispersie van cellen in het meerlaagse bioink.
Introduction
Driedimensionale (3D) bioprinting is een veelbelovende methode voor de vervaardiging van complexe architectonische en functionele replica's van inheemse weefsels in biofabricage en regeneratieve geneeskunde1,2,3. De gemeenschappelijke strategieën van bioprinting, met inbegrip van inkjet, extrusie, en stereolithografie afdrukken, hebben voors en tegens vanuit verschillende perspectieven4. Onder deze technieken wordt de extrusieprocedure het meest gebruikt vanwege de kosteneffectiviteit. Bioink speelt een sleutelrol in de processtabiliteit van extrusie bioprinting. De ideale cel-beladen bioink moet niet alleen biocompatibel zijn, maar ook geschikt zijn voor mechanische eigenschappen5. Bioinks met een lage viscositeit worden meestal gepresenteerd als een vloeibare toestand. Deze bioinks kunnen gemakkelijk en snel worden afgezet en voorkomen dat celmembraan schade veroorzaakt door hoge schuifspanning tijdens extrusie. In complexe gevallen die lange termijn afdrukperioden vereisen, leidt een lage viscositeit echter vaak tot de onvermijdelijke sedimentatie van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir, wat meestal wordt aangedreven door de zwaartekracht en leidt tot een inhomogene celdispersie in het bioink6,7. Bijgevolg belemmert een bioink met inhomogene celdisperding de in vitro bioprinting van een functionele weefselconstructie.
Verschillende recente studies gericht op bioinks hebben gemeld de bevordering van homogene dispersiteit van ingekapselde cellen. Een gemodificeerde alginaat bioink op basis van dual-stage crosslinking werd gebruikt voor extrusie bioprinting8. Een alginaat polymeer werd gewijzigd met peptiden en eiwitten in deze studie. Cellen presenteerden een meer homogene verdeling in deze gemodificeerde alginaat dan in de veelgebruikte alginaat als gevolg van de gehechtheid sites die door de peptiden en de eiwitten. Als alternatief zijn gemengde bioinks gebruikt om de sedimentatie van cellen in bioink op te lossen. Een blended bioink met polyethyleenglycol (PEG) en gelatine of gelatine methacryloyl (GelMA) met verbeterde mechanische robuustheid werd gebruikt in een andere studie9. De ingekapselde cellen vertoonden een homogene verdeling, vooral omdat de viscositeit van het gemengde bioink werd verbeterd. In het algemeen zijn er verschillende factoren die van invloed zijn op de verspreiding van de ingekapselde cellen in het bioink, zoals de viscositeit van het bioink, de zwaartekracht van de cellen, de dichtheid van de cellen en de duur van de werkperiode. Onder deze factoren speelt de zwaartekracht van cellen een cruciale rol bij het bevorderen van sedimentatie. Het drijfvermogen en de wrijving die door de viskeuze bioink zijn onderzocht als de belangrijkste krachten tegen de zwaartekracht tot op heden10.
Hierin ontwikkelden we een nieuwe strategie om homogene dispersie van de ingekapselde cellen in bioink te bevorderen door meerdere vloeibare interfaces in het bioinkreservoir te manipuleren. Deze vloeibare interfaces die door de meerlaagse modificatie van bioink worden gecreëerd, kunnen niet alleen interfaciale retentie bieden, wat de sedimentatie van cellen vertraagt, maar ook een geschikt biocompatibiliteits- en rheologisch gedrag van het bioink behoudt. In de praktijk hebben we waterige GelMA-oplossing (5%, w/v) met zijdefibroine (SF) op een meerlaagse manier aangepast om in de lengterichting vier interfaces te produceren, waardoor interfaciale spanningen in het gemengde bioink worden ondersteund. Als gevolg hiervan werd de zwaartekrachtbelasting op de cellen gecompenseerd door de door de mens gemaakte interfaciale spanning, en een bijna homogene dispersie van de ingekapselde cellen in de bioink werd verkregen als gevolg van minder sedimentatie over de aangrenzende lagen cellen. Geen soortgelijk protocol om de sedimentatie van ingekapselde cellen te vertragen door het manipuleren van interfaciale retentie in vloeibare bioinks is gemeld tot op heden. We presenteren ons protocol hier om een nieuwe manier aan te tonen om celsedmentatie in bioprinting op te lossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van met cellen beladen SF-GelMA
- Steriliseer alle materialen met behulp van 0,22 μm spuitfilterunits. Voer alle stappen uit in een biologische veiligheidskast.
- Verwarm 1x PBS tot 50 °C en los gelatine op in de verwarmde 1x PBS met roeren. De uiteindelijke concentratie gelatine in PBS moet 10% (w/v) zijn.
- Voeg methacrylic anhydride toe aan de gelatineoplossing (gewichtsverhouding van methacrylic anhydride tot gelatine van 0,6 tot 1) langzaam met roeren en meng het complex gedurende ten minste 1 h (50 °C). Bereid doorgaans 200 mL van 10% gelatineoplossing voor met 12 g methacrylic anhydride; het volume is afhankelijk van de behoeften van de studie.
- Breng de gemengde oplossing met gelatine en methacrylic anhydride over in een steriele buis van 50 mL.
- Centrifugeren de gemengde oplossing op 3.500 x g. Het duurt meestal 3-5 min om twee lagen te verkrijgen. Verzamel de bovenste laag (GelMA) en gooi de onderste laag (niet-gereageerde methacrylic anhydride) weg.
- Verdun de in stap 1,5 verkregen oplossing met twee volumes gedeïnoneerd water (40−50 °C).
- Dialyze de oplossing verkregen in stap 1.6 met een 12-14 kDa moleculair gewicht cutoff dialyse membraan tegen gedeïemiseerd water gedurende 5−7 dagen (40−50 °C). Verander het water twee keer per dag.
- Verzamel en bevries de GelMA-oplossing 's nachts bij −80 °C.
- Lyophilize de GelMA-oplossing gedurende 3−5 dagen in een vriesdroger met de temperatuur ingesteld op -45 °C en de druk ingesteld op 0,2 mbar.
- Los de gelyofiliede GelMA op (mate van substitutie van ongeveer 75%) in 1x PBS met 10% FBS (foetaal runderserum, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethaan-sulfonic acid) en fotoinitiator (0,5%, w/v) om het GelMA bioinkpreparaat te verkrijgen.
OPMERKING: De mate van substitutie van GelMA kan worden berekend door een ninhydrinetest3. - Meng de GelMA-oplossing (10%, w/v) met verschillende volumes initiële SF-oplossing (5%, w/v) en verschillende volumes van 1x PBS om SF-GelMA-bioinks met verschillende concentraties SF te verkrijgen. Het aandeel per 1 mL gelma- en SF-oplossing in de verschillende bioinks wordt gepresenteerd in tabel 1.
OPMERKING: Alle bioinks moeten een uiteindelijke concentratie van 5% (w/v) GelMA bevatten, maar de concentratie van SF varieert: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 en 1,5% (w/v) in de verschillende SF-GelMA-bioinks. Gebruik SF-M-Layered-GelMA om de GelMA bioink gewijzigd met SF op een laag-voor-laag manier te noemen. Gebruik SF-X-GelMA om die GelMA die met SF wordt gewijzigd op een homogene manier te noemen (b.v., werd GelMA met wijziging van 1% SF genoemd SF-1-GelMA). - Sonicate alle bioinks voor 10-20 min.
- Kweek NIH3T3-cellen met DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine in een incubator (37 °C met 5% CO2). Doorsnee de cellen met een verhouding van 1:3 wanneer de dichtheid 80% bereikt.
- Centrifugeer de suspensie van NIH3T3 cellen bij 1500 tpm gedurende 5 min. Verwijder de supernatant met zuigkracht en zet de celpellet opnieuw op met verse bioinkoplossing in een steriele buis van 15 mL.
OPMERKING: De concentratie van de ingekapselde cellen in het bioink moet 1 x 106 cellen/mL zijn en de concentratie moet worden berekend met een cytometer. - Gebruik 2 mL van verschillende SF-GelMA bioinks om de celpellets op te schorten om verschillende celbeladen bioinks te verkrijgen.
2. Laden, opwarmen en bioprinten van de SF-M-Layered-GelMA
- Laad 0,4 mL met celbeladen SF-0,5-GelMA in de onderste laag van de spuit.
LET OP: Gebruik een 2 mL spuit als het bioink reservoir in deze studie. Laad verschillende SF-GelMA bioinks op een laag-voor-laag manier in de spuit. - Plaats de spuit 5 minuten in ijswaterbad (0 °C) om de onderste laag bioink te laten transformeren in een geltoestand.
- Laad 0,4 mL met celbeladen SF-0,75-GelMA bioink boven de onderste laag.
- Plaats de spuit met de twee lagen bioinks gedurende 5 minuten in een ijswaterbad (0 °C) om de twee lagen bioinks te laten transformeren in een geltoestand.
- Fiets de laad- en koelstappen nog 3 keer met de overige 3 soorten bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) om een meerlaags bioinksysteem te verkrijgen met verschillende concentraties SF in de verschillende lagen. Het volume dat wordt gebruikt voor het laden van alle bioinks moet 0,4 mL zijn.
- Verwarm het meerlaagse bioink op door de spuit 30 minuten in een couveuse (37 °C) te plaatsen voorafgaand aan bioprinting.
- Gebruik een 2 mL spuit als het bioink reservoir met een 27 G printmond. Stel de doorstromingssnelheid in op 50 μL/min, de bewegingssnelheid van het mondstuk op 2 mm/s en de hoogte van het mondstuk op 1 mm. Voer de bioprintprocedure uit bij kamertemperatuur (ongeveer 20 °C).
- Print de weefselconstructie op een extrusiemanier met behulp van een op maat gemaakte bioprinter onder de parameters die zijn aangepast aan onze vorige studies11,12.
- Gebruik ultraviolet licht (365 nm, 800 mW) voor 40 s om de bioprinted weefselconstructie te crosslinken.
- Kweek het kruisgekoppelde weefsel in DMEM (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine in een incubator (37 °C met 5% CO2). Het medium werd elke 8 uur veranderd tijdens de eerste 2 dagen en elke 2-3 dagen daarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema van de bereiding van met cellen beladen bioinks is weergegeven in figuur 1. Na de bereiding van de verschillende bioinks werden laden, opwarmen en bioprinten uitgevoerd (figuur 2). Om de verdeling van de ingekapselde cellen in het bioinkreservoir te evalueren, werd een bioprinting procedure uitgevoerd met behulp van drie verschillende celbeladen bioinks in drie 96-putplaten(figuur 3A). Twee controlegroepen (ongerepte GelMA en SF-1-GelMA bioinks) en de experimentele groep (SF-M-Layered-GelMA bioink) werden gebruikt om de verspreiding van de ingekapselde cellen te onderzoeken(figuur 3B). Zestig microliter van cel-beladen bioink werd geëxtrudeerd in elke put van de drie 96-put platen. Het totale volume van de drie soorten bioink was 2 mL, en als gevolg daarvan was de periode van bioprinting meer dan 30 min. Met de extra incubatie vóór het afdrukken (30 min) bedroeg de totale werkperiode meer dan 1 uur en werd deze beschouwd als een geschikte fabricageduur voor het bioprinten van grote weefsels en organen. Het aantal cellen in de doelputten, gelabeld in figuur 3A, in de drie platen werd geteld. De tellingen van de cellen in verschillende putten kunnen de verspreiding van de ingekapselde cellen tussen de verschillende groepen weerspiegelen. De resultaten toonden aan dat naarmate de bioprinting procedure vorderde, de dichtheid van cellen in de doelputten in alle groepen afnam. In de SF-0-GelMA-groep werd na de totale procedure ongeveer 70% van de cellen in de onderste laag gedeponeerd. In de SF-1-GelMA-groep werd ongeveer 40% van de cellen in de onderste laag afgezet en ongeveer 5% van de cellen in de bovenste laag gedeponeerd. In de SF-M-Layered-GelMA-groep was de depositie van ingekapselde cellen homogener dan die van de controlegroepen (figuur 3C en 3D).
Figuur 1: Schematisch van de SF-GelMA bioink preparaat. De SF-GelMA werd bereid door het mengen van de zijden fibroin (SF) en GelMA / photoinitiator (PI) complex, gevolgd door ultrasone behandeling voor 10-20 min. Vervolgens werden de doelcellen in het SF-GelMA-mengsel opgeschort om de cel beladen SF-GelMA bioink voor te bereiden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De laad-, opwarm- en bioafdrukprocedure. De cel beladen SF-GelMA, als bioink (aq), werd geladen in het bioink reservoir en omgezet in de gel staat van de koeling procedure. De laad- en koelprocedure werd 5 keer herhaald met behulp van de bioinks (aq) met verschillende concentraties SF (0,5, 0,75, 1,0, 1,25 en 1,5%) om SF-Multilayered-GelMA (SF-M-Layered-GelMA) te verkrijgen. De gelstaat SF-M-Layered-GelMA werd opgewarmd door het bioink 30 minuten in een couveuse te plaatsen. De gel staat bioink omgezet in een vloeibare toestand na incubatie. Vervolgens werd de geprepareerde bioink gebruikt voor het printen met behulp van een 2 mL spuit als het bioink reservoir met een 27 G printmond. De geprinte weefselconstructie werd gekruist met uv-licht. Aq betekent waterige oplossing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: De bioprintprocedure gebruikte drie verschillende met cellen beladen bioinks. (A), Zestig microliters van bioink werd geëxtrudeerd in de overeenkomstige 96-put plaat per minuut, en het duurde meer dan 30 minuten om de bioprinting procedure te bereiken in de 96-put plaat. (B), Drie verschillende soorten bioinks werden gebruikt om de verspreiding van de ingekapselde cellen in de bioprinting procedure te onderzoeken: twee controlegroepen (ongerepte GelMA en SF-1-GelMA bioinks) en de experimentgroep (SF-M-Layered-GelMA bioink). (C-D), Celdichtheden van de nr. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Bioinks Bioinks | Materialen (ml) | ||
| GelMA GelMA | Sf | Pbs | |
| SF-0.5-GelMA | 0.5 | 0.1 | 0.4 |
| SF-0.75-GelMA | 0.5 | 0.15 | 0.35 |
| SF-1.0-GelMA | 0.5 | 0.2 | 0.3 |
| SF-1.25-GelMA | 0.5 | 0.25 | 0.25 |
| SF-1.5-GelMA | 0.5 | 0.3 | 0.2 |
Tabel 1: Bereiding van SF-GelMA bioinks
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De stabiliteit van het meerlaagse systeem is een belangrijk punt om dit protocol succesvol uit te voeren. We hebben theoretisch de verspreiding van SF-moleculen in de GelMA-oplossing berekend op basis van Naumans studie13. Men vond dat de verspreiding van proteïnen in oplossing met hun moleculair gewicht verwant was. Het gemiddelde molecuulgewicht (MW) van runderserum albumine (BSA) is 66,5 kDa en de diffusiecoëfficiënt is 64-72 μm2/s. De gemiddelde MW van fibrinogen is 339,7 kDa, en de diffusiecoëfficiënt is 23-34 μm2/s. De gemiddelde MW van SF moleculen in onze studie is ongeveer 100 kDa. Op basis van de resultaten van Nauman's studie ligt de diffusiecoëfficiënt van een enkel SF-molecuul tussen 23-72 μm2/s in water bij 25 °C. Volgens de Stokes-Einstein vergelijking, de diffusiecoëfficiënt wordt gedefinieerd als volgt:
waar D is de diffusiecoëfficiënt, K is de consistentie, T is de absolute temperatuur, η is de viscositeit van de oplossing, en d is de diameter. Geconcludeerd kan worden dat het verschil in diffusiecoëfficiënt van SF-moleculen in water en in GelMA-oplossing wordt bepaald door het verschil in viscositeit van deze twee omringende oplossingen. Bovendien kan de verspreidingsstraal als volgt worden berekend:
wanneer R de diffusiestraal is, is D de diffusiecoëfficiënt en is T de diffusietijd. Zuiver water geeft een viscositeit op 8,9 x 10-4 Pa·s, en de viscositeit van GelMA bij nulschuifsnelheid in onze studie was hoger dan 1000 Pa·s. Vandaar dat de diffusieradius van een enkel SF-molecuul bij 25 °C minder dan 0,66-1,18 μm/uur in de GelMA-oplossing is. Dit geeft aan dat SF nauwelijks kan verspreiden over de aangrenzende lagen in het SF-M-Layered-GelMA-systeem, wat de stabiliteit van het meerlaagse systeem aantoont.
De zwaartekracht-gedreven sedimentatie van de ingekapselde cellen is onvermijdelijk bij het bioprinten met vloeibare bioinks. In onze studie ontwikkelden we een nieuwe wijziging van lage viscositeit GelMA bioink met cyclische lading-koeling om de sedimentatie van cellen te vertragen door het creëren van interfaciale retentie. De meerlaagse interfaciale retentie wordt verondersteld om de werking van de zwaartekracht van de ingekapselde cellen te compenseren en bijgevolg de sedimentatie van de ingekapselde cellen over de aangrenzende lagen in het bioinkreservoir te voorkomen. De interfaciale retentie werd in de lengterichting gepresenteerd in het bioinkreservoir tussen elke aangrenzende laag vanwege het verschil tussen het rheologisch gedrag van verschillende bioinks geladen in verschillende lagen. Deze interfaciale spanningen begonnen te werken zodra de ingekapselde cellen gesedimenteerd aan de interface. Als gevolg hiervan werd de zwaartekracht te compenseren, en sedimentatie werd gestopt. Hoewel dit protocol nieuw is, moeten meer toepassingen die dit protocol gebruiken in andere vloeistofachtige bioinksystemen worden bestudeerd voor promotie en optimalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 en 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant No. 2017SHZDZX01) en Shanghai Municipal Education Commission (Innovation Program 2017-01-07-00-07-E00027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
