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Bioengineering

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

doi: 10.3791/60920 Published: May 2, 2020

Summary

여기서, 우리는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위하여 액체 같이 bioinks (낮은 점도를 가진 젤라틴 methacryloyl)를 위한 새로운 다층 수정 전략을 개발했습니다.

Abstract

압출 기반 의 3 차원 바이오 프린팅 공정 동안 점도가 낮은 액체 와 같은 바이오잉크는 전단 응력에 의해 유도 된 막 손상으로부터 세포를 보호하고 캡슐화된 세포의 생존을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 저수지의 급속한 중력 구동 세포 침전은 생체 인쇄 구조물에 있는 불균일한 세포 분포로 이끌어 내고 그러므로 액체 같이 bioinks의 적용을 방해할 수 있었습니다. 여기서는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위해 액체형 바이오잉크(예: 점도가 낮은 젤라틴 메타크라이로일)에 대한 새로운 다층 변형 전략을 개발했습니다. 다층 바이오잉크에서 여러 개의 액체 인터페이스를 조작하여 얼굴 간 유지를 제공하였다. 따라서 다층 시스템에서 인접한 층을 가로지르는 세포 침전 작용은 바이오크 저장소에서 지연되었다. 안면 유지가 세포의 퇴적물 당김보다 훨씬 높았으며, 세포 침전을 방지하고 다층 바이오잉크에서 세포의 보다 균일한 분산을 촉진하는 데 있어 면면 간 보존의 중요한 역할을 입증한 것으로 나타났습니다.

Introduction

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3차원(3D) 바이오프린팅은 생물제조 및 재생의학1,,2,,3에서토착 조직의 복잡한 건축 및 기능적 복제본을 제조하는 유망한 방법이었다. 잉크젯, 압출 및 스테레오그래피 인쇄를 포함한 바이오 프린팅의 일반적인 전략에는 서로 다른 관점에서 장단점이있습니다 4. 이러한 기술 중, 압출 절차는 비용 효율성으로 인해 가장 일반적으로 사용됩니다. 바이오잉크는 압출 바이오프린팅의 공정 안정성에 중요한 역할을 합니다. 이상적인 세포-감이 있는 바이오크는 생체 적합성뿐만 아니라 기계적 특성5에도적합해야 한다. 점도가 낮은 바이오잉크는 전형적으로 액체와 같은 상태로 제시됩니다. 이러한 바이오 잉크는 쉽고 빠르게 증착될 수 있으며 압출 시 높은 전단 응력으로 인한 세포막 손상을 피할 수 있습니다. 그러나, 장기간 인쇄 기간을 요구하는 복잡한 경우에는 점도가 낮은 경우가 종종 생체 잉크 저장소에서 캡슐화 된 세포의 피할 수없는 침전을 초래하며, 이는 일반적으로 중력에 의해 구동되며 바이오 잉크6,,7에서불균일 한 세포 분산으로 이어집니다. 따라서, 불균일한 세포 분산성을 가진 바이오크는 기능성 조직 구조의 체외 생체 인쇄를 방해한다.

바이오 잉크에 초점을 맞춘 몇 가지 최근 연구는 캡슐화 된 세포의 균질 분산성의 홍보를보고했다. 이중 단계 교차 연결을 기반으로 한 변형 된 알기네이트 바이오잉크는 압출 바이오 프린팅8에사용되었다. 알기네이트 폴리머는 이 연구에서 펩티드와 단백질로 변형되었다. 세포는 펩티드와 단백질에 의해 제공되는 부착 부위로 인해 일반적으로 사용되는 알기네이트보다 이 수정된 알기네이트에서 보다 균일한 분포를 제시했다. 대안적으로, 혼합된 바이오잉크는 바이오잉크내세포의 퇴적물을 해결하기 위해 활용되고 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 젤라틴 또는 젤라틴 메타크라릴(GelMA)을 함유한 블렌드 바이오잉크가 기계적 견고성을 향상시키는 또 다른 연구9에서사용되었다. 캡슐화된 세포는 혼합된 바이오잉크의 점도가 향상되었기 때문에 주로 균일분포를 제시했다. 일반적으로 생체 잉크의 점도, 세포의 중력, 세포의 밀도 및 작업 기간의 지속 기간과 같은 생체 잉크내캡슐화된 세포의 분산성에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 있다. 이러한 요인 중, 세포의 중력퇴적 완화를 촉진에 중요 한 역할을. 점성 바이오잉크가 제공하는 부력과 마찰은 현재까지 중력에 대한 주요 세력으로 조사되었다10.

본 명세서에서는 바이오잉크 저장소에서 여러 액체 인터페이스를 조작하여 생체 잉크내캡슐화된 세포의 균일한 분산성을 촉진하는 새로운 전략을 개발했습니다. 바이오잉크의 다층 변형에 의해 생성된 이러한 액체 인터페이스는 세포의 침전을 지연시키는 얼굴 간 보존을 제공할 뿐만 아니라 생체 잉크의 적절한 생체 적합성 및 유변학적 거동을 유지할 수 있습니다. 실제로, 우리는 실크 섬유신 (SF)으로 수성 GelMA 용액 (5%, w /v)을 다층 방식으로 수정하여 4 개의 인터페이스를 세로로 생성하여 혼합 된 바이오 잉크의 얼굴 간 장력을 제공합니다. 그 결과, 세포상에 적재된 중력적 적재는 인공면형 장력에 의해 상쇄되었고, 바이오잉크내의 캡슐화된 세포의 거의 균일한 분산은 인접한 세포층을 가로지르는 적은 퇴적물으로 인해 얻어졌다. 액체 바이오 잉크의 면면 보존을 조작하여 캡슐화된 세포의 침전을 늦추는 유사한 프로토콜은 현재까지 보고되지 않았다. 우리는 생물 인쇄에서 세포 퇴적물을 해결하는 새로운 방법을 보여주기 위해 여기에 우리의 프로토콜을 제시합니다.

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Protocol

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1. 세포가 함유된 SF-GelMA 준비

  1. 0.22 μm 주사기 필터 장치를 사용하여 모든 재료를 살균합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 모든 단계를 수행합니다.
  2. 1x PBS를 50°C로 따뜻하게 하고, 가열된 1x PBS에서 교반을 통해 젤라틴을 용해시다. PBS에서 젤라틴의 최종 농도는 10 %(w / v)여야합니다.
  3. 젤라틴 용액에 메타크릴 무수화물을 넣고(0.6 대 1의 젤라틴에 메타크릴 무수화물의 중량 비)를 천천히 교반하고, 적어도 1h(50°C)에 대한 복합체를 혼합한다. 전형적으로, 메타크릴 무수화물 12g으로 10% 젤라틴 용액의 200mL를 준비; 볼륨은 연구의 요구에 따라 달라집니다.
  4. 젤라틴 및 메타크릴 무수화물을 포함하는 혼합 용액을 50mL 멸균 튜브로 이송합니다.
  5. 3,500 x g에서혼합 용액을 원심 분리합니다. 일반적으로 두 개의 레이어를 얻기 위해 3-5 분이 걸립니다. 상층(GelMA)을 수집하고 하단 레이어(반응되지 않은 메타크릴 무수화물)를 폐기합니다.
  6. 1.5단계에서 얻은 상부층 용액을 2부량의 탈온화된 물(40-50°C)으로 희석시켰다.
  7. 5-7일 동안 염분수(40-50°C)에 대해 12-14kDa 분자량 차단 투석막으로 1.6단계에서 얻은 용액을 투석한다. 매일 두 번 물을 변경합니다.
  8. 수집 및 하룻밤 -80 ° C에서 GelMA 용액을 동결.
  9. -45°C로 설정된 온도와 0.2mbar로 설정된 압력으로 동결 건조기에서 3-5일 동안 GelMA 용액을 lyophilize합니다.
  10. 용이성 GelMA (약 75%의 대체 정도) 1x PBS에서 10% FBS(태아소 혈청, v/v), 25m HEPES(N-2-하이드록소예틸파이프라진-N-에탄-설포닉산), 광신염기(0.5%, w/v)를 함유하여 GelMA 바이오잉크 제제를 획득하였다.
    참고: GelMA의 대체 정도는 닌히드린 분석3에의해 계산될 수 있다.
  11. GelMA 용액(10%, w/v)을 초기 SF 솔루션(5%, w/v) 및 1x PBS의 다양한 부피와 혼합하여 SF의 다양한 농도를 가진 SF-GelMA 바이오잉크를 얻습니다. 다른 바이오잉크에서 GelMA 및 SF 용액의 1mL당 비율은 표 1에제시된다.
    참고: 모든 바이오잉크는 5%(w/v) GelMA의 최종 농도를 포함해야 하지만, SF의 농도는 서로 다른 SF-GelMA 바이오잉크에서 0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5%(w/v)입니다. SF-M-계층-GelMA를 사용하여 SF로 변형된 GelMA 바이오잉크를 레이어별로 용어로 지칭한다. SF-X-GelMA를 사용하여 동질적인 방식으로 SF로 변형된 GelMA를 용어로 사용합니다(예를 들어, 1% SF를 수정한 GelMA는 SF-1-GelMA라고 불려졌다).
  12. 모든 바이오 잉크를 10-20분 동안 초음파 처리합니다.
  13. DMEM을 사용하여 NIH3T3 세포를 성장 (덜벡코의 수정 독수리 매체) 포함 10% FBS 와 1% 페니실린 -연쇄 상색 - 5 % CO2와37 ° C). 밀도가 80%에 도달하면 세포를 1:3의 비율로 통과시합니다.
  14. 원심분리기 는 1500 rpm에서 NIH3T3 세포의 현탁액을 5분 동안 제거합니다.
    참고: 바이오잉크내의 캡슐화된 세포의 농도는 1 x 106 세포/mL이어야 하며, 농도는 사이토미터로 계산되어야 한다.
  15. 다양한 세포-감방 바이오잉크를 얻기 위해 세포 펠릿을 중단하기 위해 2mL의 다른 SF-GelMA 바이오잉크를 사용한다.

2. SF-M 계층-GelMA의 적재, 재가열 및 바이오 프린팅

  1. 주사기의 하단 층에 셀 라덴 SF-0.5-GelMA의 0.4 mL를 적재한다.
    참고: 이 연구에서 2mL 주사기를 바이오잉크 저장소로 사용합니다. 상이한 SF-GelMA 바이오잉크를 층별로 주사기에 적재한다.
  2. 주사기를 얼음 수조(0°C)에 5분 간 배치하여 바닥층 바이오잉크가 젤 상태로 변하게 됩니다.
  3. 하중 0.4 mL의 세포 라덴 SF-0.75-GelMA 바이오잉크를 바닥 층 위에 한다.
  4. 2층의 바이오잉크를 얼음수조(0°C)에 5분 간 배치하여 두 층의 바이오잉크가 젤 상태로 변하게 한다.
  5. 다른 층에서 SF의 다른 농도를 가진 다층 바이오 잉크 시스템을 얻기 위해 나머지 3종의 바이오잉크(SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA)를 사용하여 로딩 및 냉각 단계를 3회 더 순환한다. 모든 바이오 잉크의 적재에 사용되는 부피는 0.4 mL여야 합니다.
  6. 바이오프린팅 전에 30분 동안 인큐베이터(37°C)에 주사기를 배치하여 다층 바이오잉크를 재가열한다.
  7. 2mL 주사기를 27G 프린팅 노즐이 있는 바이오크 저수지로 사용하십시오. 50 μL/min에서 유동 속도를 설정하고 노즐의 이동 속도는 2mm/s로 설정하고 노즐의 높이를 1mm에서 수행합니다.
    1. 조직 구조를 이전 연구에서 적응한 매개변수(11,,12)에서맞춤형 바이오 프린터를 사용하여 압출 방식으로 인쇄한다.
  8. 40s에 자외선(365nm, 800mW)을 사용하여 생체 인쇄 조직 구조를 교차연결합니다.
  9. 배양DMEM(덜벡코의 수정이글 배지)에서 교차연결 조직 구조는 인큐베이터(37°C 와 5%CO2)에서10%의 FBS 및 1% 페니실린-연쇄절제술을 함유한다. 배지는 처음 2 일 동안 8 h마다 변경되었고 그 후 2-3 일마다 변경되었습니다.

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Representative Results

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세포가 함유된 바이오잉크의 제조의 회로도가 도 1에도시된다. 상이한 바이오잉크의 제조 후, 적재, 재가열 및 바이오프린팅이 수행되었다(그림2). 바이오잉크 저장소내 캡슐화된 세포의 분포를 평가하기 위해, 3개의 96웰플레이트(그림 3A)에서3개의 다른 세포 라덴 바이오잉크를 사용하여 생체 인쇄 절차를 수행하였다. 2개의 대조군(자연 그대로겔마 및 SF-1-GelMA 바이오잉크) 및 실험군(SF-M-계층화-GelMA bioink)은 캡슐화된 세포의 분산을 조사하기 위해사용되었다(도 3B). 세포가 함유된 바이오잉크의 60마이크로리터는 3개의 96웰 플레이트의 모든 우물에서 압출되었다. 3종의 바이오잉크의 총 부피는 2mL였고, 그 결과 바이오프린팅 기간은 30분 이상이었다. 인쇄 전(30분) 이전의 추가 인큐베이션을 통해 총 작업 기간은 1시간 이상이었고 대형 조직 및 장기를 바이오프린팅에 적합한 제조 기간으로 간주했습니다. 도 3A에표지된 표적 우물의 셀 수가 세 개의 플레이트에서 계산되었다. 다른 우물에서 세포의 수는 다른 그룹 중 캡슐화된 세포의 분산성을 반영할 수 있었다. 결과는 바이오 프린팅 절차가 진행됨에 따라, 대상 우물에 있는 세포의 밀도는 모든 단에서 감소한다는 것을 보여주었습니다. SF-0-GelMA 그룹에서, 세포의 약 70%가 총 시술 후 바닥 층으로 증착되었다. SF-1-GelMA 그룹에서, 세포의 약 40%가 바닥 층으로 증착되었고, 세포의 약 5%가 상부 층에 증착되었다. SF-M-계층-GelMA 군에서 캡슐화된 세포의 증착은 대조군(도 3C 및 3D)보다더 균일하였다.Figure 3

Figure 1
그림 1: SF-GelMA 바이오잉크 제제의 회로도. SF-GelMA는 실크 섬유진(SF)과 GelMA/photoinitiator(PI) 복합체를 혼합하여 10-20분 동안 초음파 처리를 통해 제조하였다. 이어서, SF-GelMA 혼합물내의 표적 세포는 세포 라덴 SF-GelMA 바이오잉크를 준비하기 위해 중단되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 적재, 재가열 및 바이오 프린팅 절차입니다. 바이오잉크(aq)로서 세포 라덴 SF-GelMA는 바이오잉크 저장소에 적재되어 냉각 절차로부터 겔 상태로 변형되었다. 하중 및 냉각 절차는 SF(0.5, 0.75, 1.0, 1.25 및 1.5%)의 농도가 다른 바이오잉크(aq)를 사용하여 5회 반복되었다. SF-다층-GelMA(SF-M-계층-겔마)를 획득한다. 젤 상태 SF-M-층-GelMA는 30 분 동안 인큐베이터에 바이오잉크를 배치하여 재가열되었다. 젤 상태 바이오크는 인큐베이션 후 액체 상태로 변했습니다. 이어서, 준비된 바이오크는 27G 프린팅 노즐을 가진 바이오잉크 저수지로서 2mL 주사기를 사용하여 인쇄하는 데 사용되었다. 인쇄된 조직 구조는 UV 광을 사용하여 교차 연결되었다. Aq는 수성 솔루션을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 바이오 프린팅 절차는 세 가지 다른 세포가 함유된 바이오 잉크를 사용했습니다. (A), 바이오잉크의 60마이크로리터는 분당 96웰 플레이트로 압출되었고, 96웰 플레이트에서 생체 인쇄 절차를 달성하는 데 30분 이상이 걸렸다. (B), 바이오잉크의 세 가지 다른 종류는 바이오 프린팅 절차에서 캡슐화된 세포의 분산성을 조사하기 위해 사용되었다: 2개의 대조군(자연 그대로의 GelMA 및 SF-1-GelMA bioinks) 및 실험 군(SF-M-Layered-GelMA bioinks). (C-D), 3개의 플레이트에서 제1, 5, 10, 15, 20, 25 및 30개의 우물의 세포 밀도가 스테인링으로 검출되었고, 3개의 바이오잉크에서 캡슐화된 세포의 분포를 보여주고, SF-M 층-GelMA 군내 캡슐화된 세포의 증착은 더욱 호모진하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이오 잉크 재료 (ml)
겔마 (주) Sf Pbs
SF-0.5-겔마 0.5 0.1 0.4
SF-0.75-겔마 0.5 0.15 0.35
SF-1.0-겔마 0.5 0.2 0.3
SF-1.25-겔마 0.5 0.25 0.25
SF-1.5-겔마 0.5 0.3 0.2

표 1: SF-GelMA 바이오잉크 제조

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Discussion

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다계층 시스템의 안정성은 이 프로토콜을 성공적으로 수행하는 핵심 포인트입니다. 우리는 이론적으로 나우만의 연구13에기초하여 GelMA 용액에서 SF 분자의 확산을 계산했다. 용액에 있는 단백질의 확산이 그들의 분자량과 관련되었다는 것을 것을을 발견되었습니다. 소 세럼 알부민(BSA)의 평균 분자량(MW)은 66.5kDa이며 확산 계수는 64-722μm 2/s이다. 피브리노겐의 평균 MW는 339.7 kDa이며 확산 계수는 23-34 μm2/s입니다. 우리의 연구 결과에 있는 SF 분자의 평균 MW는 대략 100 kDa입니다. Nauman의 연구 결과에 기초하여, 단일 SF 분자의 확산 계수는 25°C에서 물에서 23-72 μm2/s사이입니다. 스토크스-아인슈타인 방정식에 따르면 확산 계수는 다음과 같이 정의됩니다.

Equation 1

D가 확산 계수인 경우, K는 일관성이고, T는 절대 온도이고, 용액의 점도이며, d는 직경이다. 물과 GelMA 용액에서 SF 분자의 확산 계수의 차이는 이러한 두 주변 용액의 점도 차이에 의해 결정된다는 결론을 내릴 수 있다. 또한 확산 반지름은 다음과 같이 계산할 수 있습니다.

Equation 2

여기서 R은 확산 반경이고, D는 확산 계수이고, T는 확산 시간이다. 순수한 물은 8.9 x10-4 Pa·계에서 점도를 제시하고, 우리의 연구에서 0 전단 속도로 GelMA의 점도는 1000 Pa보다 높았으며, 따라서 25°C에서 단일 SF 분자의 확산 반경은 GelMA 용액에서 0.66-1.18 μm/시간 미만이다. 이는 SF가 다층 시스템의 안정성을 보여주는 SF-M-계층-GelMA 시스템의 인접 층 에서 거의 확산될 수 없음을 나타냅니다.

캡슐화된 세포의 중력 중심 침전은 액체와 같은 바이오 잉크로 바이오프린팅을 할 때 불가피합니다. 우리의 연구에서, 우리는 얼굴 간 보존을 생성하여 세포의 침전을 지연하기 위해 순환 적재 냉각과 낮은 점도 GelMA 바이오 잉크의 새로운 수정을 개발했다. 다층 형면 유지는 캡슐화된 세포의 중력 작용을 상쇄하고 결과적으로 바이오크 저수지의 인접 층을 가로 질러 캡슐화된 세포의 침전을 방지하도록 되어 있다. 상반면 보존은 상이한 층에 적재된 상이한 바이오잉크의 유변학적 거동 사이의 차이로 인해 각각의 인접한 층 들 사이의 바이오잉크 저장소에서 세로적으로 제시되었다. 이러한 얼굴 간 긴장은 캡슐화된 세포가 인터페이스에 침전되는 즉시 작동하기 시작했습니다. 그 결과 중력당면이 상쇄되고 퇴적이 멈췄습니다. 이 프로토콜은 참신하지만 다른 액체와 같은 바이오잉크 시스템에서이 프로토콜을 활용하는 더 많은 응용 프로그램을 홍보 및 최적화를 위해 연구해야합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 중국 국립 자연과학 재단(81771971, 81970442, 81703470 및 81570422), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2018YFC1005002), 상하이 시립기술위원회(17JC14002), 상하이시립과학위원회(17JC14000) 및 상하이시립과학위원회(17JC14002)의 보조금을 인정한다. 2017SHZDZX01) 및 상하이 시교육위원회(혁신 프로그램 2017-01-07-07-07-E00027).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) TCI M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Gibco 15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 10569044
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10091
Gelatin Sigma-Aldrich V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA) Sigma-Aldrich 276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics Gibco 15140163
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010049
Silk fibroin Advanced BioMatrix 5154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).More

Chen, N., Zhu, K., Yan, S., Li, J., Pan, T., Abudupataer, M., Alam, F., Sun, X., Wang, L., Wang, C. Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution. J. Vis. Exp. (159), e60920, doi:10.3791/60920 (2020).

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